이 연구는 INSERM, 엑스 - 마르세유 대학과 CL 포레스에 의해 얻어진 HFSPO에서 경력 개발의 수상에 의해 지원되었다.

윤리 문 : 모든 동물 연구가 엑스 - 마르세유 Université, 프랑스의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다 가이드 라인 및 프로토콜에 따라 수행되었다. 8에서 여성 C57BL / 6 마​​우스 - 오래된 10 주 상업적 Décret N ° 8 87-848 년 10 월 19 일 1987 년 파리의 규칙에 따라 획득 및 처리 하였다. L.를 사용하는 모든 실험 donovani LD1S 기생충은 프랑스와 유럽 연합 (EU) 법률에서 바이오 안전성 규정에 따라 실시 하였다. L. 1. 마우스 감염 donovani Promastigote 기생충 <ol><li> L.의 유지 보수를 위해 시험 관내 배양 배지를 준비 donovani의 promastigote 기생충, LD1S (MHOM / SD / 62 / 1S-CL2D). <ol><li> M199 매체를 사용합니다. (30 분 동안 56 ℃에서 열 - 불 활성화)를 10 % 소 태아 혈청 M199 배지를 보충하는 25mM HEPES pH가 6.9, 12 mM의 NaHCO3를, 1 밀리미터 GLUtamine, RPMI 16,040 비타민 믹스, 10mM의 엽산, 100 mM의 아데노신, 7.6 mM의 헤민, 50 U / ㎖ 페니실린, 50 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신. </li></ol></li><li> 문화는 25cm 2 통풍이 플라스크에 26 ° C에서 완전한 M199 배지 10ml에 기생충을 LD1S. </li><li> 연속 차동 원심 분리 단계를 사용하여, metacyclic 형태로 충실 promastigote 기생충의 인구를 준비합니다. <ol><li> 중반 로그 위상 기생충 문화를 수확. hemocytomer에 계산합니다. 완전한 M199 배지 10ml에 5 × 5 기생충 / ㎖를 재현 탁. 그들은 (약 5-6일에서) 말 고정상에 도달 할 때까지 혐기성 조건에서 기생충 문화를 성장. </li><li> 비 metacyclic 기생충 펠렛 뜨는을 복구하고 10 분 동안 26 ° C에서 2,500 XG에 다시 스핀 26 ° C에서 10 분 동안 1,200 XG에서 LD1S 문화를 스핀. 참고 :이 최종 펠렛은 매우 metacyclic promastigote 기생충에 충실. </li><li> 1의 펠렛을 재현 탁PBS의 00 μL. V 및 혈구를 사용하여 기생충을 계산 : 25 % 글루 타르 알데히드와 1/100 V를 고정을위한 작은 나누어지는을 제거합니다. </li></ol></li><li> PBS에 1 × 10 1백분의 7 μL로 농축-metacyclic 기생충 인구를 희석. 마취 된 쥐의 꼬리 정맥에 기생충 현탁액을 주사 30 G 바늘로 1 ML의 주사기를 사용하여 (아래 참조). 대조군의 경우, 꼬리 정맥에 100 ㎕의 PBS를 주입. </li></ol> 2. 외과 적 치료 <ol><li> 30 분 동안 70 % 에탄올로 살균 소독제 분무 작업 공간과 모든 수술기구를 소독. </li><li> 125 ㎎ / ㎏의 케타민 12.5 밀리그램 / PBS에 희석 kg 자일 라진을 함유하는, 동물의 중량에 따라 마취 용액을 준비한다. </li><li> 마우스를 달아 복강 30 G 바늘 1 ML의 주사기를 사용하여 마취의 적절한 투여 량을 주입. </li><li> 따뜻한 마우스를 유지하고 마우스가 완전히 anesthe 있는지 확인진행하기 전에 발 패드를 집어 HSV 공간. 60 분마다 마우스의 마취 용액 반 도즈를 재 주입. </li><li> 마우스의 복부를 면도하고 Vetedine로 청소. 복부의 왼쪽에있는 흉부 케이지 아래의 피부와 근육의 작은 절개를합니다. </li><li> 다만 열린 영역 아래 복부에 촉촉한 거즈 조각을 놓습니다. 간을 노출하고 거즈에 놓습니다. 간 위의 촉촉한 거즈의 다른 조각을 놓습니다. </li><li> 장소는 24 X 60mm 2-150 μm의 두께 coverslip에, 시아 노 아크릴 레이트 결합 현미경 시각화를위한 간에, 금속 프레임에. </li><li> 젖은 거즈로 마우스의 눈을 보호합니다. </li><li> 촬상 세션 후, 경부 탈구에 의해 동물의 마취를 안락사. </li></ol> 간 아키텍처 3. 생체 내에 현미경 이미징 <ol><li> 에 장착 반전 촛점 현미경 생체 내에 현미경 실험을 수행hermostatic 실, 아포 크로매틱 63X 오일 글리세린 침지 목표 (NA 1.4), 아르곤 (488 ㎚)와 헬륨 네온 (543 nm의, 633 nm의) 레이저 및 청색 다이오드 (405 나노 미터)을 제어. </li><li> 목적에 간 얼굴을 덮고있는 커버 슬립과 현미경의 무대에 마우스를 놓습니다. 29 ° C까지 챔버의 온도를 설정합니다. 사인 곡선의 시각화를 허용하는 간 자기 형광을 사용하여 초점을 조절합니다. </li><li> 혈관을 시각화하기 위해 각 마우스 PBS 100 ㎕에 희석 500 μg의 BSA - 알렉사 647의 솔루션을 준비합니다. 30 G 바늘을 1 mL를 주사기를 사용하여 마취시킨 쥐의 꼬리 정맥에 정맥 내 용액을 주입한다. </li><li> 간세포 핵을 시각화하기 위해 PBS에 훽스트 33342의 용액을 제조 하였다. 복강 30 G 바늘 1 ML의 주사기를 사용하여 마우스의 8 ㎎ / ㎏에서이 솔루션을 주입한다. </li><li> 이미지 간 400 Hz에서 일반 연속 모드, 63X 침지 객관적이고 스캐너를 사용하여세포 핵 및 간 혈관. 훽스트 여기에 대한 405 nm의 청색 다이오드와 BSA - 알렉사 647 여기의 633 nm의 레이저를 켭니다. 아르곤 488 nm의 레이저를 켜고 간자가 형광을 시각화하기 위해 대규모 인수 대역을 정의합니다. </li></ol> 혈류 속도 측정을위한 간 4. 생체 내에 현미경 이미징 <ol><li> 현미경 (LAS-AF 뷰어 버전 3.1.0 빌드 8587)의 LAS 소프트웨어를 엽니 다. 현미경 소프트웨어를 열 때 공진 스캐너 모드를 선택합니다. </li><li> 하드웨어를 설정하려면 구성 탭을 클릭합니다. 레이저를 클릭하고 헬륨 네온 레이저 (633)를 선택합니다. 설정을 클릭하고 12 비트 해상도를 선택합니다. </li><li> 취득 메뉴를 클릭합니다. 빔 경로 설정 창에서, 목적 63X를 선택하고 100 %로 633 레이저 파워를 설정합니다. 신호 이득과 PM1-3 드롭 다운 메뉴에서 알렉사-633을 선택하여 설정 매개 변수 오프를 활성화합니다. </li><li> 획득 탭에서 &#39;xyt&#39;인수를 선택모드. 1,024 X 1,024에서 설정 서식의 폭. 8,000 Hz에서 속도를 선택합니다. 3 에어리 단위의 핀홀을 선택합니다. 양방향 모드를 선택하지 마십시오 3의 줌 배율을 선택합니다. </li></ol> RBC 속도 5. 정량 분석​​ xyt 이미지를 사용 (방법 1) <ol><li> 라이브 모드에 혈액의 흐름을 시각화하는 &#39;라이브&#39;아이콘을 클릭합니다. 관심 영역을 선택하고 분석을 위해 특정 혈관을 선택한다. USB 제어판 &#39;X&#39;, &#39;Y&#39;및 스캔 필드 회전 좌표를 조정하여 수평 위치에 관심 용기를 설정한다. </li><li> 관심 용기가 설정되면 &#39;라이브&#39;모드를 중지. 선택, 창, 선 평균 = 1, 프레임 평균 = 1을 설정 획득 모드에서 1,024 X 256 포맷 설정 폭을 변경 이미지를 얻기위한 &#39;시작&#39;에 150 클릭 &quot;스택&quot;. </li><li> 사용 RBC 속도의 정량적 분석을위한 &quot;xyt&quot;이미지는 ImageJ에 소프트웨어를 엽니 다. &#39;파일&#39;을 선택ImageJ에있는 탭을 누른 다음 원하는 파일을 선택 &quot;열기&quot;를 클릭합니다. </li><li> ImageJ에있는 &#39;플러그인&#39;메뉴로 이동 궤적 및 바이오 형식 옵션을 가져 오기를 선택합니다. 이 창에서 &#39;hyperstack&#39;로 매개 변수를 볼 수 스택을 선택합니다. &quot;xyzct&quot;스택 순서 옵션에서 옵션을 선택합니다. 참고 :이 인수의 모든 일련의 창을 엽니 다. </li><li> ImageJ에 메뉴에서 &#39;플러그인&#39;을 클릭하고 MTrackJ 옵션을 선택합니다. 작은 창에 &#39;추가&#39;아이콘을 클릭하고 추적하기 위해 적혈구를 클릭합니다. 각각의 다음 프레임에서 같은 RBC 클릭하고 속도를 측정하는 &#39;측정&#39;아이콘을 클릭합니다. 참고 : .exl 형식으로 저장할 수 있습니다 생성 된 파일을. </li><li> 용기 당 다섯 적혈구 최소 트랙과 동일한 크기의 세 개의 개개의 용기의 최소 분석. </li></ol> XT 라인의 이미지를 사용하여 RBC 속도 6. 정량 분석​​ (방법 2) <ol><li> 혈액 F를 시각화하기 위해 &#39;라이브&#39;를 클릭라이브 모드에서 낮은. 분석 용 특정 혈관을 선택한다. 수평 위치에 관심있는 용기를 설정합니다. 관심 용기가 설정되면 &#39;라이브&#39;모드를 중지. </li><li> &#39;XT&#39;스캔 모드를 선택하고 라인 스캔 따라 선택된 선박의 중앙 루멘을 설정합니다. 설정 형식 폭 1024 X 512, 속도 = 8,000Hz, 라인 평균 = 32, &#39;시작&#39;과 XT 라인 이미지를 수집에 시간 = 512 클릭에서. </li><li> .lif 파일을 열고 관심있는 XT 라인 이미지를 열어 RBC 속도의 정량 분석​​을위한 줄무늬를 생성합니다. LAS-AF 소프트웨어에서, &quot;실험&quot;을 선택 .lif를 열고 이미지를 선택합니다. 참고 : 자동으로 kymograph을 엽니 다. </li><li> 이 kymograph에 (X 축 상 얻어진 D) 소정 거리를 이동하기 (어두운 반사 표시) 입자 연속 요구 (t, Y 축 상에 얻음) 시간을 측정한다. 도구 &quot;선을 그립니다&quot;하고 행진에 수평으로 선을 그릴을 선택합니다. 거리에 유의μm의 이미지 하단의 결과 탭 발생 시간 (초 단위). </li><li> kymograph에서 얻은 값을 사용하여 V = 거리 / 시간과 속도를 계산합니다. </li><li> XT 이미지 당 다섯 입자 줄무늬의 최소값과 동일한 크기의 세 개의 개개의 용기의 최소 정량화. </li></ol>

<ol>
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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+RBC+velocity,+flux,+hematocrit+and+shear+rate+in+vascular+networks.">Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks.</a> Nat. Methods. 7, 655-660 (2010).</li><li>MacPhee, P. J., Schmidt, E. E., Groom, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittence+of+blood+flow+in+liver+sinusoids,+studied+by+high-resolution+in+vivo+microscopy.">Intermittence of blood flow in liver sinusoids, studied by high-resolution in vivo microscopy.</a> Am. J. Phys. 269, G692-G698 (1995).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

마우스 간 생체 내에 현미경의 최근 발전은 생체 내에서 실시간으로 5,9,10 감염에 대한 생리적 반응의 조사에 대한 새로운 가능성을 엽니 다. 장기 혈액의 흐름은 종종 많은 질병에서 변경되는 중요한 생리적 파라미터이다. 그러나 생리 학적 감염성 조건 하에서 간 혈류의 상태를 제대로 탐구 영역 남아있다. 본 연구에서는 이전에 비장 및 종양 맥관 연구를위한 적응시켰다 IVM 기반 ...

장기 별 혈역학는 포유류의 기관의 중요한 생리적 기능입니다. 혈액의 흐름에 이상이 염증의 결과 및 장기 부전 1의 표시 일 수있다. 따라서, 혈류 조직의 구조와 기능은 병리 생리 학적 조건 하에서 분석을위한 임계 파라미터로서 나타난다. 일반적으로 특정 기관에 혈액 흐름을 분석하기 위해 사용 된 기술은 기술 자체의 분해능 한계 등 여러 한계를 포함 (예를 들어 혈류 도플러 촬상) 당 혈액 만 (양의 절대 혈류 측정을위한 용량 기관) (예를 들어, 빛 간섭 단층 촬영)와 혈관 2,3의 크고 이질적인 인구에서 속도의 평균 변화의 측정을 제공하는 장치. 간의 순환 시스템은 크기, 구조와 기능에 이질적인 다른 선박의 하위 유형을 연결합니다. 에이 연구, 생체 내에 현미경 (IVM) 이미징 기술은 고해상도 실시간으로 생체 내 간 혈류 역학을 평가하기 위해 적용되고 평행 간 기관을 구성하는 개별 혈관의 특성을 밝히기 위해서. 이 강력한 광학 이미징 기술의 최근 발전은 연구자가 높은 공간 및 시간 해상도에서 살아있는 동물에서 동적 데이터를 수집 할 수있다. 직접적인 시각화 및 생체 내에서 특이적이고 신속한 생물학적 과정의 실시간 모니터링을 허용함으로써 IVM 이미지 개별 혈관 연구원 수있는 독특한 기회를 제공하고, 측정하고 특별히 선택된 내의 단일 적혈구의 속도 (RBC)를 정량화 간 선박. 본 연구에서 우리는 간에서 혈역학 hepatotropic 슈만 편모충 기생충에 의한 감염 마우스의 영향을 조사하기 위하여 마우스의 간에서 IVM 기법을 구현 하였다. L. donovani내장 리 슈만 편모충 증, 급성 온 만성 염증 반응을 특징으로하는 질환 및 중증 간 및 비장 등의 여러 기관에 존재하는 병변을 담당 에이전트이다. 내장 슈만 편모충 증의 실험 마우스 모델에서 간 감염 자체 해결 비장 감염 4 진보적 인 반면이다. 아직 완전히 이해되지 않은 개별 기관에 대하여 리 슈만 편모충 감염이 결과. 병적 인 상태에서 간 및 비장 혈역학의 조사는 호스트 기생충 상호 작용과 질병 발병 새롭게 조명한다. 우리의 실험 모델 시스템은 노광 및 간 intravasculature의 표지 특정 형광 염료의 정맥 주사를받은 마취 된 마우스의 간을 이미징에 기초한다. 간은 내 생명 현미경 유리한 기관이다. 작은 incisio을 수행 한 후n은 복부, 간은 부드럽게 외부화 된 후 심장 박동과 호흡으로 인해 어떤 모션 아티팩트를 감소시키는 것을 목표로 커버 슬립에 젖은 거즈에 배치합니다. 간 후, 현미경 렌즈의 시야 내에 배치된다. IVM 연구를위한 두 개의 광자 현미경의 사용을 필요로 비장과 림프절에 비해 간암의 이점은 최대 침투 깊이와, 종래의 공 초점 현미경의 사용을 허용 그 균질 3D 구조 / 해부학에 놓여 약 50 μm의, 생체 내에 현미경 영상 5-8합니다. 본 연구는 개개 혈관 RBC 속도와 혈류 속도의 정량적 측정을위한 두 개의 독립적 인 촬상 방법을 설명한다. 첫번째 방법에서, 간 혈류량은 시간 차원 XY 양방향 모드를 사용하여 획득된다. 그 결과 xyt 데이터는 individ의 추적을 허용 무료 ImageJ에 소프트웨어의 MtrackJ 플러그인을 사용하여 분석시간이 지남에 따라 연간 적혈구. 두번째 방법에서, 하나의 혈관이 선택되고, 그 대응하는 혈류는 공 초점 레이저 주사 현미경의 라인 주사 빠른 획득 모드를 사용하여 분석된다. 관심의 용기 축선을 통해 중심 축을 따라 높은 주파수에서 스캔됩니다. 혈액 유속이어서 표지 된 어두운 적혈구와 혈장 사이의 형광 표지 된 콘트라스트의 차이에 기초하여 정량화된다. 스캔 라인을 따라 얻은 적혈구와 혈장의 형광 강도가 줄무늬를 얻는 시간에 대해 도시되고, 각도가있는 개별 RBC의 속도에 비례한다. 이 문서의 목적은 간 개별 혈관 내 이미징을위한 간단하고 재현 가능한 방법 및 측정 혈류 속도를 제공하고, 마우스 수술, IVM 그리고 속도의 정량 분석​​의 성공적인 성능에 대한 기본적인 도구를 사용할 수 있도록하는 것이다 개별 적혈구. 티그의 접근 방식은 연구자가 병적 인 상태에서 혈액 속도에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-Alexa 647</td>
			<td>lifetechnologies</td>
			<td>A34785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran-FITC 500 mol wt</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>46947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>PanPharma</td>
			<td>20434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>KP07KEU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetedine</td>
			<td>Pharma Animal</td>
			<td>6869029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate liquid</td>
			<td>Cyanolit</td>
			<td>5833300005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip frame: Membrane slide for microdissection part N&#176;: 5013</td>
			<td>Molecular machines</td>
			<td>50103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip DiaPath 24x60 ep: 1.6 mm</td>
			<td>DiaPath</td>
			<td>61061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>TCS-SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-AF viewer&#160;</td>
			<td>Leica software</td>
			<td>Version 3.1.0 buid 8587</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intravital microscopy imaging of the liver following leishmania infection: an assessment of hepatic hemodynamics

생체 내에 현미경 (IVM)을 실시간으로 라이브 동물의 다양한 생물학적 이벤트의 시각화, 모니터링 및 정량을 가능하게 한 강력한 광학 영상 기술이다. 이 기술은 크게 생리적 프로세스 및 특정 기관의 병원체 매개 현상에 대한 우리의 이해를 전진했다. 이 연구에서, IVM은 마우스 간인가하고, 프로토콜 설계 상으로 생체 내 간 순환계를 개별 용기 간 적혈구 (RBC)의 속도를 측정한다. 간 장기 특성을 다른 용기 아형을 시각화 및 혈액 유속 측정을 수행하기 위해 C57BL / 6 마​​우스에게 정맥 ​​내 간 - 관련 맥관 라벨 형광 플라즈마 시약으로 주입된다. IVM은 관심의 특정 용기 생체 실시간, RBC 속도의 측정에 가능하게한다. 이 방법을 설정하면하는 것이 가능하게됩니다생리적, 병리 적 조건에서 간 혈류 역학 조사. 궁극적으로,이 촬상 계 방법론 L.의 영향을 연구를 위해 중요한 것 간 혈류 역학에 donovani 감염. 이 방법은 다른 감염성 모델 마우스 기관에 적용될 수있다 또한 혈류에 미치는 영향을 정량함으로써 염증에 대한 약물의 효과의 임상 테스트를 미리하도록 확장 될 수있다.

간에서 정현파의 구체적인 건축 조직 시각이 기관 (도 1, 패널 B와 C, 녹색), 간세포 핵 라벨링 훽스트의 복강 내 주사의 autofluorescent 속성에 기초 할 수있다 (도 1B, 블루) 그리고 간 순환 시스템 (그림 1C, 적색)의 염색에 대한 형광 BSA의 정맥 주사. 직경 40-700 μm의 2 (D)에서 300 μm의 2 이상 μm의 2, 대형 선박의 D 40 ~ 80 사이의 간은에 이르기?...

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Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

다음 간 생체 내에 현미경 이미징<em&gt; 슈만 편모충</em&gt; 감염 : 간 혈류의 평가

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

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Immunology and Infection

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

11.4K 조회수.  University of Aix-Marseille. This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

비디오: Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

라이브 호스트에 트렌스 제닉 Leishmania의 기생충의 생체내 이미징에서

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

연구

면역학 및 감염병학

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

사타구니 림프 노드의 Intravital 현미경

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

비장의 Intravital 현미경 : 기생충 이동성 및 혈류의 정량 분석

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

마우스 오금 림프절의 Intravital 이미징

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

어린 싹 센터의 높은 해결의 intravital 스트라이프 - 조명 현미경

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

전단 응력의 인간 간 사인 내피에서 조건에 백혈구 모집을 연구하는 흐름 접착 분석

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

CXCR6.Gfp 기자 마우스를 사용하여 건강하고 병에 걸린 간에서 면역 세포의 장기 생체 내에 다중 광자 현미경 이미징

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are extremely high, no direct treatment or organ-related mechanism has been examined in detail in real time. The liver is the key organ that manages toxins and infections in the human body. Herein, we aimed to perform intravital imaging of mouse liver after induction of endotoxemia in order to track the motility of immune cells, such as neutrophils and liver capsular macrophages (LCMs). Accordingly, we designed a novel surgical method for exposure of the liver with minimally invasive surgery. Mice were intraperitoneally injected with lipopolysaccharide (LPS), a common endotoxin. Using our novel surgical approach for exposure and intravital imaging of the mouse liver, we found that neutrophil recruitment in LPS-treated LysM-green fluorescent protein (GFP) mouse liver was increased compared with that in phosphate-buffered saline-treated liver. After LPS treatment, the number of neutrophils increased significantly with time. Additionally, using CX3Cr1-GFP mice, we successfully visualized liver resident macrophages called LCMs. Therefore, to investigate the efficacy of new reagents to control immune mobility in vivo, determining the motility and morphology of neutrophils and LCMs in the liver may allow us to identify therapeutic effect in organ failure and tissue damage caused by leukocytes activation in sepsis.

We established a novel surgical protocol for two-photon imaging of live mice liver with minimal invasion. With this technique, we identified the detailed structure of the liver during lipopolysaccharide-induced endotoxemia. We anticipate that this method may be utilized to determine the effectiveness of various reagents treatment to hepatic leukocyte migration.

Lipopolysaccharide 취급 마우스 간에 면역 반응 동안 백혈구의 2 광자 Intravital 이미징

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

영상 셀 상호 작용 Tracheal 점 막에서 2 광자 Intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여 인플루엔자 바이러스 감염 중

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...