SS는 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 프로그램 그랜트 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 중간 임상 친목, CW에 의해 투자된다.

1. 하는 마이크로 준비 <ol><li> 프리 코트 쥐의 꼬리 콜라겐 유형 I (220 ㎍ / ㎖가 작동 희석을주는 PBS 1:100으로 희석 RTC)와 여섯 채널하는 마이크로. 이것은 직접 채널로 희석 RTC 솔루션 30 μl를 주입하고 PBS 세 세척 한 다음 37 ℃에서 2 시간, 잠복기에 의해 수행된다. </li></ol> 2. Microslides에서 시드 셀 <ol><li> 트립신-EDTA에 (이전 13 설명 ​​된 간 조직에서 분리 된) 배양 된 인간의 간 사인 내피 세포의 합류 T75 플라스크 (HSEC)을 떼어 놓다, 전체 미디어 (인간의 내피에서 3 × 10 6 세포 / ml에서 PBS에 씻어에 resuspend 기초 매체는 2 ㎜의 L-글루타민, 100 U / ㎖ 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토 마이신, 10 % 열 - 불 활성화 된 AB 혈청과, 혈관 내피 성장 인자 10ng의 / ㎖ 및 간세포 성장 인자 10ng의 / ㎖)으로 보충. 무서운 세포 현탁액의 30 μl를 주입ctly 각 채널에. </li><li> 세포가 37 배양기에서 1 시간 동안 준수 남겨 슬라이드 선반에 5 % CO 2 분위기로 C를 °. 세포는 완전 배지 (도 1)와 각 채널의 양쪽에 기입 포트를 부착시킨 후. </li></ol> 3. 세포의 사이토 카인 자극 <ol><li> 24 시간 동안 인큐베이터에있는 세포를 남겨주세요. 도립 위상차 현미경을 이용하여 세포 성장을 평가한다. 종래 접착 분석에 24 시간, 종양 괴사 인자 알파 및 인터페론 감마에 의해 보충 완전한 미디어, 10 NG / ㎖의 양으로 성장 배지를 교체함으로써 사이토킨과 내피 단층을 자극한다. </li></ol> 4. 말초 혈액 림프구의 분리 <ol><li> 초기 (800)에 25 분 동안 적절한 세포 분리 원심 매체 이상의 밀도 구배 원심 분리하여 단핵 분획을 정제하여 전혈로부터 말초 혈액 림프구를 분리X g. 단핵구의 부착을 허용하는 1 시간 동안 플라스틱의 세포를 품어. </li><li> 플라스틱 대기음을 준수 다음 림프구는 상층 액을 농축. 림프구를 세척하고 유동 매체 (일반적으로 1 X 10 6 세포 / ml (내피 기초 매체가 0.1 %를 함유 (V / V) 소 혈청 알부민 (BSA))을 재현 탁. </li></ol> 5. 억제제와 내피 세포 나 백혈구의 전처리 <ol><li> 내피 media/0.1의 % (V / V) BSA의 기능을 차단하는 항체 또는 작은 분자 억제제의 권장 희석을 준비합니다. 30 분 전에 분석 흐름을 선택하는 마이크로 채널에서 항체 / 억제제 차단 솔루션으로 전체 매체를 교체합니다. </li><li> 림프구에서 케모카인 수용체의 전처리가 계획되는 경우, (v / v) BSA 0.1 %를 함유하는 RPMI 용액 절연 백혈구를 재현 탁하고 케모카인 수용체의 G-단백질 결합 수용체 활성을 차단하는 백일해 독소 중에는 200ng / ㎖로 배양; 다르게 특정 희석 기능추천 희석에서 항체 또는 케모카인 수용체의 작은 분자 억제제를 차단. 다음 흐름 매체 씻어 재현 탁, 30 분 동안 37 ° C에서 백혈구를 품어. </li></ol> 6. 흐름 분석 시스템의 설치 <ol><li> 37 온도 조절 장치로 통제 투명 실을 Prewarm ° C. 챔버는 사실상 죽은 볼륨 세포와 미디어 사이의 전환을 가능하게하는 전자 솔레노이드 밸브의 실리콘 튜브 및 전자 공급 장치의 삽입을위한 포트가 있어야합니다. 챔버는 허용하도록 거꾸로 현미경에 장착된다 위상차 현미경.도 2는 현미경의 스테이지에 배치 된 유동 검정 챔버 및 현미경 및 마이크로 슬라이드를 보여준다. </li><li> 멸균 증류수 10 mL로 루어 락 50 ㎖ 유리 주사기를 미리 기입 및 주사기 포트에 25cm의 실리콘 튜브의 길이를 첨부. 주사기 펌프에 삽입합니다. 에 따라 주사기 펌프의 철수 속도를 변경0.05 (PA 0.5 다인 / cm 2,도 3)의 전단 응력을 유지하는 마이크로 제조업체의 지침. </li><li> 두 5 ㎖ 주사기를 가지고 플런저를 버리고 실리콘 튜브를 이용한 전자 솔레노이드 밸브의 두 가지의 흐름 포트에 배럴을 연결합니다. <ol><li> 아웃 플로우 밸브에 실리콘 튜브 12cm를 연결합니다. 밸브는 셀 무료 세척 버퍼 (내피 media/0.1의 % (V / V) BSA) 및 림프구 서스펜션 사이에 교대를 허용합니다. </li><li> 두 주사기 배럴 세척 버퍼를 삽입하고 버퍼가 한 통의 밸브를 통해 밖으로 흐름 실리콘 튜브에 흐르는함으로써 전자 솔레노이드 밸브를 세척합니다. </li><li> 다른 통에 대체 버퍼가 흐르는 모든 거품이 시스템에서 제거되는 것을 보장하기 위해 밸브 스위치를 사용합니다. 배럴 중 하나에서 세척 버퍼를 제거하고 림프구의 서스펜션도 4a로 교체. </li></ol></li><li> 실리콘 tubin 연결하는 마이크로 어댑터를 통해 선택하는 마이크로 채널의 하나의 포트에 주사기 펌프에서 g. 그런하는 마이크로 어댑터를 통해 반대 포트에 유출 밸브의 실리콘 튜브를 연결합니다. 실리콘 튜브 및 어댑터가 기포 시스템 (그림 4B)를 입력 방지하기 위해 연결하기 전에 세척 버퍼로 가득 있는지 확인합니다. </li><li> 일단 흐름 시스템에 연결된 현미경 무대에서하는 마이크로를 배치하고 이동을 방지하기 위해 클립이나 테이프로 부착합니다. 적절한 위상 설정과 함께 10X 목적에 현미경을 설정합니다. 내피 세포 단일 층이 가시화되어 있는지 확인하고 초점 안구 렌즈를 사용. 확인 이미지는 이미지 모니터로 중계하고 기록 할 수있다 현미경에 부착 된 카메라를 통해 포착 될 수있다. </li></ol> 7. 분석을위한 접착의 분석 기술 및 녹음 흐름 <ol><li> withdrawa을 시작하여 2 분 동안 세척 버퍼와 내피 층을 Perfuse이물질 또는 언 바운드 차단 항체를 분리 한 다음 0.05 펜실베니아의 일정한 벽 전단 응력에서 백혈구 용액 5 분간 볼 러스를 허용하도록 밸브를 전환 주사기 펌프의 리터 </li><li> 백혈구 루스의 마지막 2 분 동안, 마이크로 슬라이드의 길이를 따라 임의의 필드 (10)를 기록한다. 이 내피 세포 단일 층에 림프구 회전 / 테 더링의 오프라인 분석을 할 수 있습니다. 다음으로 이동하기 전에 약 10 초 동안 각 필드를 기록하고 녹음을 두 번 연속으로 같은 롤링 셀을 기록 피하기 흐름의 방향에 대해 수행되어 있는지 확인합니다. </li><li> 그 시작 위치로 밸브를 반환하여 세척 버퍼의 5 분의 알약과 백혈구의 알약을 따르십시오. 이 볼 루스의 마지막 2 분 동안 마이크로 슬라이드의 길이를 따라 적어도 10 임의로 선택된 필드를 선택하여 제 2 기록 단계를 수행한다. 다음으로 이동하기 전에 약 5 초 동안 각 필드를 기록하고 확인하는 내피 세포의 단일 층 및 부착 leucoc, 킬로바이트는 명확한 초점에 있습니다. 이 접착 패턴의 오프라인 분석을 할 수 있습니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Wong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+role+for+selectins+in+the+recruitment+of+leukocytes+into+the+inflamed+liver+microvasculature.">A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature.</a> Clin. Invest. , 2782-2790 (1997).</li><li>Braet, F., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+aspects+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrae:+a+review.">Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review.</a> Compar. Hepatol. 1, 1 (2002).</li><li>Lawrence, M. B., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocytes+roll+on+a+selectin+at+physiologic+flow+rates:+distinction+from+and+prerequisite+for+adhesion+through+integrins.">Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: distinction from and prerequisite for adhesion through integrins.</a> Cell. 65, 859-873 (1991).</li><li>Finger, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+through+L-selectin+requires+a+threshold+hydrodynamic+shear.">Adhesion through L-selectin requires a threshold hydrodynamic shear.</a> Nature. 379, 266-269 (1996).</li><li>Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threshold+levels+of+fluid+shear+promote+leukocyte+adhesion+through+selectins+(CD62L,P,E).">Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E).</a> J. Cell biol. 136, 717-727 (1997).</li><li>Cinamon, G., Shinder, V., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+forces+promote+lymphocyte+migration+across+vascular+endothelium+bearing+apical+chemokines.">Shear forces promote lymphocyte migration across vascular endothelium bearing apical chemokines.</a> Nat. Immunol. 2, 515-522 (2001).</li><li>Lalor, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+adhesion+protein-1+mediates+adhesion+and+transmigration+of+lymphocytes+on+human+hepatic+endothelial+cells.">Vascular adhesion protein-1 mediates adhesion and transmigration of lymphocytes on human hepatic endothelial cells.</a> J. Immunol. 169, 983-992 (2002).</li><li>Aspinall, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX(3)CR1+and+vascular+adhesion+protein-1-dependent+recruitment+of+CD16(+)+monocytes+across+human+liver+sinusoidal+endothelium.">CX(3)CR1 and vascular adhesion protein-1-dependent recruitment of CD16(+) monocytes across human liver sinusoidal endothelium.</a> Hepatology. 51, 2030-2039 (2010).</li><li>Curbishley, S. M., Eksteen, B., Gladue, R. P., Lalor, P., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR+3+activation+promotes+lymphocyte+transendothelial+migration+across+human+hepatic+endothelium+under+fluid+flow.">CXCR 3 activation promotes lymphocyte transendothelial migration across human hepatic endothelium under fluid flow.</a> Am. J. Pathol. 167, 887-899 (2005).</li><li>Oo, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+CCR4+and+CXCR3+in+the+recruitment+and+positioning+of+regulatory+T+cells+in+the+inflamed+human+liver.">Distinct roles for CCR4 and CXCR3 in the recruitment and positioning of regulatory T cells in the inflamed human liver.</a> J. Immunol. 184, 2886-2898 (2010).</li><li>Weston, C. J., Shepherd, E. L., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+localization+and+trafficking+of+vascular+adhesion+protein-1+as+revealed+by+an+N-terminal+GFP+fusion+protein.">Cellular localization and trafficking of vascular adhesion protein-1 as revealed by an N-terminal GFP fusion protein.</a> J. Neural Transm. , (2013).</li><li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium.">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> J. Immunol. 186, 4147-4155 (2011).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지

성공적 유동 검정을 수행하기위한 가장 중요한 단계는 내피 세포의 건강과 합류 단층 전에 유동 접착 분석 준비가되었다는 것을 보장한다. 기본 내피 세포는 문화 어렵고 배양 방법의 변화에​​ 민감 할 수 있습니다. 그것은 1) 유량 용기가 적절하게 균일 단층의 내피 세포로 코팅하는 것이 중요합니다; HSEC에 대해 우리는 쥐의 꼬리 콜라겐 유형 I를 사용하지만 다른 내피 인구 다를 수 있습니다, 2) 문화 매체를 들면, 세포 유형에 적합한 HSEC 우리는 프로토콜 섹션에서 우리의 완전한 매체를 설명했다. 다른 중요한 단계는 전단 응력의 생리적 인 수준을 반영하도록 적절한 속도로 시린지 펌프를 설정 있습니다. 유동 검정시에는 내피 단층 손상 또는 내피 세포 표면에서의 면역 세포를 제거 할 수 유동 회로 내에서 기포를 방지 할 필요가있다. 이는 EN에 의해​​ 방지 될 수있다모든 실리콘 튜브 및 어댑터는 모든 기포를 제거하고 용지를 사용하기 전에 예비 가온되는 것을, 연결 전에 세척 버퍼로 관류하는 것을 suring. 는 액체 / 액체 계면이 연결 중에있어 매우 중요하다 마이크로 슬라이드상의 포트에 어댑터를 연결하는 경우에 공기가 존재하는 경우, 이것은 주사기 출금 중에 내피 단층을 방해한다 시스템 내에서 에어 갭을 형성 할 것이다 단계. 시린지 외통의 백혈구 세포 용액 따라서 실험 내내 일정한 셀 밀도를 유지하고, 침전하지 않도록 일정한 교반이 필요하다. 기록 단계 동안에 그것 내피 층의 화상이 적절히 집중하고 정확한 오프라인 분석을 허용하도록 클리어되고 보장하는 것이 중요하다, 즉 유동 검정 (포스트 백혈구 볼 러스)의 두 번째 단계 동안 충분한 시간은 세척 완충액 중에 남아 녹음하기 전에 단계는 다음을 보장하기 위해보다 추천모든 비 접착 성 백혈구가 제거됩니다. 유사하게는 좁은 모세관에서 흐름 패턴을 방해 할 세포의 손실을 방지하고, 또한 위상차 현미경 하에서 큰 부착 백혈구로부터 구별하기 어려울 수있는 적절한 밀도의 단층에서 내피 세포를 사용하는 것이 필수적이다. 우리는 인간의 간 사인 내피 세포에 대한 최적의 파종 밀도를 설명 그러나 이것은 다른 내피 인구와 종 사이에 차이가있을 수 있습니다. 상당한 진전이의 intravital 현미경으로 동물 모델에서 백혈구 모집을 공부에서했다. 유동 접착 분석 방법의 주요 장점은 백혈구 모집 일차 인간 내피 세포와 이진 시스템에서 연구 될 수 있다는 것이다. 또한, 이러한 상호 작용은 전단 응력의 생리 관련 수준에서 공부하실 수 있습니다. differenc이있을 수 있으므로 그것은 인간의 셀룰러 시스템과 동물의 intravital 연구의 연구 결과를 확인하는 것이 중요하다종 사이의 내피 세포의 특성 에스. 유동 검정의 한계 중 하나는 백혈구 모집 내피 단층의 단세포 환경에서 연구되고 있다는 것이다. 백혈구가 내피를 통해 접착 transmigrated 일단 또한 그들은 격리 및 다운 스트림 공정을 실시 할 충분한 수의 존재에 있지 않을 수 있습니다. 이러한 제한에도 불구하고 유동 접착 분석은 마스터 링 된 후에는 백혈구 접착 캐스케이드의 추가 분석을 수행하도록 개발 및 다세포 환경 요점을 되풀이하도록 구성 될 수있다. 단일 필드 및 추적 소프트웨어의 사용의 장시간 녹음이 백혈구의 크롤링 동작을 분석하는데 사용될 수있다. 또한 유동 검정 완료시 microslides보다 상세히 접착 및 이주를 연구하는 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 및 면역 형광 라벨을 이용하여 심문 할 수있다. 또한, 우리는 이전에 개발 한흐르는 백혈구가 간세포의 존재에 의해 에어컨 간 내피 세포와 상호 작용 할 수있는 시험 관내 모델 에드. 이 분석은 또한 백혈구의 모집단을 연구하기 위해 개발 될 수있다 : 우리 그룹은 규제 T 세포, B 세포, 간 침투 백혈구 등의 부분 집합으로 연구를 수행하고있다. 이러한 연구 흐름 접착 분석은 인간의 시스템에서 일반 및 기관 특정 백혈구 모집을 연구하는 강력한 도구입니다 증거입니다.

그것은 지금 잘 일반적으로 백혈구 모집은 다단계 접착 폭포 1의 패러다임을 따르도록 설정됩니다. 이 혈관 벽을 일렬로 세우는 내피 세포로 흐르는 혈액에서 백혈구의 캡처를 포함한다. 처음에는 백혈구는 수용체 또는 면역 글로불린 슈퍼 패밀리의 구성원을 셀렉틴에 의해 매개되는 압연 단계를 받고있다. 이는 G-단백질 결합 수용체 (GPCR에)가 내피 글리코 칼 릭스에 제시 케모카인에 의해 활성화되는 백혈구 표면에 발현한다. 이 백혈구의 표면에 &#39;친 화성이 높은&#39;상태로 인테 확인의 변경에 이르게 체포 및 내피 세포에 회사 접착. 밀착성이어서 용기에 백혈구의 형상 변화와 크롤링하여 이어진다. 마지막 단계는 세포층 또는 세포 횡단 루트를 통해 발생할 수있는 내피 세포 단일 층을 통해 윤회입니다. 다단계 접착 계단식 설명하면서의 신체 내에서 백혈구 모집의 일반적인 메커니즘은 특정 기관의 차이가 있습니다. 간에서 백혈구 모집의 대부분은 채용 일반적 후 모세관 세정맥 (2) 내에 발생하는 다른 장기에 대비 간 정현파들 내에 발생한다. 간 사인 곡선은 낮은 전단 환경이며, 백혈구는 독립적 인 2 셀렉틴되어 접착력을 굳게하기 전에 간단한 테 더링 단계를 받고있다. 이 채널은 불연속 및 fenestrae, 직경 모공 100 ~ 200 nm의를 포함하는 간 사인 내피 세포에 의해 줄 지어와 기저막 3 부족합니다. 인간의 간 사인 내피를 통해 백혈구 모집을 중재하는 분자 메커니즘을 해명하는 기관에게 염증성 간 질환에 대한 구체적인 치료 목표를 식별 할 수 있습니다. 흐름 접착 분석은 백혈구 모집을 공부에 필수적인 도구입니다. 그들은 수 백혈구 recru의 재건잘 정의 된 힘에서 접착력을 분석하는 전단 응력의 존재 itment. 분석에 대한 가장 자주 사용하는 배양 내피 세포 단일 층 또는 정제 된 기판에 연구 백혈구의 부착입니다. 시판 유동 챔버는 두 개의 평면 표면들 사이 층류 조건 하에서 세포를 perfuse 후 현미경 (4)에 접착 동적 프로세스를 시각화하는데 사용된다. 이전 그룹은 특정 접착제의 상호 작용은 흐름에서 일어날 것을 증명하고 정적 분석 5,6에서 공부 할 수 없습니다. 우리는 간 사인 곡선을 요점을 되풀이 낮은 전단 응력 조건에서 백혈구 모집을 연구하기 위해이 기술을 사용하고 있습니다. 인간의 기본 HSEC이 microslides 및 백혈구의 배양은 다음 간 사인 곡선 내에서 전단 응력을 재현하기 위해 계산 된 유량의 비율이 단층을 통해 관류 할 수 있습니다. 전단 응력은 OPP로 표면에 평행 한 접선인가 스트레스수직 수직 응력에 osed. 경계를 따라 이동하는 유체는 그 경계에 전단 응력을 발휘합니다. 전단 응력은 림프구 윤회 7의 필수 구성 요소로 표시되었습니다. 이러한 조건에서 접착 캐스케이드의 각 단계는 위상차 현미경에 의해 시각화 될 수있다. 이 방법은 기존의 접착 분자 (8)의 연구, 케모카인 및 케모카인 수용체 9-11의 역할과 같은 혈관 접착 단백질 1 (VAP-1과 같은 비정형 부착 분자를 포함하는 간 내 백혈구의 채용에 중요한 통찰력을 허용했다 ) 8,12 일반적인 림프와 혈관 내피 수용체 1 (CLEVER-1) 13. 이 분석은 우리 그룹의 출판물의 여러 가지에 언급 된 반면, 그 설명을 간략하고있다 그리고 우리는 문제 해결에 도움이 기술적 오류를 방지하는 단계를 안내하여 상세한 단계를 제공하기 위해이 기회를 촬​​영했을 때 시도분석을 보내고. 또한, 우리는 최근에 전단 응력의 정확한 변경을 허용하는 마이크로 챔버의 소싱을 변경했습니다. 우리는이 다른 내피 세포와 면역 세포에 대한 분석의 적용 가능성을 넓혀 생각합니다. 다음의 방법은 인간의 간 사인 내피 세포 및 말초 혈액 림프구와 흐름을 기준으로 접착 분석을 수행하기위한 준비와 기술에 대해 설명합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1037">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Name of the reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:168px;">Company</td>
			<td style="width:195px;">Catalog number</td>
			<td style="width:447px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Six channel &#956;-slide VI 0.4 flow chamber&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80601</td>
			<td>Other channel size and pre-coated slidess are available depending on assay requirements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow adaptors&#160; &#956;-slide VI 0.4</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow assay chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>33-3322</td>
			<td>These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inverted Microscope IX2</td>
			<td>Olympus, UK</td>
			<td>Model IX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, UK</td>
			<td>702101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electronic solenoid valve</td>
			<td>Lee Products Limited,UK</td>
			<td>Part Number LFYA1226032H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon Tubing large</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB50855</td>
			<td>2mm Inner diameter, 4mm Outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Tubing-small</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB50853</td>
			<td>1mm Inner diameter, 3mm Outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Glass Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus, UK</td>
			<td>55-0962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell separation medium/Lympholyte</td>
			<td>VH Bio</td>
			<td>CL-5020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3867-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress

인간의 간 조직에 백혈구 침윤 모든 성인 염증성 간 질환의 일반적인 과정이다. 만성 침투 간경변 섬유증과 진행의 발전을 구동 할 수있다. 간으로 백혈구 모집을 중재하는 분자 메커니즘을 이해하는 것은 간 질환의 중요한 치료 표적을 식별 할 수 있습니다. 백혈구 모집 중에 키 상호 작용은 전단 응력의 조건에서 내피 세포와 염증 세포의입니다. 간을 모집 간 사인 내피 세포 (HSEC)에 의해 줄 지어있다 간 사인 곡선의 낮은 전단 채널 내에서 발생합니다. 간 정현파 내의 조건은 특정 유속 인간 HSEC 단일 층으로 늘어선 채널을 통해 백혈구를 관류하여 효과적으로 요약 할 수있다. 이러한 조건에서 백혈구가 내피에 걸쳐 크롤링 단계 이후의 윤회 다음 활성화 및 밀착성 다음에 간단한 테 더링 단계를 거쳐층. 위상차 현미경을 사용하여,이 &#39;접착 캐스케이드&#39;의 각각의 단계는 시각 및 오프라인 분석 하였다 기록 될 수있다. 내피 세포 또는 백혈구는이 과정에서 특정 분자의 역할을 결정하기 위해 억제제로 전처리 할 수​​있다.

이 분석은 다단계 흐름 접착 폭포를 시각화 및 분자 억제제에게 제어의 실험 결과를 비교하여 내부의 분자 메커니즘을 규명 할 수있는 능력을 가지고 있습니다. 다양한 혈관 침대는 특정 내피 세포를 통합 및 전단 응력 조건을 변경하여 효과적으로 요약 할 수있다. 점착 캐스케이드의 각 단계는 프로토콜에 명시된 기록 방법에 따라 오프라인에서 분석 될 수있다. 접착 캐스케이드의 첫 번째 단계는 전체 부착 세포의 백분율로 표현 될 수 백혈구 롤링이다. 오프라인 분석은 부착 세포의 수는 백혈구 러스 동안 각 기록 분야에서 열거 할 수있다. 이미지의 재생이 단단히 부착과 내피 세포를 통해 회전 운동을 겪고있다들이다 세포의 비교를 할 수 있습니다. 회전 운동은이 기술을 이용하여 가시화 될 수 있으며, 각 필드는 적어도 10 초 동안 기록된다. 롤링 세포는 세포를 흐르는에 비해 내피 세포의 표면에 자신의 감소 속도에 의해 식별됩니다. 이 문제는 분리하지 않고 적어도 5 초 동안 입증해야합니다. 간 정현파 내의 접착 폭포는 낮은 전단 환경에서 발생하는 생체 내 연구에서 단지 짧은 테 더링 단계를 최소한의 회전을 확인했다. 우리는 흐름 분석이 부착 백혈구의 10 % 미만은 지속적으로 이러한 분석에 이상 HSEC 자극 롤 시연으로 간 사인 곡선의 환경을 반영하고 있음을 확인했다. 접착 캐스케이드의 다음 단계는 밀착성이다. 다운로드 고수 세척 완충액 러스 (단계 7.3) 중에 기록의 두 번째 단계에서 계산 될 수있다. 오프라인 분석을 단단히 부착 세포의 총 수 (그림 5) 각 필드에 계산 될 수 있습니다. 단단히 부착 세포를 고정 또는 느린 크롤링 동작과 shapechanged 있습니다 세포로 정의됩니다.필드 당 세포의 평균 수는 계산 될 수있다. 이 도면은 다음의 범위를 표현하기 위해, 림프구 (통상적으로 1 × 106 세포 / ml)의 농도 및 유량을 (눈금 상당을 사용하여 결정) 시야의 전체 표면적과 함께 사용될 수있다 부착 세포 / mm로 림프구 준수 2 / 10 6 세포를 관류. 접착의 패턴을 공부하는 것은 접착 계단식, 모양 변화 등 크롤링 및 내피 마이그레이션의 마지막 두 단계의 분석을 포함한다. HSEC 단일 층의 상부면에 부착 백혈구 위상 밝은 단일 층을 통해 이주하는 그 동안의 위상이 어두운 (그림 6)가 나타납니다. 세포는 &#39;정적&#39;접착 (nonmigrated / 라운드) 전시로 분류 된 &#39;형상 변경&#39;형태 또는 &#39;이주&#39;와 같이 각각의 범주는 다음의 비율로 표현 될 수있다총 접착제 인구. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1.jpg" /> 그림 1. 흐름 챔버 내의 인간의 기본 간 사인 내피 세포의 단층. 미디어가 이전의 흐름 접착 분석 합류 내피 단일 층의. B) 단계 대비 이미지의 시작에 내피 세포의 단일 층을 포함 가득) Microslides, 내피 세포 (인간의 간 내피 세포에 대해이 함께해야한다 예비 코팅 된 마이크로 슬라이드에 접종해야 쥐의 꼬리 콜라겐 1 형)과는 내피 세포가 문화와 합류에 건강한 것이 중요합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src= &quot;/ files/ftp_upload/51330/51330fig2highres.jpg&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51330/51330fig2.jpg&quot;/&gt; 그림 2. 분석 챔버를 흐른다. 유동 검정 챔버 셋업 여기서 알 수있는, 그것이 거꾸로 현미경에 장착 투명한 챔버로 구성된다. 히터는 상기 챔버에 배치되고 온도 조절 37 ℃의 온도를 유지하도록 제어되어야 외부에있는 주사기 펌프 챔버 내의하는 마이크로에서 실리콘 튜브를 연결할 수있는 포트가 있어야합니다. 마이크로 슬라이드는 현미경 단계에 직접 배치된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3.jpg" /> 그림 3. 펌프 주사기. 주사기 펌프에 연결합니다유량 용기에 실리콘 튜브를 통해 에드. 펌프는 분석에 필요한 원하는 전단 응력에 따라 특정 철수 속도로 설정되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4.jpg" /> 그림 4. 밸브가 플러시 두 배럴이 밸브의 실리콘 튜브, 설정되면 유량 용기에 밸브를 연결.) 전자 솔레노이드 밸브)는 사실상 죽은 공간. B와 세포 또는 미디어 중 하나를 포함하는 두 주사기 배럴 사이를 전환 할 수 있습니다 흐름 챔버에 연결된다. 그것은 유량 용기의 포트에 실리콘 튜브에 어댑터를 연결할 때 액체 / 액체 인터페이스가하는 것이 중요합니다. &lt;HREF = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg&quot;대상 = &quot;_blank&quot;는&gt; 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5.jpg" /> 그림 5. 총 백혈구 부착의 측정. 세척 완충액 러스 단계 (프로토콜에 기술 된)의 마지막 두 분간, 열 랜덤 필드의 최소 기록되어야한다. 이러한 오프 - 라인 분석 할 수 단단히 부착 세포의 총수는 각 필드에 계산 될 수있다. 백혈구의 총 접착 제어 챔버 및 항체를 차단 전처리 그 사이에 비교 될 수있다, 우리가 제어 슬라이드의 대표 필드와 세포 접착 분자 1 (ICAM-1) 차단 항체로 전처리 슬라이드를 보여줍니다. 화살표는 표상에 부착 백혈구을 강조하기 위해 추가되었습니다제어 슬라이드에서 필드를 심하게 배 식별 (25) 백혈구의 총이있다 및 ICAM-1 블록 슬라이드에서 확인 된 13 백혈구의 총이있다. = 100 μm의 스케일 바는. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6.jpg" /> 그림 6. 기록 필드의 위상 콘트라스트 현미경으로 내피 단층에 백혈구 부착 패턴의 분석. 오프라인 분석은 또한 백혈구의 부착 방향과 속도를 연구하기 위해 사용될 수있다. 점착 캐스케이드의 특정 단계는 시각 및 위상차를 촬상하여 정량화 될 수있다. 활성화 단단히 부착되지 않지만 단계 밝은 세포는 &#39;라운드&#39;접착, 활성화되는 세포라고 할 수 있습니다D 및 위상 밝은 &#39;형상을 변경&#39;라고 할 수있는 위상 어두운 세포가 내피 마이그레이션을받은와 &#39;이주&#39;라고 할 수있는 세포입니다. 이미지는 접착의 각 패턴의 예를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

간장에 백혈구 모집은 고유 간 사인 내피 세포에 의해 줄 지어있다 간 사인 곡선의 전문 채널 내에서 발생합니다. 생리 전단 응력의 조건에서 인간의 간 사인 내피 세포에서 백혈구 모집의 위상차 현미경은이 과정을 기초가되는 분자 메커니즘의 해명을 용이하게 할 수있다.

전단 응력의 인간 간 사인 내피에서 조건에 백혈구 모집을 연구하는 흐름 접착 분석

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.2K 조회수.  University of Birmingham.  간장에 백혈구 모집은 고유 간 사인 내피 세포에 의해 줄 지어있다 간 사인 곡선의 전문 채널 내에서 발생합니다. 생리 전단 응력의 조건에서 인간의 간 사인 내피 세포에서 백혈구 모집의 위상차 현미경은이 과정을 기초가되는 분자 메커니즘의 해명을 용이하게 할 수있다. 

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Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. In the vasculature hypertension is associated with endothelial dysfunction and increased inflammation leading to atherosclerosis and various disease states such as chronic kidney disease2, stroke3 and heart failure4. An initial step in vascular inflammation leading to atherogenesis is the adhesion cascade which involves the rolling, tethering, adherence and subsequent transmigration of leukocytes through the endothelium. Recruitment and accumulation of leukocytes to the endothelium is mediated by an upregulation of adhesion molecules such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and E-selectin as well as increases in cytokine and chemokine release and an upregulation of reactive oxygen species5. In vitro methods such as static adhesion assays help to determine mechanisms involved in cell-to-cell adhesion as well as the analysis of cell adhesion molecules. Methods employed in previous in vitro studies have demonstrated that acute increases in pressure on the endothelium can lead to monocyte adhesion, an upregulation of adhesion molecules and inflammatory markers6 however, similar to many in vitro assays, these findings have not been performed in real time under physiological flow conditions, nor with whole blood. Therefore, in vivo assays are increasingly utilised in animal models to demonstrate vascular inflammation and plaque development. Intravital microscopy is now widely used to assess leukocyte adhesion, rolling, migration and transmigration7-9. When combining the effects of pressure on leukocyte to endothelial adhesion the in vivo studies are less extensive. One such study examines the real time effects of flow and shear on arterial growth and remodelling but inflammatory markers were only assessed via immunohistochemistry10. Here we present a model for recording leukocyte adhesion in real time in intact pressurised blood vessels using whole blood perfusion. The methodology is a modification of an ex vivo vessel chamber perfusion model9 which enables real-time analysis of leukocyte -endothelial adhesive interactions in intact vessels. Our modification enables the manipulation of the intraluminal pressure up to 200 mmHg allowing for study not only under physiological flow conditions but also pressure conditions. While pressure myography systems have been previously demonstrated to observe vessel wall and lumen diameter11 as well as vessel contraction this is the first time demonstrating leukocyte-endothelial interactions in real time. Here we demonstrate the technique using carotid arteries harvested from rats and cannulated to a custom-made flow chamber coupled to a fluorescent microscope. The vessel chamber is equipped with a large bottom coverglass allowing a large diameter objective lens with short working distance to image the vessel. Furthermore, selected agonist and/or antagonists can be utilized to further investigate the mechanisms controlling cell adhesion. Advantages of this method over intravital microscopy include no involvement of invasive surgery and therefore a higher throughput can be obtained. This method also enables the use of localised inhibitor treatment to the desired vessel whereas intravital only enables systemic inhibitor treatment.

This is a method to visualise leukocyte adhesion to the endothelium in harvested pressurised vessels. The technique enables studying vascular adhesion under shear flow with differing intraluminal pressures up to 200 mmHg thus mimic-ing the pathophysiological conditions of high blood pressure.

하이 Intraluminal 압력에서 혈관 내피에 이미징 백혈구의 접착

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

연구

면역학 및 감염병학

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

흐름 조건에서 인간 제대 정맥 내피 세포 및 호중구 윤회의 연구에서 이들의 사용 격리

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

<em&gt; 체외</em인간 대식 세포의 분화와 양극화의 이질성을 연구&gt; 모델

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

인간 호중구 유량 용기 접착 분석

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

T 림프구에있는 인테그린 활성화의 연구에 대한 정적 접착 분석

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

침투 림프구의 분석을위한 비 효소 해리 신선한 인간의 조직에 대한 간단하고 빠른 프로토콜

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

생체 외 및 생체 내 모델에서 혈관 벽에서 흐름 조건에 세균 부착을 연구하기 위해

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...