우리는 C57BL / 6 B1-8 GFP 형질 전환 마우스를 제공하기위한 스트라이프 - 조명 방식, K. Rajewsky 및 A. Haberman의 개발 기간 동안 유익한 토론을위한 R. Heintzmann 감사합니다. 우리는 재정 지원에 대한 독일 부여 NI1167/3-1에서 Forschungsgemeinschaft (RN에), HA5354/4-1 및 SFB633, 프로젝트 A15 (AEH에) 부여 한 Rahel - 허쉬의 교제에서 샤리 (RN에)을 인정합니다. 우리는 특히 유익한 토론과 인프라 지원을위한 네트워크 JIMI을 인정

스트라이프 - 조명 TPLSM에 대한 멀티 빔 설치 여기서 사용 설치 이전 6,20 바와 같이, 특수한 멀티 빔 이광자 레이저 주사 현미경이다. 시스템은도 1에 도시되어있다. 접근법들은 단일 빔 주사를 수행하기 만 할 수있는 경우에도, galvoscanner 거울의 이동과 카메라의 획득을 동기화 할 수있는 다른 이광자 레이저 스캐닝 현미경에 적용 할 수있다 . 이 경우, 단점은 표준 PMT 기반 TPLSM의 수집 속도로 그러나 유사한 하부 수집 속도 일 것이다. 지금까지의 해상도와 콘트라스트 관한 한 최적의 품질을 달성하기 위해, 최저 및 광표백 광 손상 빠른 습득, 그것은 설치 프로그램의 다음 조정 단계를 참고하기를 권장합니다 : <ol><li> TISA 레이저의 레이저 파워를 확인 : 공장 출하 값과 previo과 비교, 100 %로 확인우리는 독서를 소유하고 범위 700-1,000 nm의에서 여기 파장 필요한 경우 그것이 그것을 사용합니다. </li><li> 티의 원격 제어 표시 테스트 : 사 빔 스플리터, 즉 0 %를 확인하고 100 % 설정. 100 % 남아있는 TISA 빔, 그리고 거기 확인하고 스테핑 모터 null의 위치를​​ 재설정합니다. TI는 : 사 빔 스플리터는 수직 빔의 경로에 수직 편광 레이저 빔 분할 하위 λ / 2 판과 편광판, 구성 하나가 여기에 대한 현미경으로 감독을, 다른 하나는 광 파라 메트릭 펌프하는 데 사용됩니다 발진기 (OPO). 자동으로 λ / 2 판, 티의 연속 조정 회전 : 사 및 OPO 전력을 각각 얻을 수있다. </li><li> 원하는 파장에 OPO를 조정하고, 출력 전력을 측정. 전원이 너무 낮은 경우 : 펌핑 파장을 최적화하고 일의 설정을 확인합니다 (티 W 4 사 레이저는 800 nm에서, 하나는 약 1,050-1,100 nm에서 OPO 빔의 W 0.8-1를 얻을 수 있어야합니다)전자 거울과 삼진 결정. OPO가 원하는 파장의 출력에서​​ 공진 전원이 증가 할 때까지 권장되는 최적의 차트 나 그래프를 자주 사용할 수있는 값, 다음 미세 조정을 선택합니다. <ol type="i"><li> 전원이 여전히 낮 으면, 넷 액세스 미러 조절 노브로 OPO의 접근이 거울을 조정한다. 아주 천천히, 그리고 아주 작은 움직임으로, 전면과 끝 거울 교대로이 단계를 수행합니다. </li></ol></li><li> 사 및 / 또는 OPO 빔이 적절한, 중앙 위치에서 항목 거울 조회수 : 티가 있는지 확인합니다. <ol type="i"><li> 사 광선 : 백서 (! 매우 반짝 또는 반영하지 않음)의 조각과 OPO 빔을 관찰하기위한 적외선 뷰어 및 더 높은 파장 티를 사용합니다. <ol type="i"><li> NIR 티 작업을 할 때 보호 안경을 착용 : 사 광선 (일반적으로 720-750 나노 미터까지의 평균 사람을 볼 수 있습니다). </li></ol></li><li> 미시간하도록 정렬 절차를위한 가능한 낮은 레이저 출력 (들)을 설정잠재적 인 눈 손상을 nimize. </li><li> 동공이 수축되도록 항상에 실내의 주변 조명을 유지합니다. </li><li> 사 빔이 스캔 헤드를 입력 : 레이저 파워 미세 조절 티 때 아직 적용되지 λ / 2 판과 편광판, 밖으로 구성된 감쇠기가 있음을 유의하십시오! </li></ol></li><li> 엔트리 포인트 다이어프램은 티타늄에 의해 중간에 명중되어 있는지 확인 : 사 및 / 또는 OPO 빔; 없는 경우, 레이저 빔이 스캔 헤드 들어가기 전에, 마지막 두 개의 거울을 조정한다. <ol type="i"><li> IR 뷰어 및 흰색 (반사 / 만 반짝하지!) 종이의 작은 조각을 사용합니다. </li><li> 레이저 빔의 위치가보다 정확하게 판단 할 수 있도록 항상 현미경 진입에 진동판을 닫는다. 중요 : 6 단계로 진행하기 전에 다이어프램을 다시하는 것을 잊지 마세요! </li></ol></li><li> 따라서 현미경에 반사 된 레이저 빔의 빛 경로를 조정합니다. 작은 세그먼트에서이 작업을 수행하고 반복적 인 빔 워싱턴을 수행lking. <ol type="i"><li> 대물 렌즈의 광 출력이 충분하지 않은 경우 전체 빛의 경로를 확인합니다. </li><li> 긴 유휴 기간, 주요 수리, 광학 요소의 교체 후 처음으로 시스템을 사용할 때는 항상 빛의 경로를 확인하거나 문제는 출력이 존재하는 것으로 의심되는 경우. </li></ol></li><li> 그들은 먼지 특히 것을, 모든 활성 광학 표면이 깨끗한 지 확인하십시오! 표면이 먼지 층으로 피복하는 경우, 파면 심지어 대물 렌즈를 입력하기 전에 왜곡 및 결과 레이저 빔은 샘플의 선명한 이미지를 제공하지 않을 것이다! <ol type="i"><li> 필요한 경우, 에탄올, 이소프로판올에 적신 렌즈 종이의 접힌 부분으로 거울을 청소합니다. </li></ol></li><li> 빔이 광 경로를 설정 한 후, 프리즘 기반 펄스 압축기의 끝에 직접 진입 미러 위에 위치 미러로 다시 도착한 것을 확인한다. 여기에서, 빔이 반사되어 나광 멀티플렉서 (BM) n을. </li><li> 레이저 빔은 광대역 50 % 투과 및 50 %의 반사를위한 요구에 맞도록 레이저 빔의 편광을 변경하는, 직접 λ / 2 판 전에 빔 멀티플렉서의 입구에 위치되어 다이어프램 나가면 체크 BM 내. <ol type="i"><li> 먼저 빔 위치를보다 정확하게 판단 할 수 있도록 조리개를 닫고 BM 항목에서 현미경 및 기타에 항목의 하나, 즉 두 개의 다이아 프램 사이 빔 산책을 수행합니다. 다른 하나의 빔 스캐닝 현미경 다이어프램은 XY 스캐너의 진입에 위치해야한다. </li><li> 빔 폐쇄 다운 개구의 중심에 충돌하지 않으면, BM 엔트리 조임 바로 앞에 배치 된, 상기 언급 된 거울을 조정한다. 중요 : 10 단계로 진행하기 전에 다이어프램을 다시하는 것을 잊지 마십시오. </li></ol></li><li> 다이어프램이 재개으로 레이저 빔이 BM 거울에 안타 있는지 확인자신의 중간 지점. BM의 복잡한 빛 경로의​​ 다른 부분을 차단하지 않도록 종이의 좁은 스트립을 사용하십시오! </li><li> 평행 편광에 대한 최고 거울 &quot;P&quot;, 수직 편광 &quot;S&quot;에 대한 바닥 거울 : 빔 출구 거울의 중앙을 명중 있는지 확인합니다. 그렇지 않으면, BM 전에 엔트리 거울을 조정한다. </li><li> &quot;S&quot;와 &quot;P&quot;는 편광 빔 그룹 편광판 큐브를 입력하고 XY 스캐너에 항목에서 적절하게 중첩 할 수 있는지 확인합니다. 경우에 다음과 같이 단일 빔 스캐닝 현미경을 사용하는 건너 뛰기. </li><li> 레이저 광은 중앙에서 스캔 및 튜브 렌즈를 통과하여 대물 렌즈 &#39;초점면의 중간을 통해 얻을 수 있는지 확인합니다. 중요 :이 단계는없는 주차 위치에서 중심 위치에 레이저 광을 수행되어야! <ol type="i"><li> 목표 도구 ( &quot;황소의 눈&quot;)와 대물 렌즈를 장착하고 레이저 빔이 중간에 대상을 안타 확인하고 있는지 여부조명도 있습니다. </li><li> 이 경우 것으로 보인다 경우, BM 전에 조리개를 닫고 원형의 간섭 패턴이 나타나는 경우 중간 (간섭 최소)에서 검은 색 원으로 확인합니다. <ol type="i"><li> 황소의 눈의 중심을 기준에 상당한 변화가있을 경우 항목의 미러를 조정합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 지금 20X 물 침지 렌즈로 예를 들어 대물 렌즈와 황소의 눈을 교체합니다. <ol type="i"><li> 흰색 종이로 출력 광 필드를 확인합니다. 이 밝고 균일하고 중앙에 위치해야합니다. </li><li> 출력 전력을 측정 : 100 % 티타늄을 펌핑 100 % OPO에 : 사 (4 W), 하나는 약 얻어야한다. (여기에 사용 된 현미경) 1,100 nm에서의 렌즈 후 100 ~ 150 mW의. 낮은 레이저 힘은 멀티 빔 SI-TPLSM을 수행하기에 충분하지 않습니다. 단일 빔 주사 SI-TPLSM의 경우, 5 ~ 10 ㎿가 충분합니다. 레이저 빔은 scanne 않고, 중앙 위치에 남아 있어야D! </li></ol></li><li> MB-SI-TPLSM을 수행하는 경우 다음과 같이 BM에 거울을 맞 춥니 다 : <ol type="i"><li> 무대에서 균일하게 형광 샘플, 예를 들어 적색 형광 슬라이드를 놓고 샘플 내부 만 (대물 렌즈 &#39;앞에 즉, 닫기) 표면 근처의 레이저 빔을 초점을 맞추고있다. </li><li> 멀티 빔 모드로 현미경을 설정하고 시작 부분에 빔의 수, 바람직하게는 하나의 빔, 편광, 예를 들어, &quot;P&quot;를 선택합니다. <ol><li> 형광 슬라이드 촬상하여 레이저 빔을 찾기 : 오픈 &quot;P&quot;셔터를 설정하고 빔을 포커싱하는 동안 연속적으로 CCD 카메라를 실행. </li><li> 빔이 중앙 위치에 있고, 스캐너의 전원이 꺼져있는 것을 확인하십시오. 빔이 검색되지 않습니다 있는지 확인합니다! </li><li> 카메라 칩의 중앙 부근에 밝은 반점을 찾아 빔을 찾을 수 있습니다. </li><li> 스폿이 화상면의, 즉 밝고 선명해질 때까지 상기 빔을 초점현미경은 카메라 칩의 위치에 대응하고; 스폿이 포화되지 않도록 레이저 출력을 감소시킨다. 잘 정렬 된 시스템이 레이저 전원이 한 빔 모드 (약 0.6 mW의 레이저 전원이 작동합니다)에서 작업 할 때 인근 이상이어야한다는 것을 의미한다. </li><li> 그 자리는 센터 떨어져 크게 경우, 앞의 BM (또는 단일 빔 스캔 스캐너를) 미러를 조정하여 가까운 센터로 이동합니다. </li><li> 또한, 즉 &quot;S&quot;빔 다른 편광을 정렬 할 때, 이제, 2 - 빔 모드로 전환 &quot;S&quot;셔터를 열고 만 &quot;S&quot;셔터가 열려있는 경우 (하나의 빔이 볼 수있는 빔의 위치를 검사 ). </li><li> 완료되면, 4 빔 모드로 전환하고 &quot;P&quot;편광 모드 ( &quot;P&quot;셔터 개방)를 사용합니다. 이제 두 빔릿가 나타납니다. </li><li> 두 빔릿 완벽하게 카메라의 뷰의 아래쪽 가장자리에 평행하고, 떨어져 2.8 μm의 수를 설정할 수 있도록 준비. <ol type="i"&gt; <li> 이들이 적절하게 정렬되지 않으면, BM의 제 1 미러를 조정한다. </li><li> 두 개의 빔이 음 분리와 완벽하게 수평으로 배열 2.8가 될 때까지 대신 거울을 이동하는 두 개의 주변 장치 나사를 사용, 중간에 나사를 정렬하지 마십시오. </li></ol></li><li> 이제 &quot;P&quot;편광의 8 - 빔 모드로 전환하고, 4 빔릿 2.8 UM에서 등거리이고, 이미지의 하부 에지에 평행하게 배치 될 때까지 제 BM 밀러 (도 빨간 점없이)를 조정한다. </li><li> 각각 32 빔 모드, 3, 4 BS 거울을 조정 - 16에서 반복합니다. SI-알고리즘, 간단한이 최소 - 최대 (힐로) 알고리즘되고,이 가정에 기초하기 때문에 빔릿 등거리이어야하는 것은 중요하다. </li></ol></li></ol></li><li> 불균일 한 구조, 예를 들어 크로스 스테인드 Convallaria 뿌리와 균일하게 형광 샘플을 교체합니다. <ol type="i"><li> w, 여기 빔의 주차 위치로 이동HICH는 일반적으로 스캐너 좌표, 예를 들어 (10,000 10,000)의 큰 값에 배치됩니다. </li><li> CCD 카메라와 함께 (멀티 빔) 이미지를 스캔합니다. 이미지가 선명한 유니폼과 직선이 나타나는지 확인합니다. </li><li> 이미지를 회전 것 같으면 카메라를 조정 : 이미지가 정리 될 때까지 (! 온유) 손으로 축 방향으로 수직 축을 중심으로 카메라 본체를 비틀어. </li></ol></li><li> 여기 패턴, 즉 줄무늬 화상을 생성하기 위해 스캐닝 프로세스를 제어하기 위하여 XY 스캐너를 시작. <ol type="i"><li> 멀티 빔 주사의 경우, 즉, Y 스캐너의 미러를 이동. 이차 줄무늬 화상을 생성하는 방식으로 빔릿 라인에 수직. </li><li> 단계 17.1에 설명 된대로 시야가 발생합니다. 빔 렛 라인이 두 배로 빔릿은 전체 라인을 따라 등거리되는 것을 보장하는 위치로 x-스캐너의 미러를 이동하여 스캔 루틴을 연장 너무 작다. 정확한 움직임을 반복합니다x-스캐너 미러는 스트라이프 확대 화상을 생성하는 이동 Y 스캐너 미러의 전후. </li><li> 원하는 스트라이프 화상을 생성 - 과학자에 의해 정의 - 단일 빔 주사의 경우, 등거리의 위치에 반복적으로 x-스캐너 미러 움직임-Y 스캐너 미러의 움직임을 번갈아. </li><li> 일정 속도 (감소 가속 / 감속)에 대한 Y-스캐너 거울 명령의 움직임과 최대 속도 (최대 가속 / 감속)의 X-스캐너 거울 하나에 사용할 수 있는지 확인하십시오. </li></ol></li><li> 자동으로 획득하고 카메라 (현장 검출기)와 스트라이프 이미지를 저장합니다. 따라서, 스캐너와 카메라를 동기화 및 마스터 트리거로 스캐너를 사용한다. </li><li> 줄무늬 화상을 취득 반복은 다음과 같이 다른 위치에서 x-스캐너의 미러를 이동하여 (프로토콜 17에 기재된 주사 프로토콜) <ol type="i"><li> 충분히 반복 단계 사이의 적절한 단계 길이 선택두 개의 연속 된 빔릿 (이 경우 2.8 μM 및 스캐너 미러의 하나의 단계가 25 nm의 동일) 사이의 거리를 커버하는 두 개의 연속 스트라이프 이미지; 조금 중복을 허용하는 것이 바람직 할 수 있으며, 추가로 0.3 ~ 0.4 μm의 즉. </li><li> 주어진 파장에서 측 방향 해상도 한계와 일치 값 x-시프트를 설정한다. 예를 들어, 이동, 12 또는 13 교대 당 X-스캐너 거울의 10 단계를 사용하여지도에 가장 축이 시스템의 측면 해상도 결과 모두. 번호가 사용되는 시스템에 가장 적합한 구조화 된 슬라이드, 예를 들면 Convallaria 뿌리 슬라이드, 확인하십시오. </li><li> Convallaria 이미지가 선명해질 때까지이 두 값을 최적화 : 계산 된 SI 이미지에서 라인 프로파일 도구를 사용하여 라인 프로파일 (Convallaria 세포벽에서 형광 신호이다)의 폭과 비교. </li><li> 스캐너의 움직임과 동기화 각 스트라이프 이미지를 획득하여 따로 저장, 예를 들어, </EM&gt; TIFF 또는 이진 파일로. </li></ol></li><li> 평가 루틴의 행렬, 즉 3 차원 매트릭스로 줄무늬 이미지의 전체 집합을 열고 고해상도 SI-이미지의 2D 매트릭스를 생성하는 최소 - 최대 알고리즘 또는 푸리에 변환 알고리즘 중 하나를 사용합니다. 알고리즘은 이전에 세부 (20)에 설명했다. </li></ol> 의 intravital 이미징 마우스 예방 접종 및 준비 동물 실험은 동물 복지 (LAGeSo, Landesamt FÜR 아퍼 싶게 Soziales, 베를린)에 해당하는 국가위원회에 의해 승인되었고, 현재의 지침과 규정 (동물 실험 라이센스 G0153/08)에 따라 수행되었다. <ol start="21"><li> 4 전에 설명한대로 오금 림프절 및 이미징 필드의 제조에서 본원 중심 응답 유도를 수행 하였다. immunomagnetically의 비장에서 B 세포를 정화 B1-8 + / + Jκ - / -와 B1-8 + / + Jκ의 B 세포 - / - GFP + 마우스. </li><li> / - + / - + Jκ ⅛ B1-8을 사용하여&gt; 95 %의 순도로 정맥 3 × 106 NP 특정 B 세포를 주입 GFP + 및 ⅞ 비 형광 B1-13 + / + Jκ - / - C57BL / 6받는 소재 . </li><li> 셀 전송 후 어느 날 NP-CGG 오른쪽 뒷다리 음식 패드에 완전 프로 인트 아쥬 반트 (CFA) 유화 (니트로 페닐 - 닭 ɣ 글로불린)의 10 μg과받는 사람 면역. </li><li> ATTO590 - 숙신 에스테르와 anti-CD21/CD35 항체의 라벨 Fab 단편. <ol type="i"><li> , 생체 내에서 싹 센터에서 여포 수지상 세포의 네트워크 (FDC)을 강조의 intravital 분석이 수행되기 전에 쥐 12 ~ 24 시간의 오른쪽 뒷다리 발바닥에 형광 색소 표지 Fab 단편의 10 μg을 주입합니다. </li></ol></li></ol> 다음 단계는 conside해야의 intravital 이미징을위한 오금 림프절 (하루 8 ~ 10 예방 접종 후)의 준비를 위해 빨간색 : <ol start="25"><li> 케타민 / 자일 라진의 IP 주입, 자신의 체중에 따라 양에 마우스를 마취. </li><li> 전체적인 촬상 기간 동안 마취 깊이를 모니터링하기 위해 테스트 반사. </li><li> 다시 다리, 엄격한 마우스의 오른쪽 측면을 면도하고 완전하게 남아있는 머리카락을 제거하기 위해 제모 크림을 사용합니다. </li><li> 주요 우측 대퇴 전자 수정 : 손가락 뼈 칩을 찾은 작은 흰색 삼각형 모양의 밴드가 나타날 때까지 가위로 작은 피부 절개를 설정합니다. </li><li> 제한 기의 날카로운 핀셋이 근막 아래 뼈 칩을 클램프. </li><li> 이빨 핀셋을 사용하여 요추 영역에서 척추를 고정합니다. </li><li> 제한 수단을 마우스 오른쪽 뒷다리를 고정하고 나사를 조입니다. </li><li> 올바른 위치에있는 다리를 유지하는 테이프의 꼬리. </li><li> 허벅지의 꼬리 측면에서, 지역 유명 슬와 정맥 차가운 제품으로, 피부에 절개를 만들RS 조직, 무딘 핀셋 기본 조직으로부터 피부를 분리하고 말단에 인접한에서 슬와 정맥을 따르십시오. </li><li> 무딘 집게를 사용 림프절을 노출 (노출 동안 PBS에서 림프절을 계속) 미세 림프관을 보호하기 위해 절단 피하려고. </li><li> 림프절 주위에 진공 그리스의 원형을 만들어, PBS에이 웅덩이를 입력합니다. </li><li> 그 위치에 커버 슬립을 넣고 온도계 프로브 (그렇지 않으면 셀 속도가 극적으로 변화 할 것이다, 37 ° C 온도에서 보관) 놓습니다. </li><li> 커버 슬립의 위쪽 가장자리를 따라 진공 그리스의 원을 추가합니다. </li><li> , 진공 그리스에서의 위치에 가열 코일을 넣어 이전과 비슷한 방식으로 실을 만들고 목표로 찍어 유리 커버 슬립에 물 / PBS를 추가합니다. </li><li> 치사량에 케타민 / 자일 라진의 투여 량을 증가하고있는 동안 촬영 한 후, 마우스는 자궁 경부 전위 다음으로, 마취에 보관됩니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Siffrin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+partially+reversible+th17+cell-induced+neuronal+dysfunction+in+the+course+of+encephalomyelitis.">In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis.</a> Immunity. 33 (3), 424-436 (2010).</li><li>Esplugues, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Th17+cells+occurs+in+the+small+intestine.">Control of Th17 cells occurs in the small intestine.</a> Nature. 475 (7357), 514-518 (2011).</li><li>Hauser, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+germinal-center+B+cell+migration+in+vivo+reveals+predominant+intrazonal+circulation+patterns.">Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns.</a> Immunity. 26 (5), 655-667 (2007).</li><li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choreography+of+cell+motility+and+interaction+dynamics+imaged+by+two-photon+microscopy+in+lymphoid+organs.">Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).</li><li>Herz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+two-photon+intravital+microscopy+to+the+infrared+by+means+of+optical+parametric+oscillator.">Expanding two-photon intravital microscopy to the infrared by means of optical parametric oscillator.</a> Biophys. J. 98 (4), 715-723 (2010).</li><li>Hell, S. W., Rittweger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy:+Light+from+the+dark.">Microscopy: Light from the dark.</a> Nature. 461 (7267), 1069-1070 (2009).</li><li>Ding, J. B., Takasaki, K. T., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supraresolution+imaging+in+brain+slices+using+stimulated-emission+depletion+two-photon+laser+scanning+microscopy.">Supraresolution imaging in brain slices using stimulated-emission depletion two-photon laser scanning microscopy.</a> Neuron. 63 (4), 429-437 (2009).</li><li>Bianchini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-wavelength+two-photon+excitation+-+stimulated+emission+depletion+(SW2PE-STED)+super-resolution+imaging.">Single-wavelength two-photon excitation - stimulated emission depletion (SW2PE-STED) super-resolution imaging.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (17), 6390-6393 (2012).</li><li>Berning, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscopy+in+a+living+mouse+brain.">Nanoscopy in a living mouse brain.</a> Science. 335 (6068), 551 (2012).</li><li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+doubling+in+live,+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy.">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9, 749-754 (2012).</li><li>Gu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advanced optical imaging. , (2001).</li><li>Cha, J. W., Ballesta, J., So, P. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shack-Hartmann-wave+front-sensor-based+adaptive+optics+system+for+multi-photon+microscopy.">Shack-Hartmann-wave front-sensor-based adaptive optics system for multi-photon microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 15 (4), (2010).</li><li>Booth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+in+microscopy.">Adaptive optics in microscopy.</a> Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 2829-2843 (2007).</li><li>Niesner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+single+and+multibeam+two-photon+microscopy+for+high-resolution+and+high-speed+deep+tissue+and+intravital+imaging.">The power of single and multibeam two-photon microscopy for high-resolution and high-speed deep tissue and intravital imaging.</a> Biophys. J. 93 (7), 2519-2529 (2007).</li><li>R&#252;ckel, M., Mack-Bucher, J. A., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+wave-front+correction+in+TPM+using+coherence-gated+wave-front+sensing.">Adaptive wave-front correction in TPM using coherence-gated wave-front sensing.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17137-17142 (2006).</li><li>Tang, J., Germain, R. N., Cui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superpenetration+optical+microscopy+by+iterative+multiphoton+adaptive+compensation+technique.">Superpenetration optical microscopy by iterative multiphoton adaptive compensation technique.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (22), 8434-8439 (2012).</li><li>Ji, N., Milkie, D. E., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+via+pupil+segmentation+for+high+resolution+imaging+in+biological+tissues.">Adaptive optics via pupil segmentation for high resolution imaging in biological tissues.</a> Nat. Methods. 7, 141-147 (2009).</li><li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+laser+scanning+microscopy+through+spatiotemporal+modulation.">Super-resolution laser scanning microscopy through spatiotemporal modulation.</a> Nano Lett. 9 (11), 3883-3889 (2009).</li><li>Andresen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+intravital+microscopy.">High-resolution intravital microscopy.</a> PLoS ONE. 7 (12), (2012).</li><li>Debarre, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+for+structured-illumination.">Adaptive optics for structured-illumination.</a> Opt. Exp. 16 (13), 9290-9305 (2008).</li></ol>

폴커 안드레 독일 LaVision 바이오텍 GmbH의 빌레펠트의 주주입니다. 다른 저자는 이익의 충돌이 없습니다.

의 intravital 광학 영상의 목적은 동적으로 기능적 조직과 건강과 질병 5 장기의 기능을 이해하기 위해 세포 운동성 및 상호 작용을 시각화하는 것입니다. 이러한 다중 광자 레이저 주사 현미경을 달성하기 위해 가장 강력한 기술은, 아직, 그 공간 해상도를 제한 전면 왜곡 산란 느린 취득 photobleaching에 및 광 손상을 거절 관련된 한계를 극복 대조뿐만 아니라 시간 해상도를 가지고 . <p clas...

두 광자 레이저 스캐닝 현미경 (TPLSM)는 적외선 초단 펄스 여기 1 관련 깊은 조직 이미징을위한 장점과 함께, 각종의 운동과 상호 작용 패턴을 공개하여 단일 세포 수준에서 중요한 프로세스에 대한 우리의 관점을 혁명 동물에게 2-5 살아있는 세포의 부분 집합. 그러나, 현재의 기술은 건강과 질병에있는 조직 내에서 세포 반응의 분자 기초에 대한 전용 스파 스 정보를 렌더링하기 때문에, 새로운 치료 전략을 개발하기위한 전제 조건으로 장기의 기능과 장애의 메커니즘을 규명하는 것은 여전히​​ 불충분하다. 현재의 기술은 산란에 의한 수백 미크론의 공간 만 창을 가능하게하고, 공간 해상도 및 성인 동물의 매우 컴팩트 한 조직에서 특히 명백하다 신호대 잡음비 (6), 프런트 왜곡 효과 거절. 이러한 산란 및 파면 왜곡 효과는 매우 이질적인에 기인3D 공간 해상도의 깊이 의존 열화에 대한 첫 번째 단계에서 주요한 조직의 굴절률 이방성의 디 분포, 그리고 마지막 탄도 여진 광자, 신호 대 잡음비의 손실이 예에서 발생 된 신호의 총 손실이다. bioscientific 의치 깊은 조직 애플리케이션의 관점에서, 이는 신호 대 잡음비의 감소가 시스템을 간과하는 결과가 발생하는 반면 해상 불량 거짓 양성 상호 작용을 초래할 것이기 때문에 현재의 기술이 명백하게 셀룰러 통신을 공개 할 수없는 것을 의미 희미한 구조 사이의 상호 작용. 명백하게 동적 방식으로 셀룰러 상호 작용을 검출하기 위해, 높은 공간 해상도 향상 깊은 조직 내에서 필요하다. 예 특수 수치 알고리즘 제 여기 상태의 고갈에 예를 들면 구조 조명 접근법에 기초하여 현재 도입 강력한 nanoscopy 기법 </em&gt; STED, RESOLFT, 또는 분자 현지화에, 예를 들면 dSTORM, PALM은 고정 된 세포뿐만 아니라 라이브 세포 배양 7에서 여러 응용 프로그램을 발견했다. 그러나, 조직 섹션, 생체 조직과 유기체에 이러한 응용 프로그램을 확장하기 위해 우리는 여전히 심각​​한 기술적 인 어려움을 극복해야합니다. 이광자 여기에서는 서로 다른 파장으로뿐만 아니라 여기에 대한 단일 파장 (sw2PE-STED)로 STED 및 배출 동일에서 각각 매립 셀 09과 뇌 조각 8 또는 인공 매트릭스에서 측 방향 해상도를 향상시키기 위해 적용된 자극 표준 TPLSM으로 축 해상도. 하나의 광자 STED를 사용하여, 돌기 쪽의 역학은 67 내지 10 nm의 해상도에서 생활 Thy1 EGFP 마우스의 뇌 피질 (최대 15 μm의 깊이)의 표면에 이미지가 될 수있다. 발달 생물학을위한 다양한 도구를 두 배 향상 차원을 제공하는 다 초점 구조화 조명 현미경에 의해 제공됩니다해상도. 그러나,이 기술은 단지 이러한 제브라 피쉬 배아 (11)로서 광 산란 낮은 성향 유기체에서 사용될 수있다. 그러나 이러한 기술 중 어느 것도 출산 후 증상과 질병의 생물 의학 및 임상 연구에 중요한 모델입니다 마이크로 미터의 수백에서 성인 동물의 높은 산란 조직에 적용 할 수 없습니다. 점 분포 함수 (PSF), 즉 회절 한정 파면 형상을 계산하는 데 사용되는 근사 독립, 렌즈를 포커싱 한 후, 광축 (축선 방향 해상도)을 따라 PSF의 폭보다 적어도 세 배 더 크다 광축 (측 방향 해상도) (12)에 수직 인 PSF 폭. 상당히, 특히 눈을 따라 훨씬 더 큰 PSFS, 선도 깊은 조직 이미징에 초점을 맞춘 전자파의 파면 형상을 수정 니케 계수에 의해 정량화 다른 순서의 앞에 왜곡 웨이브알은 13 ~ 15 축. 따라서, 회절 법 및 파면 왜곡 효과 모두는 깊은 조직 이미징 제한 요소로서, 광축을 따라 해상도를 가리. nanoscopy 기술이 회절 한계를 반작용 초점 반면 만, 축 방향 해상도 및 회절 파면 왜곡 효과를 모두 반작용에 의해 콘트라스트를 향상시키는 기술은 고해상도의 intravital 이미징을 위해 필요하다. 이상적으로,이 기술은 충분히 빨리 세포 역학의 모니터링을 허용 할 수도 있어야한다. PSF의 수차 및 TPLSM에 적응 광학을 사용하여 대비 손실의 실시간 보정이 광범위하게 연구 및 지난 십 13,14,16-18 개선하고 따라서 탄도 여기의 더 나은 관리에 이르는 최선의 현재의 선택을 한 14 광자. 아직도 인해 대부분의 전면 수정이 적응 광학에 사용되는 접근법 파도는 사실을 반복하고 그들이 하 것이있다인해 조직의 굴절률의 높은 이질성으로 작은 면적 (거의 없음 10 × 10 ㎛ 2)을 반복 할 적이, 수집 속도는 촬상 세포 운동성 및 통신을 위해 필요한 것보다 훨씬 낮다. 또한, 적응 광학의 물리적 한계는 TPLSM 여전히 회절에 의해 결정됩니다 향상. 조명 (SPIN) 및 검출 측 (SPADE)의 시간적 공간적으로 변조 된 변조 이론적 해상도를 향상시키기 위해 레이저 주사 현미경에 적용하는 것이 제안되어왔다. 의 intravital 영상에서의 실용적인 응용 프로그램은 여전히 19을 입증 할 수 남아 있습니다. 이와 함께, 성인 살아있는 동물의 깊은 조직 영상의 해상도 향상 기술의 개발에 대한 높은 수요가있다. 본 연구에서, 우리는 멀티 빔 스트라이프 - 조명 다중 광자 레이저들에서 스캐닝 과정을 제어함으로써, 여기 패턴의 공간 변조를 달성통조림 현미경 (MB-SI-MPLSM) 20. 여기 빔 단면이 공간적으로 변조 된 구조화 된 조명 방식, 반대로, 우리는 여기의 공간 변조를 달성하기 위해 단지 스캐닝 과정을 사용한다. 긴 파장으로 여기를 확장하여, 우리는 독립적으로 광 중에서, 높은 조직 (예, 림프절, 자유 산란 경로 47 μM 6) 비산 깊은 조직에서의 공간적 해상도 및 신호대 잡음비를 모두 향상시킬 수있다 우리가 감지 비선형 신호, 예를 들어, 형광, 두 번째 고조파 발생 또는 다른 주파수 현상을 혼합. 900 nm의 최대 여기 파장에서이 방법을 사용하여 우리는 마우스 림프절의 싹 센터에서 몇 분자의 규모에 동적으로 이미지 세포 단백질 구조 할 수 있습니다. 따라서, 우리는 더 나은 항 프로빙 프로세스에 모낭 수지상 세포 및 B 세포의 표면에서 항원 운반 유닛 간의 상호 작용을 시각화 할차 림프 기관의 면역 반응 중에 세대.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">ATTO590 &#8211; NSH for coupling</td>
			<td style="width:99px;">ATTO Tec, Germany</td>
			<td style="width:119px;">AD-590-35</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">CD21/35 &#8211; Fab fragment &#8211; ATTO590</td>
			<td style="width:99px;">DRFZ, Berlin</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">The coupling reaction was performed in the central lab of our institution.</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">B1-8 Jk-/- EGFP+</td>
			<td style="width:99px;">Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">Can be also found at Jackson Laboratories (JAX).</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment&#160;</td>
			<td style="width:99px;">StemmCell Technologies, Germany</td>
			<td style="width:119px;">19854</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Polystyren beads (605), 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:99px;">Life Technologies, Germany</td>
			<td style="width:119px;">F8803</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:99px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">TriMScope I</td>
			<td style="width:99px;">LaVision Biotec, Bielefeld, Germany</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">OPO (manual version)</td>
			<td style="width:99px;">APE, Berlin, Germany</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II</td>
			<td style="width:99px;">Coherent, Duisburg, Germany</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">water-immersion objective lens, 20x, NA 0.95, IR, WD 2 mm</td>
			<td style="width:99px;">Olympus Germany, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:167px;">-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly resolved intravital striped-illumination microscopy of germinal centers

의 intravital 깊은 조직 다 광자 현미경으로 세포 통신을 모니터링하는 것은 건강과 질병에있는 두꺼운 조직 샘플 및 기관 내에서 면역 세포의 운명을 이해하기위한 열쇠입니다. 다 광자 현미경의 주사 패턴을 제어하고 적절한 수치 알고리즘을 적용하여, 우리는 더 나은 축 해상도 및보다 향상된 신호대 잡음비, 즉 콘트라스트를 3 배 달성 저희 활성화하는 스트라이프 - 조명 방식을 개발 표준 다 광자 현미경에 비해 높은 림프 기관의 조직을 산란 내에서 100 μm의 조직 깊이. 촬상 깊이 인해 전계 감지기의 사용에 약간 낮았다 반면 수집 속도뿐만 아니라 광표백 광 손상 및 효과는 표준 광 곱셈기 기반의 기술과 유사했다. 스트라이프 - 조명 방식을 사용함으로써, 우리는 보조 모낭 수지상 세포에 면역 복합체 침착의 역학을 관찰 할 수있다 ̵1; 본원 센터에서 몇 가지 단백질 분자의 수준에서.

림프절의 공간 해상도 효과적인 점 확산 함수 (EPSF)의 치수는 현미경 (12)의 공간 해상도에 대응한다. 우리는 (CCD 카메라에 의한) 설립이 광자 레이저 스캐닝 현미경 기술, 즉, 전계 검출 TPLSM에 비해 트립 MB-SI-TPLSM 의해 림프절에서 콜라겐 섬유의 제 고조파 발생 신호를 획득하여이 삼차원 함수를 측정하고, 포인트 검출 TPLSM (PMT의에 의해). 이?...

Watch this Scientific Journal Video about Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers at JoVE.com

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

성체 마우스의 림프절에서 120 ㎛의 깊이까지의 향상된 콘트라스트와 높은 해상도의 intravital 촬상 공간적 다중 초점 이광자 현미경의 여기 패턴을 변조함으로써 달성된다. 100 μm의 깊이에서 우리는 따라서 산란 및 회절 한계를 우회, 487 ㎚의 해상도 (측면) 및 551 nm의 (축 방향)을 측정 하였다.

어린 싹 센터의 높은 해결의 intravital 스트라이프 - 조명 현미경

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

highly-resolved-intravital-striped-illumination-microscopy-germinal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K 조회수.  Leibniz Institute.  성체 마우스의 림프절에서 120 ㎛의 깊이까지의 향상된 콘트라스트와 높은 해상도의 intravital 촬상 공간적 다중 초점 이광자 현미경의 여기 패턴을 변조함으로써 달성된다. 100 μm의 깊이에서 우리는 따라서 산란 및 회절 한계를 우회, 487 ㎚의 해상도 (측면) 및 551 nm의 (축 방향)을 측정 하였다. 

비디오: Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

사타구니 림프 노드의 Intravital 현미경

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

연구

면역학 및 감염병학

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

추적 호중구 Intraluminal 크롤링, Intravital 비디오 현미경에 의한 조직의 Transendothelial 마이 그 레이션 및 Chemotaxis

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

비장의 Intravital 현미경 : 기생충 이동성 및 혈류의 정량 분석

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

다음 간 생체 내에 현미경 이미징<em&gt; 슈만 편모충</em&gt; 감염 : 간 혈류의 평가

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

표면에 인간의 노로 바이러스의 검출을위한 면봉 표본 추출 방법

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, including cell biology, oncology, dentistry, and immunology. The SMG is an exocrine gland comprised of secretory epithelial cells, myofibroblasts, endothelial cells, nerves, and extracellular matrix. Dynamic cellular processes in the rat and mouse SMG have previously been imaged, mostly using inverted multi-photon microscope systems. Here, we describe a straightforward protocol for the surgical preparation and stabilization of the murine SMG in anesthetized mice for in vivo imaging with upright multi-photon microscope systems. We present representative intravital image sets of endogenous and adoptively transferred fluorescent cells, including the labeling of blood vessels or salivary ducts and second harmonic generation to visualize fibrillar collagen. In sum, our protocol allows for surgical preparation of mouse salivary glands in upright microscopy systems, which are commonly used for intravital imaging in the field of immunology.

We describe a protocol to surgically expose and stabilize the murine submandibular salivary gland for intravital imaging using upright intravital microscopy. This protocol is easily adaptable to other exocrine glands of the head and neck region of mice and other small rodents.

똑바로 Intravital 현미경 Murine Submandibular 침 샘의 준비

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

영상 셀 상호 작용 Tracheal 점 막에서 2 광자 Intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여 인플루엔자 바이러스 감염 중

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...