이 프로토콜의 목표는 형광 기자의 도움으로 대식세포 및 T 세포주에서 CRISPR/Cas9 매개 노크-인 실험을 단순화하고 세포 분류에 영향을 미치는 것입니다. ROSA26 로커스는 게놈의 삽입을 위한 유전체 안전 항구 사이트로 알려져 있습니다. 26개의 궤적 또는 인간 직교 로그에 대한 마우스 세계 또는 공격 없이 관심 있는 단백질을 표현하는 것이 보통입니다.
Part 1: 디자인 및 SgRNAs의 플라스미드 건설로 로사26 로커스를 타겟팅합니다. 먼저 마우스 Rosa26 궤적으로부터 sgRNAs를 설계하고 마우스 게놈 정보학 및 앙상블 게놈 브라우저의 서열을 사용하여 마우스 Rosa26 유전자의 게놈 서열을 다운로드합니다. 온라인 웹 도구인 CRISPOR로 이동하여 Rosa26 Locus의 입력 시퀀스 100쌍을 붙여넣습니다.
그런 다음 게놈을 선택, 예를 들어, 머스 근육 마우스 참조 게놈 2011. 다음으로, PAM의 유형을 선택합니다.
제출을 클릭합니다. 높은 특이성 점수, 높은 수행 점수, 적은 오프 대상가이드를 선택합니다. 비효율적인 것으로 표시된 가이드는 피해야 합니다.
특히, 중복 시퀀스를 가진 두 개의 가이드를 선택하는 것이 바람직하며, 이는 보고된 대로 노크인 효율을 높일 수 있습니다. 따뜻한 식사 순서를 위해, 앞으로 불법 및 반전 불법 합성, 인과 요인에 복제에 대 한 준비. 발액사당 선형화된 감소를 준비하여, 닐을 얻는 것과 같이 BBS 1회 소화에 의해 리포터를 해야 하며, 최종 구조를 생성하는 선형 벡터에 대한 법적, 즉 가이드 RNA와 DSRIP 2개의 형광 리포터와 연결된 CAS 9핵을 동시에 표현한다.
2부:대상 벡터를 동종 재조합 템플릿으로 구성합니다. 관심 있는 단백질의 발현을 위해. 예를 들어, 인간은 계속되었습니다.
상용 소스 및 친화성 OST 태그 또는 다른 일반적으로 사용되는 공격으로 cDNA 서열을 합성할 수 있으며, 단백질의 정제를 위한 다른 일반적으로 사용되는 공격은 cDNA 서열에 융합될 수 있다. cDNA가 시작되기 전에 카자크 합의 서열을 포함해야 합니다. Asc1 제한 효소에 의해 소화되고, CD와 삽입을 백본에 넣는 것과 같습니다.
Vactor, 즉 pKhR26-IBFP IBP는 최종 타겟팅을 산출하여 컨테이너, 각각 5개의 프라임 및 3개의 프라임 동상무기의 KB를 농축합니다. 표현 캐스트 세트에는 VFD 리포터와 폴리 AC 펀드의 경우 Iis에 연결된 Koonin 지역을 원하는 경우 CG 프로모터인 UST 레스토랑이 포함됩니다. 마지막으로 에코R1 또는 BamH1과 같은 독특한 커터 효소를 사용하여 수평선 표적 벡터에, 소화 및 제품은 전기 기화 노트에 마이너스 20도 매장에서 정제된다.
선형 벡터 DNA의 고농도를 얻는 것이 좋습니다. 3부:대식세포와 T세포선의 전기포레이션은 게리톡 세포에 대한 분리를 따랐다. 최적의 세포 밀도는 형질 전환 시 ML당 약 0.5백만 개의 세포였다.
10개의 매크로 리틀 핵 패션 팁 포맷의 전체 전기화는 500 마이크로리터의 완전한 성장을 포함하는 24개의 웰 플레이트를 준비하고, 각 우물에 항생제가 없는 매체를 준비한다. 플레이트를 가습 37도, 5%로 미리 떼어 그 설정 인큐베이터. 제트 고양이 또는 Rosales에 대한 전기 작동 시스템 입력 전기 기화 매개 변수를 거절하십시오.
세포 DNA 혼합물 후속 을 준비하거나 수술은 닭 세포를 수집합니다. 커친 25 평방 센티미터 플라스크 15 동물에서 전송 세포. 튜브 이후, 다음 실온에서 8 분 동안 90 회 G에서 센티미터에 의해 세포를 필립, 그것을 요청, 초월제.
세척을 위해, 5ML PBS로 세포를 다시 중단한 다음 이전 단계와 동일한 조건을 사용하여 원심분리에 의해 세포 현탁액을 회전시한다. DP를 제거합니다. 그리고 DBS의 두 ML을 사용하여 셀 베개를 다시 중단합니다.
마이크로 작은 셀 서스펜션을 유지하고 0.2%의 Trepan Ballou의 동일한 부피와 혼합하여 자동 셀 코너에서 슬롯 삽입 코니 슬라이드를 계산하는 측면에서 셀 카운트 로드 샘플을 추정하고 이미지 자체를 볼 수 있습니다. 그런 다음 셀 카운트 결과를 가져옵니다. 2백만 개의 세포를 계산하면 노크 실험당 전기기화의 평판이 1.5 ML.원심분리기 2개의 펠릿 세포로 원심분리로 세포의 수를 전송한다.
시간을 절약하기 위해, 전기화 혼합물은 벨린다 쌀의 CRISPR CAS 9 벡터 2.4 마이크로그램의 2.5 마이크로그램을 추가하는 원심화 중에 제조될 수 있고, 말화 벡터, 및 재서스펜션 버팔로. 새로운 1.5 ML 원심 분리 튜브에 55 매크로 쓰레기의 총 볼륨을 부드럽게 정점과. 짧게 잘 섞어 서 있다.
사용 전에 룩소르 압력 혼합물과 실온을 그대로 둡니다. 인분 회전 후, DTB는 이 본질적으로 추가 30 초 동안 퓨즈, 준비 된 전기 화 혼합물 파이펫을 부드럽게 추가하여 가능한 한 많은 상류체를 제거합니다. 전기기는 10 마이크로 작은 핵 파면 팁을 사용하여 세포 전기 화 믹서를 요구파이펫 중요했다.
파이 페팅 중에 기포를 피하면 전자 도금 장애가 발생합니다. 시작을 누릅니다. 그 후 작업이 샘플을 잠시 동안 전송합니다.
24의 우물 판은, 총 배지가 나머지 4개의 복제된 견본에 위와 같이 동일한 전기 압력 및 절차를 능력을 발휘하고, 부드럽게 세포의 분포를 보장하기 위하여 판을 흔들어. 세포를 37도 인큐베이터에서 48~72시간 동안 배양한다. 실제로, 세포 분류 24 시간 후 형질전환에서, 우리 자신에 대한 담당자에서 분리 된 꽃집 현미경 을 사용하여 레스토랑 기자에 대한 중단 2의 표현을 검사하는 것은 전기 기공이 제대로 작동하고 있음을 나타냅니다.
부품 4:세포 선별을 통해 putative knock-in 세포를 분리합니다. 세포 선별 준비 전에, 잘 당 150 마이크로 작은 세포 유형 특정 총 배지와 96 잘 플레이트에서 배양 및 자체에 대한 잘못된 바닥 마이크로 장소를 사용하고 모든 세포가 멸균 FACS로 세포를 전송하여 튜브를 얼음에 보관하고 창문을 통해 경로에 상자를 넣는 경우, 최적의 세포 증발성 및 생존을 달성하기 위해 면역 세포 분류를 위한 85 마이크로 미터 노즐 및 낮은 유량으로 셀 선별실에 연결하여 통과 창 정점에서 샘플을 간단히 채취하고, 수집에 샘플을 로드합니다. Champer는 포드 산란 및 측면 분산에 대한 첫 번째 정의 판매 깔때기를 정렬하기위한 팩트 스케이팅을 설정한 다음 세트 토크를 얻어 서 생명 세포를 정의적 인 음수 세포를 설정합니다.
다음으로, FSC H 대 FSE를 사용하여 단일 게이팅을 사용하여 다각적인 블록을 찾습니다. 마지막으로 볼보 양성 하위 인구가 있는 경우 원하는 DSR 2및 B에 대한 게이트를 설정하여 CRISPR 벡터 및 포켓링 벡터로 성공적으로 감염된 세포를 나타냅니다. 따라서 96의 각 웰에 있는 10개의 단일 세포, 잘 플레이트는 프리웜으로 보충되고, 세포 확장을 위한 세포 배양 인큐베이터에서 96을 분류한 후 기간 모드 또는 단일 세포 모드를 사용하는 완전한 성장 배지.
부품 5:양성 노크세포의 고도의 선별은 생존후 약 2주간의 세포 팽창 후, 48웰 플레이트의 세포는 음의 대조군 세포 집단으로서 벽형 세포를 이용하여 증식세포의 작은 비율을 이용하여 BFP 또는 유동 세포의 발현을 평가하고, BFP 양성 세포의 높은 비율을 보유하여 세포로부터 게놈 DNA를 발현하도록 유지한다. BFP는 동종 무기의 각 측면에 걸쳐 프라이머와 PCR에 의해 격리 된 게놈 DNA를 전달, 즉 하나의 주요 게놈 서열에서 찾습니다, 외부 표적 벡터. 본 측에서 벡터와 대화하는 것으로, 1차로 증폭된 PCR 제품의 크기는 1.2 KV이다. 그리고 F 2와 R 2는 1.2 KB Sanger 시퀀싱 결과입니다. 따라서 PCR 제품은 로사 26 루카스에 올바른 위치를 보여주는 각 통합 접합의 시퀀스를 보여줍니다.
면역 블로팅이 단백질 레벨 6 부에서 올바른 노크의 유효성 검사를 가능하게하는 것처럼 말합니다. 예를 들어, 이전 연구에서 발표된 45개의 분자가 OSD 태그와 인터어프를 하고, 계산T 세포에 26개의 궤적이 있다는 것을 이후에 USD 전술로 표현했습니다. 나는 45 및 사건 이사를 얻거나 친화성 정화와 대량 분석의 대상이됩니다.
그(것)들은 T 세포의 상호 작용을 드러낸 proteomics 데이터. 따라서 이 제품 풀은 주어진 단백질의 기능을 해명하기 위해 새로운 인터컬레이터를 찾는 것을 크게 촉진했습니다. 이 기술적인 프리젠테이션은 로사 26 궤적에 대해 토크 벡터와 BFP를 결합하여 캐스트 라인 RFP당 과도적으로 증가된 것으로 나타났다.
우리는 유전 조작에서 수행하기 어려운 T 세포와 대식세포 모두에서 영구적 인 유전자 발현으로 두드리는 세포주를 생성했습니다. 이 방법 및 권고는 단백질의 식별, 단백질 상호 작용 연구 와 같은 면역 세포의 기계론 적 연구를 위한 대형 DNA 세그먼트의 주장에 허용되는 Chris에 적용됩니다.
