이 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소, 혈액 연구 노던 BC의 대학의 브리티시 컬럼비아 센터의 혁신, 대학에 대한 캐나다 재단에 의해 후원됩니다.

1. 시약 준비 <ol><li> 실험을하는 동안 사용할 시약은 수술 프로토콜을 시작하기 전에 준비를해야합니다. 모든 솔루션 살균 기술을 사용하여 만든다고합니다. </li><li> 생리 생리 식염수 (PSS)는 최고의 두 가지 구성 요소에 준비 : 기본 소금 솔루션과 나트륨 중탄산염 솔루션을. 4 20X 농도 및 저장 ° C.에 두 솔루션을 준비 20X에서 나트륨 중탄산염는 360.0mM NaHCO 3 (84.01g/mol)와 20X 농도에서 기본 소금 솔루션 2638.0mM NaCl (58.44g/mol), 94.0mM KCl (74.56g/mol) 40.0mM CaCl 2입니다 • 2 시간 2 O (147.02g/mol) 및 23.4mM MgSO 4 • 7H 2 O (246.48g/mol). 솔루션 이전 다음 화학 물질을 추가해도 좋다 때까지 솔루션은 한 번에 하나씩 추가되어야 DH 2 O와 화학 물질에 준비하고 흔들해야 </li><li> 나트륨 중탄산염 및 기본 소금 솔루션의 같은 볼륨을 diluting 및 1X 농도 (DH 2 O의 각 나트륨 중탄산염 및 기본 소금 솔루션의 두 PSS의 2L 100mL 희석시키기위한 diluting하여 PSS의 2L 준비 </li><li> 37 ° C 물 목욕으로 PSS 및 PSS를 포함한 플레이스 2L 판매량 플라스크. 수술의 시작 이전에 1 시간을위한 5 % CO 2 / 밸런스 질소 가스와 함께 솔루션을 평형. </li><li> Vasoactive 화학 물질은 (예 : 제품 Phenylephrine, 아세틸콜린, 나트륨 nitroprusside) 최고 -20 ° C.에 dH2O에서 1M 농도에서 준비하고 100μl aliquots에 저장됩니다 </li></ol> 2. 동물 준비 <ol><li> 마우스의 무게를 결정하고 intraperitoneal 주사로 90mg/kg에서 pentobarbital 나트륨의 초기 복용량을 관리할 수 있습니다. 절차를 통해 마우스가 지속적으로 발가락 핀치와 호흡 속도에주의 시험을 통해 마취의 비행기 모니터입니다. 마취의 비행기를 유지하기 위해 20mg/kg에서 필요에 따라 pentobarbital 나트륨의 추가 주사가 관리해야합니다. 노던 BC 대학교 동물의 관리 및 사용위원회 (ACUC)에 의해 승인 동물 관리 프로토콜에 명시된 바와 같이 마취의 수술 비행기는 연방 및 기관 규정에 따라 유지됩니다. </li><li> 면도기로 복부와 측면 / 힙합 영역에서 머리를 제거합니다. 알코올 면봉으로 풀어 머리를 나머지와 테이프로 영역을 끝날 제거합니다. 이 실험 절차 터미널이므로이 충분합니다. </li><li> 부정사 위치에 명확 수술 보드에 마우스를 놓고 이사회에 각 노상 강도를 녹화하여 보드에 마우스를 연결합니다. 체온은 외부 가열 램프를 통해 유지하고 저체온증은 마취의 결과로 발생하지 않습니다 보장하기 위해 직장 온도계를 통해 모니터링됩니다. </li></ol> 3. 수술 <ol><li> 전체 수술 도중 노출된 조직은 항상 따뜻하게 equilibrated PSS 솔루션 superfused 유지되도록. 그들 주위 지방 조직과 결합 조직을 조작하여 그들을 더 강제로 삽입하여 수술 악기와 함께 관심의 vasculature 접촉을하거나 혈관을 다치게 안하는 것도 중요하다. </li><li> 해부 현미경으로 마우스를 놓습니다. 복강의 복부 표면을 따라 정중선 절개를하고 마우스의 척수 칼럼으로 피부를 철회. </li><li> 피부가 LN 쉽게 볼 수 있도록 철회되면, 투명 Sylgard 184의 받침대로 피부를 핀. </li><li> LN 주변을 오버레이 결합 조직의 얇은 층을 제거 </li><li> 지방 조직의 오버레이를 해제하고 microvascular 침대 노출 때까지 림프 노드를 서라운드. 주요 간선 구간은 LN에 인접 낳는하고 일반적으로 venule에 의해 overlayed 있습니다. 전체 수술 시간은 약 30 분 소요됩니다. </li></ol> 4. 이미징 및 선박 분석 <ol><li> 관심의 선박 세그먼트는 해부 현미경 노출되면, intravital 현미경에 대한 준비를 확보. 동물 동안 실험 기간 내내 intravital 현미경에 맑은 수술 보드에 남아 있습니다. 외과 섹션 중에 설명한 것처럼 체온이 가열 램프를 통해 유지 관리 및 직장 온도계를 통해 측정됩니다. 섹션 2.1에서 설명한대로 마취 비행기는 또한 실험을 통해 모니터링됩니다. </li><li> superfusion와 흡입 라인을 설정합니다. PSS의 Superfusion는 5 % CO 2 평형 질소에 의해 perfused되고있는 물 재킷 가열 저수지 (물 재킷이 순환 waterbath에 의해 순환하고 가열)로하고 10ml의 속도로 드립 라인 아래로, 저수지에서 중력 공급에 의해 발생 / 분. 흡입 라인은 준비 가까이 superfused PSS 당겨 계속해서 사용해야합니다. 이전 실험에 흡입 라인과 물 재킷이 완전히 청소하고 각 실험 후 저장합니다. 이것은 다음 실험을하기 전에 불임을 보장합니다. </li><li> superfusing PSS의 온도를 확인합니다. 의 온도를 조절° C 준비를 통해 ~ 37 온도를 달성하기 위해 물 목욕 및 / 또는 PSS superfusion의 속도를 순환. </li><li> vasculature 적어도 60 분 PSS와 평형 및 비디오 캘리퍼스를 사용하여 혈관 직경을 정할 수 있습니다. 일반적으로, 선박의 직경은 선박이 안정 보장 (예를 들어, 40, 50, 60 분) 여러 지점에서 결정한다. </li><li> 부드러운 근육 구체적인 작용제 (예 : 제품 Phenylephrine, PE) 및 내피 구체적인 작용제 (예 : 아세 티 콜린, ACH)를 사용하여 선박의 건강을 평가합니다. 작용제의 농도는 작용제에 따라 조정해야하지만, PE와 이크에 대한 배는 superfusate에 누적 이외 (10 - 9M 10 - 5M) 각 농도에 평가해야합니다. 각 작용제의 응용 프로그램은 선박이 휴식 직경으로 돌아갑니다까지 PSS를 사용하여 세척 단계 (일반적으로 30 분)으로 구분해야합니다. </li><li> 실험을 추적 혈관 건강, 후속 vasoactive 마약, 형광 라벨, 그리고 세포의 다음 평가 실시 수 있습니다. </li><li> 실험의 끝에 다음과 같은 동물은 pentobarbital 나트륨의 과다 주어집니다. 동물은 다음 발가락 핀치와 호흡 운동이나 심장 박동의 부족으로 응답이 없다는 것을 보장하기 위해 모니터링됩니다. 같은 시간에 이것은 자궁 경부 전위옵니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : 평균 기간에 따라 준비는 사타구니 림프 노드를 공급 arteriole과 venule 모두의 식별을 허용 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다. arteriole 명확하게 혈관 직경을 계산 겹쳐하는 비디오 캘리퍼스에 대해 관찰하는 venule의 벽 수 있도록 혈관을 둘러싼 최소한의 지방 세포가 있어야합니다. 성공적인 준비의 핵심 포인트는 arteriole의 루멘을 통하여 혈관 톤 상당 정도 (예 : arteriole가 vasoconstrict 각각 근육과 내피 특정 agonists를 부드럽게 vasodilate 수있는 능력을 가지고)가있다는 것을 이동하는 혈액의 풍부한 공급을 가지고있다 . <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 생리학 생리 식염수 측면을 따라 주요 venule (녹색 화살표)를 실행하는 equilibrated 림프 노드를 먹이 사타구니 림프 노드 피드 arteriole (빨간색 화살표)의 Intravital 현미경 이미지. <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 농도에서 생리 식염수로 누적 이외의 superfused phenylephrine (PE)에 일반 vasoactive 응답 10 -9 M ~ 10 -5 M. 강력한 vasoconstriction의 존재는 arteriole에있는 정상적인 평활근 기능의 암시이다. <img src="/files/ftp_upload/2551/2551fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 농도에서 생리 식염수로 누적 이외의 superfused 아세틸콜린 (ACH)에 일반 vasoactive 응답 10 -9 M ~ 10 -5 M. 강력한 vasodilation의 존재는 arteriole 정상적인 내피 기능 현재의 암시이다.

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	<li>Bearden, S. E., Payne, G. W., Chisty, A., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteriolar+network+architecture+and+vasomotor+function+with+ageing+in+mouse+gluteus+maximus+muscle.">Arteriolar network architecture and vasomotor function with ageing in mouse gluteus maximus muscle.</a> J Physiol. 561, 535-545 (2004).</li><li>Looft-Wilson, R. C., Payne, G. W., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+expression+and+conducted+vasodilation+along+arteriolar+endothelium+in+mouse+skeletal+muscle.">Connexin expression and conducted vasodilation along arteriolar endothelium in mouse skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 97, 1152-1158 (2004).</li><li>Payne, G. W., Madri, J. A., Sessa, W. C., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histamine+inhibits+conducted+vasodilation+through+endothelium-derived+NO+production+in+arterioles+of+mouse+skeletal+muscle.">Histamine inhibits conducted vasodilation through endothelium-derived NO production in arterioles of mouse skeletal muscle.</a> Faseb J. 18, 280-286 (2004).</li><li>Smeda, J. S., Payne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+autoregulatory+and+myogenic+function+in+the+cerebrovasculature+of+Dahl+salt-sensitive+rats.">Alterations in autoregulatory and myogenic function in the cerebrovasculature of Dahl salt-sensitive rats.</a> Stroke. 34, 1484-1490 (2003).</li><li>de With, M. C., de Vries, A. M., Kroese, A. B., van der Heijden, E. P., Bleys, R. L., Segal, S. S., Kon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+anatomy+of+the+hamster+retractor+muscle+with+regard+to+its+microvascular+transfer.">Vascular anatomy of the hamster retractor muscle with regard to its microvascular transfer.</a> Eur Surg Res. 42, 97-105 (2009).</li><li>Domeier, T. L., Segal, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromechanical+and+pharmacomechanical+signalling+pathways+for+conducted+vasodilatation+along+endothelium+of+hamster+feed+arteries.">Electromechanical and pharmacomechanical signalling pathways for conducted vasodilatation along endothelium of hamster feed arteries.</a> J Physiol. 579, 175-186 (2007).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시된 사타구니 림프 노드의 Intravital 현미경은 림프절에 - 생체내의 이미지 microvasculature 수있는 기능을 제공합니다. 그러므로, 그것은 직접 실시간으로 관찰하는 수단을 용이하게합니다. LN microvasculature의 영상이 하나가 면역 반응과 vasculature 사이의 인터페이스를 연구 수있는 독특한 사이트입니다. 이 준비를 사용하여 초점은 면역 반응, vasculature의 변경, 또는 둘 사이에 상호 작용에서 특별히 지시하실 수 있습니다. 모든 실험 방법과 마찬가지로 표준 intravital 현미경은 장점과 한계를 모두하고 있습니다. 준비가 여기에서 설명한 같은 표준 IVM은 쉽게 수정할 수 있으며, 이전에 형광 추적 염료의 도입이나 레이블이 붙은 세포 집단을 통해 epifluorescent 현미경을 허용하는 저자에 의해 증명되었습니다. 표준 IVM은 입체 영상의 가능성을 포기하고 두 광자 현미경이나 혈관 조영술에 의해 제공됩니다과 같은 추적하지 않지만, 세포 추적은 여전히​​ 휴대 전화와 휴대 vasculature 상호 작용 수 있도록 2 차원 이루어집니다 준수하고 계량 및 형광 항체로 - 생체내 관리 및 후속 얼룩과 함께 실시간으로 단백질 / 마커 표현에 대한 데이터를 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 특히, 대체 영상 기술은 이미지에 대한 정적 환경을 필요로하며 수술 영역이나 평평한 준비에 coverslip의 추가의 클램핑하는 것은 자주 필요합니다. 이 제한이 아니라면, 제거, 적극적으로 혈관 무결성 및 생리학 등 또는 IVM 준비 내에서 실시 vasodilation 실험 같은 다른 기술의 사용을 평가할 수있는 준비를 통해 혈관이나 다른 중재자를 perfuse 수있는 능력. 또한, 표준 IVM은 완전히 평평하게 준비를 필요로하지 않습니다와 같은 동물의 호흡에 의해 생성된 것과 움직임에 의해 영향을받지 않습니다. 이것은 표준 IVM은 더욱 재현성 더 많은 수술 분야에 사용할 수 있습니다. 이것은 여기에서 설명한 사타구니 림프절 준비에 의해 exemplified입니다. 림프절의 크기와 모양을 감안할 때, 준비가 조직을 손상없이 평평 만들 수 없으며, 노드의 위치는 동물의 호흡으로 인한 움직임에 상당한 상승을 제공합니다. 이러한 문제는 다른 방법으로 극복하기 어려울 것이지만, 쉽게 설명된 표준 IVM 준비를 사용하여 처리하고 있습니다. 요약 위의 세부 준비는 어떤 번호로 조합하여 사용할 수 있습니다 다른 생화학, 혈관, 및 / 또는 활성화의 하위 집합을 양도하거나 표시 셀, hypoxia의 유도, 그리고 혈관 중재자의 고갈 이상의 표현으로 면역 기술. 그러나, 추가적인 응용 프로그램은 초기 준비의 건강에 따라 달라집니다. 따라서, 항상 몇 군데와 평가되는 vasculature의 건강을 테스트하기 위해 매우 중요합니다. 건강 준비를 달성하기위한 핵심 포인트는 준비가 지속적으로 체온에서 equilibrated PSS와 perfused 및 수술 중에 수술 영역에 위치 연락처 및 스트레스를 최소화됩니다 확보하고 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th></tr><tr><td> 중탄산 </td><td> 시그마 알드리치 </td></tr><tr><td> 나트륨 염화물 </td><td> 시그마 알드리치 </td></tr><tr><td> 염화칼륨 </td><td> 시그마 알드리치 </td></tr><tr><td> 염화칼슘 이수화물 </td><td> 시그마 알드리치 </td></tr><tr><td> 나트륨 Nitroprusside </td><td> 시그마 알드리치 </td></tr><tr><td> Phenylephrine </td><td> 시그마 알드리치 </td></tr><tr><td> 아세틸콜린 </td><td> 시그마 알드리치 </td></tr><tr><td> 마그네슘 염화물 heptahydrate </td><td> 시그마 알드리치 </td></tr><tr><td> Pentobarbitol 나트륨 </td><td></td></tr></tbody></table>

intravital microscopy of the inguinal lymph node

체내에있는 임파선이 (LN의), 면역 체계의 중요한 구성 요소입니다. 그들은 그러므로 적응 면역 반응의 유도를위한 사이트로 봉사하고, 효과기 세포의 개발. 따라서 LNs가 침해 병원체와 싸우고과 건강을 유지하기 위해 열쇠입니다. 공부 LN의 선택은 접근하고 원하는 모델에 의해 결정되며 사타구니 림프 노드가 잘 위치하고 있으며 쉽게 피부와 성기 점막 감염 생물학 관련 모델의 연구를 지원합니다. 사타구니 LN, 모든 LNs 같이, 혈액으로 공급하는 광범위한 microvascular 네트워크 있습니다. 일반적으로,이 microvascular 네트워크는 높은 내피 venules (HEVs)를 피드 이후 지점과 LN의 주요 공급 arteriole를 포함합니다. HEVs는 항상성 및 감염 모두 동안 LN에 면역 세포의 인신 매매를 촉진을위한 전문입니다. HEVs 이러한 상황 모두에서 LN으로 거래를 규제하는 것은 얼마나 강렬한 탐구의 영역입니다. LN 피드 arteriole는 HEVs에 직접적인 영향을 업스트림 있으며 LN에 영양소와 세포 풍부한 혈액의 주요 공급됩니다. 또한 피드 arteriole의 변화는 적응 면역 반응의 유도를 촉진에 연루됩니다. LN microvasculature은 LN에 최적의 혈액 공급을 유지하고 적절한 LN 기능과 이후 면역 반응에 중요한 요소 LN로 면역 세포 유입을 규제의 명백한 중요성을했다. 생체내에서 LN microvasculature을 연구하는 능력은 면역 시스템과 microvasculature 상호 작용 및 LN 이내에 다른 영향을 어떻게 elucidating의 열쇠입니다. 여기, 우리는 사타구니 림프 노드의 생체내 이미징에 대한 방법을 제시한다. 우리는 건강한 혈관 연구, 몇 시간 동안 가능한 선박의 이미지를 유지하는 능력, 그리고 선박 규모의 부량을 보장 방법에 특히주의를 기울이고, LN의 microvasculature의 이미지에 중점을두고 있습니다. vasoactive 마약 microvasculature의 재관류뿐만 아니라 세포의 트래픽을 추적하고 계량 가능성에 대한 방법도 제시하고 있습니다. 사타구니 LN의 Intravital 현미경은 microvascular 기능과 면역 세포, LN, 그리고 엑기스 간의 직접적인 인터페이스의 실시간 인터페이스의 직접 평가를하실 수 있습니다. 많은 면역 기법과뿐만 아니라 다른 LNs의 vasculature 연구를 조작 형광 셀 라벨과 결합 될 가능성이 기술.

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Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

사타구니 림프절 (LN)의 intravital 현미경을 수행하기위한 기법이 설명되어 있습니다. 이러한 기술은 실시간으로 허용합니다<em&gt; 생체내에</em&gt; 항상성 및 감염 동안 모두 림프절의 microvasculature 및 구조 연구. 이 기술은 세포 인신 매매 연구 및 기타 림프절 사이트에 적용할 수 있습니다.

사타구니 림프 노드의 Intravital 현미경

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

intravital-microscopy-of-the-inguinal-lymph-node

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.9K 조회수.  University of Northern British Columbia. 사타구니 림프절 (LN)의 intravital 현미경을 수행하기위한 기법이 설명되어 있습니다. 이러한 기술은 실시간으로 허용합니다 생체내에 항상성 및 감염 동안 모두 림프절의 microvasculature 및 구조 연구. 이 기술은 세포 인신 매매 연구 및 기타 림프절 사이트에 적용할 수 있습니다.

비디오: Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

위드 필드와 공촛점 현미경과 Murine 림프절의 조각에서 T 세포의 생체내 이미징 전

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

연구

면역학 및 감염병학

Murine Superficial Lymph Node Surgery

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often followed over time. Similarly, the study of lymphocyte homeostasis requires time course experiments. Performing these studies within the same mouse is ideal to reduce the experimental variability as well as the number of mice used. Blood withdrawal allows performance of time course experiments, but it only gives information about circulating lymphocytes and provides a limited number of cells1-4. Since lymphocytes circulating through the body and residing in the lymph nodes have different properties, it is important to examine both locations. The sequential removal of lymph nodes by surgery provides a unique opportunity to follow an immune response or immune cell expansion in the same mouse over time. Furthermore, this technique yields between 1-2x106 cells per lymph node which is sufficient to perform phenotypic characterization and/or functional assays. Sequential lymph node surgery or lymphadenectomy has been successfully used by us and others5-11. Here, we describe how the brachial and inguinal lymph nodes can be removed by making a small incision in the skin of an anesthetised mouse. Since the surgery is superficial and done rapidly, the mouse recovers very quickly, heals well and does not experience excessive pain. Every second day, it is possible to harvest one or two lymph nodes allowing for time course experiments. This technique is thus suitable to study the characteristics of lymph node-residing lymphocytes over time. This approach is suitable to various experimental designs and we believe that many laboratories would benefit from performing sequential lymph node surgeries.

To follow the progression of an immune response over time within the same mouse, lymph nodes can be sequentially removed by surgery. Here, we describe how this technique can be performed.

Murine 외면적인 림프절 외과

In the field of immunology, to understand the progression of an immune response against a vaccine, an infection or a tumour, the response is often ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

비장의 Intravital 현미경 : 기생충 이동성 및 혈류의 정량 분석

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

마우스 오금 림프절의 Intravital 이미징

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Generation of Lymph Node-fat Pad Chimeras for the Study of Lymph Node Stromal Cell Origin

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the mechanisms governing its formation. Lymph nodes are always encapsulated in adipose tissue and we recently demonstrated the importance of this relation for the formation of lymph node stroma. Adipocyte precursor cells migrate into the lymph node during its development and upon engagement of the Lymphotoxin-b receptor switch off adipogenesis and differentiate into lymphoid stromal cells (B&#233;n&#233;zech&#160;et al.14). Based on the lymphoid stroma potential of adipose tissue, we present a method using a lymph node/fat pad chimera that allows the lineage tracing of lymph node stromal cell precursors. We show how to isolate newborn lymph nodes and EYFP+ embryonic adipose tissue and make a LN/ EYFP+ fat pad chimera. After transfer under the kidney capsule of a host mouse, the lymph node incorporates local adipose tissue precursor cells and finishes its formation. Progeny analysis of EYFP+ fat pad cells in the resulting lymph nodes can be performed by flow-cytometric analysis of enzymatically digested lymph nodes or by immunofluorescence analysis of lymph nodes cryosections. By using fat pads from different knockout mouse models, this method will provide an efficient way of analyzing the origin of the different lymph node stromal cell populations.

Generation of lymph node/fat pad chimeras for the study of lymph node stromal cell origin is described. The method involves the isolation of lymph nodes from newborn mice and embryonic fat pads, the generation of chimeric lymph node-fat pads, and their transfer under the kidney capsule of a host mouse.

The stroma is a key component of the lymph node structure and function. However, little is known about its origin, exact cellular composition and the ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

어린 싹 센터의 높은 해결의 intravital 스트라이프 - 조명 현미경

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

쥐과 림프절 기질 세포의 분리

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

다음 간 생체 내에 현미경 이미징<em&gt; 슈만 편모충</em&gt; 감염 : 간 혈류의 평가

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and E. coli, and are useful for the study of pathogenesis and/or spread of the bacteria in natural hosts. With the key function of lymph nodes in the host immune response, lymph node tissues serve as a potential source of RNA for downstream transcriptomic analyses, in order to assess the temporal changes in gene expression in cells over the course of an infection. This article presents an overview of the process of lymph node collection, tissue sampling, and downstream RNA processing in livestock, using cattle (Bos taurus) as a model, with additional examples provided from the American bison (Bison bison). The protocol includes information about the location, identification, and removal of lymph nodes from multiple key sites in the body. Additionally, a biopsy sampling methodology is presented that allows for a consistency of sampling across multiple animals. Several considerations for sample preservation are discussed, including the generation of RNA suitable for downstream methodologies like RNA-sequencing and RT-PCR. Due to the long delays inherent in large animal vs. mouse time course studies, representative results from bison and bovine lymph node tissues are presented to describe the time course of the degradation in this tissue type, in the context of a review of previous methodological work on RNA degradation in other tissues. Overall, this protocol will be useful to both veterinary researchers beginning transcriptome projects on large animal samples and to molecular biologists interested in learning techniques for in vivo tissue sampling and in vitro processing.

This protocol provides an overview of procedures for the isolation of RNA for the transcriptomic profiling of lymph node tissues from large animals, including steps in the identification and excision of lymph nodes from livestock and wildlife, sampling approaches to provide consistency across multiple animals, and considerations plus representative results for the post-collection preservation and processing for RNA analysis.

수집 및 RNA 분석에 대 한 큰 동물에서 림프절의 처리: 큰 동물 종의 림프 노드 Transcriptomic 연구에 대 한 준비

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...