이 작품은 의학의 웨이크 포레스트 대학과 공동 연구 계약에 따라 RJ 레이놀즈 담배 회사 (RJRT)에 의해 자금을 지원한다. GL 프라 사드는 RJRT의 풀 타임 직원입니다.

참고 : 동의서 본 연구를 수행 할 수는 좋은 임상 사례 당, IRB 승인에 따라 지역 임상 연구 단위에서 얻었다. 피 처리는 다른 PBMC를 세포 배양 실험의 분리 미생물 살균 용품 및 시약을 사용하여, 멸균 조건 하에서 수행된다. 1. WS-CM 준비 <ol><li> 이전 12 설명 된대로 WS-CM을 생성합니다. <ol><li> 35-60-2, 용액에 퍼프 볼륨 초에 퍼프 간격, 퍼프 기간 로즈웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 다음과 같은 금연 요법을 사용하여 페놀 레드없이 1640 매체를 통해 네 3R4F 참조 담배에서 연기를 전달하여 WS-CM을 준비 각각 초에. 각각의 혼합물은 20 ml의 샘플을 생성합니다. </li></ol></li><li> 날짜, 완료 시간, 담배 이름과 번호와 레이블 튜브 (들). -80 °에서 500 ㎕를 분주 즉시 흡연이 완료된 후에 C 보관하십시오. </li><li> 냉동 WS의 분취 량을 분석앞서 설명한 바와 같이 12-㎝ 니코틴, 담배 특이 니트로사민, 다환 방향족 탄화수소의 농도를 결정한다. </li></ol> PBMC를 2. 분리 <ol><li> (담배 제품이 아닌 소비자 있습니다) 건강한 기증자로부터 신선한 혈액을 수집 웨이크 포레스트 침례 건강 IRB (15)는 별도의 승인에 따라 아래와 같이 신선한 혈액에서 PBMC를을 분리합니다. <ol><li> 혈액 가방의 도착 이전에, 500ml의 병, 가위, 분리 버퍼, 그리고 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (DPBS) (RT) 바이오 안전성 레벨 2 (BSL-2) 세포 배양 후드에서 준비를해야합니다. 격리 버퍼 빛으로부터 보호되어야한다. </li><li> 거꾸로 혈액 가방을 잡고 그냥이 튜브의 최소 3cm를 떠나 고정 된 경우 아래의 튜브를 잘라. </li><li> 500㎖의 병 뚜껑을 제거하고 병 구멍 위의 튜브를 개최합니다. 혈액 가방을 들고 피가 t에 가방에서 자유롭게 흐를 수 있도록하는 데 반전가방이 비어있을 때까지 그는 병입니다. 피가 거품을 만들지 않도록 똑바로 아래로 대 병의 내부 벽에 흐르게. </li><li> 혈액에 격리 버퍼의 5 비율 : 1의 병에 격리 버퍼를 따르십시오. 엔드 오버 엔드, 10 배, 단단히 병을 씌우고 조심스럽게 반전. 실온에서 1 시간 동안, 조명 오프 배양 세포 배양 후드에서 병을 둡니다. </li><li> 라이트, 밀짚 색의 층은 혈액 위에 구축됩니다. 50 ML 원뿔 튜브에 25 ml의 혈청 학적 피펫을 사용하여이 레이어를 제거합니다. 혈액을 기증 피사체에 따라, 300 ml의 - 수집 된 금액은 50 다를 수 있습니다. </li><li> RT에서 10 분 동안 200 XG에서 튜브를 원심 분리기. </li><li> 어두운 혈액 색의 펠렛을 떠나, 반투명 뜨는을 대기음. 펠렛이 느슨하지만 점성이 될 것입니다. </li><li> 피펫 15ml의 원뿔형 튜브에 차단 완충액 3 ㎖. </li><li> 재현 탁 펠렛까지의 수집 담황색 액체의 모든 50 ㎖에 대한 DPBS 20 ㎖를 추가2.1.5 TEP. 소용돌이는 철저하게 혼합, 여러 관에서 재현 탁 액체를 통합합니다. 이 액체는 혈액 세포를 일시 중지 포함되어 있습니다. </li><li> 전달 피펫, 단계 2.1.8에서 분리 완충액 3ml를 상 전사 현탁 혈구 5 mL를 가진. 두 개의 레이어를 만들 천천히 조심스럽게 세포 현탁액을 포함하는 15 ML 원뿔 튜브를 기울입니다. 최소한의 가속 및 브레이크없이 실온에서 40 분 동안 400 XG에 튜브를 원심 분리기. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브로 된 PBMC를 포함하는 결과 흐린 중간 계층 (버피 코트)를 제거하기 위해 전송 피펫을 사용합니다. 그 아래에 다른 명확한 그리기 계층 마십시오. 각 50 ML 원뿔 관에 25 개 미만 mL로 전송합니다. </li><li> 세포를 씻어 (50 ML 원뿔 튜브의 전체 잔량을 채우기 위해 또는 그 이상)의 차가운 버퍼의 25 ML을 추가합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 400 XG에서 세포를 원심 분리기. </li><li> 유동 완충액 10 ml로 펠렛을 재현 탁. 이 PBMC를 포함되어 있습니다. 세포를 세어 메신저를 사용당하지 나 장소를 동결 얼음에. </li></ol></li></ol> 3. 냉동과 PBMC를 녹고 <ol><li> 원심 분리기 400 x g에서 10 분 동안 단계 2.1.13에서 수집 한 PBMC는. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 이소 프로필 알코올 냉동 컨테이너를 입력합니다. 주의 : 이소 프로필 알코올은 가연성 및 급성 독성. </li><li> 20 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)를 함유하는 RPMI 1640 배지 (39 °의 C)와 펠렛을 재현 탁. 이 동결 RPMI 1640 배지이다. 약 5 × 107 세포 / ㎖를 갖는 현탁액을 초래할 것이다 매체 동결 양 펠렛을 재현 탁. 동결 가능한 세포의 수는 달라진다. </li><li> 2 ML의 cryotubes에 세포 현탁액 1 ml의 분량을 분배하고 냉동 컨테이너 cryotubes를 배치합니다. O / N를 저장하고 cryotubes를 제​​거하고에 저장 전송 -80 ° C에서 냉동실에 cryotubes와 냉동 컨테이너를 배치-190 ° C -150 ° C 사이의 극저온 냉동기. </li><li> 극저온 저장 부로부터 cryotube을 제거하고 37 ℃ 수조에서 교반과 함께 급속 해동. </li><li> 즉시 10 % FBS, 1 % 펜 / 연쇄상 구균과 1 % L- 글루타민을 함유하는 10 ml의 RPMI 1640 완전 배지 (4 ° C)와 15 ML 원뿔 튜브에 cryotube에서 해동 한 PBMC를 전송합니다. 해동 cryotube의 내용은 최대 세포 생존 (15)을 얻기 위해 가능한 한 빨리 전송 될 것이다. </li><li> 10 분 동안 400 XG에서 PBMC를 원심 분리기. </li><li> 5 ㎖의 RPMI 1640 배지로 완전한 펠렛을 재현 탁하고 세포를 카운트. </li><li> 이러한 트리 판 블루 배제 방법으로 확립 된 방법으로 세포 생존 능력을 측정합니다. 95 % - 일반적으로이 방법으로 세포 생존율은 약 90이다. PBMC를 이제 실험에 사용 준비가 된 것입니다. </li></ol> 4. 세포 사멸 결정 참고 : 여기에 나열된 희석이 스​​투의 목적을 위해입니다DY. 희석 따라 변경 될 수 있습니다. <ol><li> 100 ㎕의 총 부피로 RPMI 완전 배지를 사용하여 96- 웰 플레이트에서 WS-CM 또는 니코틴 희석 / 웰, 이하 나타낸 바와 같이. </li><li> 다음 농도에 WS-CM 희석 : 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2, (WS-CM에서 니코틴 함량을 기준으로) 등차 니코틴 단위의 2.5, 3, 4, 및 5 ㎍ / ㎖의 12. </li><li> 다음 농도로 RPMI 배지에서 니코틴 희석 : 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 및 3000 ㎍ / mL로. 주의 : 니코틴은 급성 독성 및 환경 위험합니다. </li><li> 웰 1 × 106 세포의 농도로 / 각 웰에 RPMI 완전 배지에 현탁 한 PBMC 100 ㎕를 추가한다. 셀 플러스 WS-CM 또는 니코틴의 총 부피는 200 μL / 잘 될 것입니다. </li><li> 이 연구의 목적으로, 전술 한 바와 같이 두 세트의 플레이트를 준비한다. 판을 덮고 24 시간, 37 ℃에서 3 시간, 5 % CO 2에 대한 하나의 판에 대해 하나의 판을 배양한다. 필요에 따라 시점을 조정합니다. </li&gt; <li> 얼음 차가운 버퍼 200 μL와 세포를 재 부유 마지막 3 분 동안 300 XG에서 원심 분리 상층 액을 흡입, 커버 플레이트와 함께 접시의 바닥을로 소용돌이 실온에서 세포를 씻고 세척 단계를 한 번 더 반복한다. </li><li> / 잘 100 μL의 총 부피에 대한 각 웰에 7 aminoactinomycin의 D (7AAD)의 5 μL 다음 버퍼를 실행하는 95 μl를 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 어두운 데에서 인큐베이션 플레이트. </li><li> 클러스터 튜브에 버퍼를 실행 100 μl를 추가합니다. 클러스터 튜브 플레이트의 각 웰로부터 세포 현탁액의 전체 볼륨을 전송하고 유동 세포 계측기에 샘플을 획득. </li><li> 분석 소프트웨어를 이용하여 유세포 7AAD 양성 세포의 비율을 결정한다. </li></ol> 5. EC 50 결정 <ol><li> WS-CM과 니코틴의 EC (50) 값은 한 PBMC의 7AAD 양성 염색에 의해 결정됩니다. </li><li> EC (50) 값은 진한로 정의된다entration되는 세포의 50 %는 24 시간 분석에서 더 이상 없었다 가능한 한 값은 등차 니코틴 단위 / ㎖ μg의로서 표현된다. </li><li> 이 연구의 목적으로, EC (50)의 값은 각각, WS-CM 및 니코틴 1.56 ㎍ / ml 내지 1650 ㎍ / ㎖의 것으로 결정되었다. </li></ol> 6. 분비 된 사이토 카인 참고 : 여기에 나열된 희석이 연구의 목적이다. 희석액은 그에 따라 조정될 수있다. <ol><li> / 웰의 농도에서 100 ㎕의 총 부피를 RPMI 완전 배지를 사용하여 96- 웰 플레이트에서 WS-CM을 희​​석시키고, 0.3, 1.56, 등차 니코틴 유닛 (3), 5 ㎍ / ml의. </li><li> 다음 니코틴 농도를 희석 : 100, 200, 500, 750, 1000, 2000 및 3000 ㎍ / ㎖의. 주의 : 니코틴은 급성 독성 및 환경 위험합니다. </li><li> 웰 1 × 106 세포의 농도로 / 각 웰에 RPMI 완전 배지에 현탁 한 PBMC 100 ㎕를 추가한다.셀 플러스 WS-CM 또는 니코틴의 총 부피는 200 μL / 잘 될 것입니다. </li><li> 판을 덮고 37 ° C에서 3 시간, 5 % CO 2 동안 품어. </li><li> 3 분 300 XG에 원심 분리 상층 액을 흡입, 커버 플레이트와 함께 접시의 바닥을로 소용돌이 마지막으로 얼음 차가운 200 μL 버퍼를 실행하고 세척 단계를 한 번 더 반복과 세포를 일시 중단하여 실온에서 세포를 씻으십시오. </li><li> RPMI 전체 매체의 200 μl를 추가하고, 세척 단계를 한 번 더 반복한다. </li><li> 각 웰에 10 ㎍ / ml의 LPS 매체의 200 μl를 추가합니다. </li><li> 커버 플레이트 및 4 시간, 24 시간, 48 시간, 또는 37 ° C에서 72 시간 5 % CO 2 동안 품어. 필요에 따라 배양 시간을 조정합니다. </li><li> 3 분 동안 300 × g에서 접시를 원심 분리기. </li><li> 7 단계와 8 단계의 분석을 수행하기 위해 -80 ° C에서 냉동실에 잘 각각의 저장소에서 상층 액 175 μl를 가져 가라. </li></ol> 7. 세포 측정 비드 어레이 분석 &lt;OL&gt; <li> CBA 분석에서 6.10 및 사용 단계에서 제조 세포 상층 액을 해동. 제조업체의 지침에 따라 세포 측정 비드 어레이 (CBA) 분석을 수행합니다. </li></ol> 8. IL-8 ELISA <ol><li> IL-8 ELISA 단계 6.10 및 사용으로부터 세포 상층 액을 녹여. 제조업체의 지침에 따라 ELISA 분석을 수행합니다. </li></ol> 9. 세포 내 염색 및 유동 세포 계측법 참고 : 여기에 나열된 희석이 연구의 목적이다. 희석액은 그에 따라 조정될 수있다. <ol><li> / 웰의 농도에서 100 ㎕의 총 부피를 RPMI 완전 배지를 사용하여 96- 웰 플레이트에서 WS-CM을 희​​석시키고, 0.3, 1.56, 등차 니코틴 유닛 (3), 5 ㎍ / ml의. </li><li> 동일한 플레이트에서 다음 니코틴 농도를 희석 : 2, 10, 50, 100, 500, 2000 및 4000 ㎍ / mL로. 주의 : 니코틴은 급성 독성 및 환경 해저드입니다DOUS. </li><li> / 잘 1 × 10 6 세포의 농도로 RPMI 완전 배지에 현탁 PBMC를 100 μl를 추가합니다. 셀 플러스 WS-CM 또는 니코틴의 총 부피는 200 μL / 잘 될 것입니다. </li><li> 판을 덮고 37 ° C에서 3 시간, 5 % CO 2 동안 품어. </li><li> 얼음 차가운 버퍼 200 μL와 세포를 재 부유 마지막 3 분 동안 300 × g에서 원심 분리 한 상층 액을 흡입, 커버 플레이트와 함께 접시의 바닥을로 소용돌이 실온에서 세포를 세척하고, 세척 단계를 한 번 더 반복한다. </li><li> 판에 RPMI 완료 매체의 200 μl를 추가하고, 세척 단계를 한 번 더 반복한다. </li><li> RPMI 전체 매체를 사용하여 2 μL / ㎖ GolgiPlug의 작업 농도가 10 ㎍ / ml의 LPS를 준비하고 각 웰에 200 μl를 추가합니다. </li><li> 37 ° C에서 6 시간, 5 % CO 2 판을 품어. </li><li> 단계 9.8의 끝에서, 버퍼 (39 °의 C)를 실행하고 (300)에서 회전하여 세포를 씻어4 ℃에서 3 분 XG. </li><li> 각 웰에 Cytofix 100 μl를 추가하고 4 ℃에서 20 분 동안 품어. </li><li> 4 ℃에서 3 분 동안 300 XG에서 1 배 Permwash (4 ° C에서)와 단계 9.9에 설명 된대로 세포를 제거하는 과정을 3 회 반복한다. </li><li> 에 다음 항체의 하나의 각 5 μL 각 아니라 다음에 45 μL 1X Cytoperm의 추가 각 웰 : TNF-α-알렉사 형석 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. 30 분 동안 4 ° C에서 품어. </li><li> 1 배 Permwash (4 ° C에서)과 4 ℃에서 3 분 동안 300 XG에서 버퍼 (4 ° C)를 실행 한 시간 단계 9.9에 설명 된대로 세포 두 번 씻으십시오. </li><li> 2 % 파라 포름 알데히드 (39 °의 C) 200 μL로 세포를 재현 탁. 12 × 75mm 튜브에 세포를 전송하고, 사이토 흐름에 샘플을 분석 할 수 있습니다. 주의 : 파라 포름 알데히드는 급성 독성 및 건강 위험, 부식성. </li></ol> (10) K562 죽이는 분석 참고 : K562 세포는 성장한다RPMI 완료 매체와 37 ° C, 5 % CO 2의 문화에서 그들은 분석하기 전에 80 %의 합류에 도달 할 때까지. <ol><li> 유리 병에 DMSO의 18 μl를 추가하여 숙신 에스테르 (CFSE) 원액 카복시 5 mM의를 준비합니다. </li><li> / 웰로 각각의 웰에 대해 원하는 등차 니코틴 단위 또는 니코틴 농도를 달성하기 위해 100 ㎕의 총 부피로 RPMI 완전 배지를 사용하여 96- 웰 플레이트에서 WS-CM 또는 니코틴 희석. 주의 : 니코틴은 급성 독성 및 환경 위험합니다. </li><li> / 웰 1.5 × 10 6 세포의 농도로 RPMI 완료 매체에 PBMC를 100 μl를 추가합니다. WS-CM 또는 니코틴 세포의 총 부피는 200 μL / 잘 될 것입니다. </li><li> 판을 덮고 37 ° C에서 3 시간, 5 % CO 2 동안 품어. </li><li> 실온에서 8 분 동안 400 XG에 10 DPBS ㎖의 원심 분리기를 추가하여 K562 세포를 씻으십시오. </li><li> DPBS 10 mL로 재현 탁하고 세포를 K562 세포를 카운트. </li><li> CFSE 가공용 준비1 ML의 DPBS에 CFSE 주식 솔루션 1 μl를 추가하여 NG 솔루션입니다. </li><li> 2 × 107 세포 - 함유 한 K562 세포 현탁액 1 ㎖에 CFSE 작동 액 1ml를 추가한다. 소용돌이와 실온에서 2 분 동안 정확하게 품어. </li><li> 즉시 FBS 200 μl를 추가합니다. 소용돌이와 실온에서 2 분 동안 정확하게 품어. </li><li> RPMI 전체 매체의 10 ML을 추가하고 실온에서 8 분 동안 400 XG에 튜브를 원심 분리기. </li><li> RPMI 상청액을 제거하고 펠렛을 끊고 RPMI 완전 배지 10 mL로 세포를 재현 탁하고 CFSE로 표지 된 K562 세포를 카운트. </li><li> 실온에서 3 분 동안 300 XG에 접시를 원심 분리하여 PBMC를 씻으십시오. 액체를 경사 분리하여 상층 액을 기음. 덮개를 장착하고 접시의 바닥을 소용돌이. RPMI 전체 매체의 200 μl를 추가하고 세척 단계를 한 번 더 반복한다. </li><li> (1.5 × 106 PBMC를 K562s 100,000) PBMC 플레이트와 상기 각 I 샘플 웰에 1:15 비로 CFSE 표지 된 K562 세포를 추가37 ° C에서 5 시간 5 % CO 2 ncubate. </li><li> 실온에서 3 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세포 믹스를 씻으십시오. 액체를 제거하여 상층 액을 기음. 덮개를 놓고 판의 바닥을 소용돌이. </li><li> 유동 완충액 200 μl를 첨가하고, 10.14 단계를 한 번 더에 기재된 세정 공정을 반복한다. </li><li> / 잘 100 μL의 총 부피에 대한 각 웰에 7AAD의 5 μL 다음 실행 버퍼의 95 μl를 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 어두운 데에서 인큐베이션 플레이트. </li><li> 각 웰에 유동 완충액 100 ㎕를 첨가하고, 클러스터 튜브 플레이트의 각 웰로부터 세포 현탁액의 전체 볼륨을 전송하고 유동 세포 측정기에 샘플을 획득. </li><li> 분석 소프트웨어를 이용하여 유세포 7AAD 양성 및 CFSE 양성 세포의 비율을 결정한다. </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+leukocyte+subsets+from+fresh+and+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+clinical+research.">Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research.</a> Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).</li><li>Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dead+cell+discrimination+with+7-amino-actinomycin+D+in+combination+with+dual+color+immunofluorescence+in+single+laser+flow+cytometry.">Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry.</a> Cytometry. 13, 204-208 (1992).</li><li>Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multiparametric+flow+cytometry-based+cytotoxicity+assay+simultaneously+immunophenotypes+effector+cells:+comparisons+to+a+4+h+51Cr-release+assay.">A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay.</a> J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).</li><li>Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-induced+death+by+apoptosis+in+human+lymphokine-activated+natural+killer+cells.">Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells.</a> Blood. 87, 2411-2418 (1996).</li></ol>

The authors declare that there are no conflicts of interest.

우리와 다른 사람은 이전에 TPP를 함께 한 PBMC의 치료는 표현과 사이토 카인 및 대상 셀 (14)을 죽이는 기능 측정의 분비 등 여러 반응을 억제하는 것이 증명하고있다. 이전의 연구에서 설명하는 실험 방법은 더 이상 배양 기간을 필요로 크기 14에서 겸손했다. 기본이 매력적인 생체 모델의 응용 가능성을 감안할 및 응용 연구, 우리는 이러한 여러 단계의 생물학적 분석에서 분...

심혈관 질환 (CVD), 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 암 1,2- 포함한 만성 흡연의 건강에 미치는 악영향에 기술 점의 실질적인 몸체. 만성 흡연은 염증과 면역 억제를 일으키는 것으로 알려져 있으며, 이러한 변화는 흡연자 3 미생물 감염과 암의 위험 증가에 기여할 것으로보고되고있다. 생체 외 및 생체 기술이 유용의 병태 생리 학적 효과의 분자 기초를 해명에 담배 연기 4-9 (표 1)과 각종 담배 제품 (10, 11)의 새로운 규정을 안내하기위한 중요한 도구로 인식된다. 예를 들어, 우리는 전체 연기 된 배지 (WS-CM) 및 총 입자상 물질 (TPM) 등의 가연성 담배 제품 준비 (TPP를)이 훨씬 더 독성과 손상에 있음을 증명하고있다불연성 TPP를 또는 니코틴 (12, 13)보다 DNA. 게시 된 작업과 일치, 그것은 최근에 가연성 TPP를 또는 니코틴 (12, 13)이보고되었다. 게시 된 작업과 일치, 우리는 최근 가연성 TPP를 표시 한 면역 억제의 원인이 보도했다. 이것은 수용체 (TLR) -ligands 같은 톨의 억제에 의해 입증 된, 생체 모델 (14)에 한 PBMC에 의해 살해 (K562) 사이토 카인 분비를 자극, 세포를 대상으로. 흡연 - 유도 된 질병 과정에서 염증의 중요성을 감안하면, 담배 연기의 면역 조절 성 효과를 평가하기위한 분석 조건의 추가적인 최적화는 본 조사된다. 생체 외 분석은 일반적으로 세포 내 사이토 카인을 측정뿐만 아니라 분석 죽이고 14 K562 세포 내에서 세포 독성 T 세포 및 NK 세포 용해 기능을 분비. 분석은 WS-CM 및 니코틴과 PBMC의 후속 자극과 사전 배양을 포함TLR와 S 3 일에 걸쳐 주작 동근; 최종 판독은 효소 면역 분석법 (ELISA를)를 사용하여 및 / 또는 유동 세포 계측법으로 수행된다. 우리는 TLR-4 수용체에 결합하고,이 한 PBMC 세포 내 사이토 카인 및 사이토 카인 분비의 자극의 결과로 생산 세균 지질 다당류 (LPS)를 이용했다. 단리 한 PBMC, 세포 사멸 분석, 및 IL-8을 정량 TPP를 우리 또한 본 방법의 면역 조절 효과를 평가하기위한 각종 분석 단계의 최적화 외에. 이러한 방법은 다른 연구 문제를 해결하기 위해 적용 및 추가 규제 맥락에서 담배 제품을 평가하기 위해 정제 할 수있다. 표 1. 체외의 보고서를 간행하고 생체 방법은 담배 제품의 준비 varilus 병태 생리 학적 효과를 연구하는 데 사용 CS, 담배 연기 매체.; CSC, 담배 연기 응축; CSE, 담배 연기 추출물; ELISA, 면역 분석을 효소는 링크; GADPH, 글리 세르 알데히드 -3- 포스페이트 탈수소 효소; qPCR을 정량적 폴리머 라제 연쇄 반응; RT, 정량적 실시간 중합 효소 연쇄 반응; TS, 담배 연기. <table><tbody><tr><td> 저자 (연구 년) </td><td> Laan의 등 알. (2004) </td><td> 무디 등 알. (2004) </td><td> Oltmanns 등 알. (2005) </td><td> Vayssier (1998) </td><td> Witherden 등 알. (2004) </td><td> Birrell 등 알. (2008) </td></tr><tr><td> 세포는 사용 </td><td> 인간 기관지 내피 세포 (BEAS-2B), 인간 호중구 </td><td> 인간의 폐포 상피 세포 (A549) </td><td> 인간기도 평활근 세포 (HASMC) </td><td> premonocytic 인간 U937 세포, 인간 단핵 </td><td> 폐포 유형 II 상피 세포 (ATII) </td><td> 인간 단핵구세포주 (THP-1), 인간 폐 식세포 </td></tr><tr><td> TPP 사용 </td><td> CSE </td><td> CSC </td><td> CSE </td><td> TS </td><td> CSE </td><td> CS </td></tr><tr><td> 방법 사용 </td><td> ELISA, qPCR에, 마이그레이션, 전기차 이동 </td><td> Immunohisto - 화학, 전기, Arrayscan 키트, RT-PCR, ELISA </td><td> ELISA, RT-PCR, qPCR에, 전기 영동 </td><td> 젤 이동성 변화 </td><td> 광학 현미경, 전자 현미경, 전기, ELISA </td><td> qPCR에, ELISA, E-toxate 키트 (시그마), P65 플레이트 분석 (TransAM), 전기 영동, 다양한 면역 키트 </td></tr><tr><td> 측정 </td><td> IL-8, GM-CF, AP-1, NF-κB, 마이그레이션 </td><td> 히스톤 아세틸 트랜스퍼, 히스톤 아세틸 라제, NF-κB, IL-8, PI κB-α, GADPH </td><td> HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, 에오 </td><td> 열 충격 / 스트레스 단백질 (HSP / 인 Hsp70), HF 전사 인자, NF-κB,TNF-α </td><td> 계면 활성제 단백질 (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ </td><td> IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / ERK 인산화 cJUN : DNA 결합, 글루타티온, P65 : DNA 결합 </td></tr><tr><td> 최종 결과 </td><td> CSE는 AP-1 활성의 억제를 통해 사이토 카인 생성을 하향 조절한다. </td><td> H 2 O 2와 CSC는 차별적으로, 히스톤 탈 아세틸 화 효소의 활성을 감소, 히스톤 단백질의 아세틸 화를 강화 염증성 사이토 카인의 방출을 조절한다. </td><td> 담배 연기는 담배 연기에 의해 TNF-α, 20 % CSE 이하 IL-8 릴리스, 에오 탁신의 억제 및 RANTES에 의해 강화 HASMC에서 IL-8의 출시를 일으킬 수 있습니다. </td><td> TS는 인 Hsp70 과발현 및 활동과 TNF-α 자료를 결합 NFkB의 억제와 관련이 HF 전사 인자를 활성화. </td><td> 감소 ATII 세포 유래 케모카인 수준의 타협 alveoLAR 수리, 담배 연기에 의한 폐포 손상과 폐기종에 기여. </td><td> 데이터는 왜 흡연자가 증가 호흡기 감염에 대한 기계적인 설명을 제공합니다. 선천성 반응 억제는 IL-8의 증가를 수반한다. </td></tr></tbody></table>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="712">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:148px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:223px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">12 X 75 tubes</td>
			<td style="width:148px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">15 ml conical tubes</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">2 mL Microtubes</td>
			<td style="width:148px;">Axygen</td>
			<td style="width:119px;">MCT-150-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">3R4F reference cigarettes&#160;&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Univ. of Kentucky, College of Agriculture</td>
			<td style="width:119px;">3R4F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">500 ml bottle</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">7AAD</td>
			<td style="width:148px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:119px;">559925</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well flat bottom plate</td>
			<td>Termo Nunc</td>
			<td>439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">96 well round bottom plates</td>
			<td style="width:148px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell culture hood</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1300 Series A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">58110R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">CFSE</td>
			<td style="width:148px;">Molecular Probes Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cluster tubes</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td>4401</td>
			<td>Harmful if swallowed, carcinogen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cytofix/Cytoperm (Permwash)</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555028</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide )</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DPBS</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FBS</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FCAP Array</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">652099</td>
			<td>Software analyzes CBA data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Filter unit</td>
			<td style="width:148px;">Nalgene</td>
			<td style="width:119px;">156-4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Flow Cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">FACS Canto II</td>
			<td>&#160;8 colors, at Ex 405 and Em785.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Flow Cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">FACS Calibur</td>
			<td>&#160;4 colors at Ex 495 and Em 785.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Flow cytometry analysis software</td>
			<td style="width:148px;">Tree Star</td>
			<td style="width:119px;">FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Freezing Container</td>
			<td style="width:148px;">Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Contains DMSO,&#160; irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">GogliPlug</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555029</td>
			<td>Carcinogen, Irritant, Corrosive&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:223px;">H2SO4</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Human Inflammatory Cytokine Kit</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">551811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">IFN-&#947; V-500 Antibody</td>
			<td style="width:148px;">BD Horizon</td>
			<td style="width:119px;">561980</td>
			<td>&#160;skin sensitizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">IL-8 ELISA Kit</td>
			<td style="width:148px;">R and D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Isolation Buffer</td>
			<td style="width:148px;">Isolymph, CTL Scientific Corp.</td>
			<td style="width:119px;">1114868</td>
			<td>Flammable liquid, Irritant&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:148px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">LPS</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">MIP1-&#945; PE Antibody</td>
			<td style="width:148px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:119px;">554730</td>
			<td>Acute toxicity, Oral</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Monensin</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M5273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotine</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N3876</td>
			<td>Acute toxicity, Environmental hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Parafilm</td>
			<td style="width:148px;">Bemis</td>
			<td style="width:119px;">&#8220;M&#8221;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td>Flammable, Skin irritation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Pen/strep</td>
			<td style="width:148px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:148px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Running buffer</td>
			<td style="width:148px;">MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Th1/Th2 CBA Kit</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">551809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:223px;">TNF-&#945; Alexa Fluor 488 Antibody</td>
			<td style="width:148px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">502915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Transfer pipette</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tris Base</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to evaluate cytotoxicity and immunosuppression of combustible tobacco product preparations

다른 병리 생리 학적 변화 중, 담배 연기 만성 노출은 미생물 감염 및 종양 발생률 흡연자의 감수성 증가로 연결되었다 염증 및 면역 억제를 야기한다. 생체 내 인간 말초 혈 단핵 세포에서 수용체 - 매개 면역 반응의 억제 (한 PBMC) 연기 성분으로 처리하는 메커니즘을 연구 및 담배 제품에 대한 노출 가능성이있는 장기 효과를 평가하는 매력적인 방법이다. 여기서 우리는 박테리아 리포 폴리 사카 라이드, 수신자 같은 수용체 4 리간드에 의해 자극 된 PBMC를 사용하여 생체 분석을 수행하는 방법을 최적화. 전체 연기 된 배지 (WS-CM)의 효과는, 가연성 담배 제품 준비 (TPP), 니코틴은 생체 분석에 PBMC를하여 사이토 카인 분비와 표적 세포 사멸에 조사 하였다. 우리는 그 표시 분비 사이토킨 IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6, IL-8, 사이토 카인의 세포 내 IFN-47 ;, TNF-α 및 MIP-1α는 WS-CM-노출 PBMC를 억제했다. K562의 표적 세포 살해 분석으로 산출 된 PBMC의 효과기 세포 용해 기능은 또한 WS-CM에 노출 감소; 니코틴은 이러한 분석에 최소한의 효과적이었다. 요약하면, 우리는 생체 내 분석의 TPP를 효과를 평가하기 위해 개선 된 분석법의 세트를 제공하고,이 방법은 용이하게 다른 관심있는 제품을 테스트하도록 구성 될 수있다.

결과는 평균 (네 기증자 샘플)의 평균 ± 표준 오차로 표시 하였다. 치료 및 치료를받지 않은 샘플 사이의 학생의 t- 테스트는 해당 컨트롤이 모든 치료 용 Excel 소프트웨어뿐만 아니라 t-test를 비교를 사용하여 수행 하였다. 통계적 유의성에 의해 표시되었습니다 * P &lt;0.05; **, P &lt;0.005; ***, P &lt;0.0005. WS-CM 및 니코틴에 대한 노출의 효과를 측정하기 위해, PBMC를 3 시간 또는 24 시?...

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Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure.

방법은 가연성 담배 제품 준비의 세포 독성 및 면역 억제를 평가하기

Among other pathophysiological changes, chronic exposure to cigarette smoke causes inflammation and immune suppression, which have been linked to ...

methods-to-evaluate-cytotoxicity-immunosuppression-combustible

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.3K 조회수.  Wake Forest University Health Sciences. Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure. 

비디오: Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

Poliovirus 식별을위한 입자 응집 방법

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

연구

면역학 및 감염병학

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

Heterokaryon 형성의 두 가지 방법 HCV 제한 요소를 발견하기

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

설립과 연구에 높은 처리량 설정 최적화<em&gt; 표피 포도 구균</em&gt;와<em&gt; Mycobacterium의 박테</em&gt; 감염 신약 개발의 모델로

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Here we describe a newly developed hepatitis B virus (HBV) reporter system to monitor the early stages of the HBV life cycle. This simplified in vitro system will aid in the screening of anti-HBV agents using a high-throughput strategy.

B 형 간염 바이러스 리포터 시스템 개발은 복제주기의 초기 단계를 모니터링하기

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&amp;#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

단핵구 단층 분석의 사용은 Fcγ 수용체 - 매개 식균 작용을 평가하기

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

상처 치유 분석 결과 셀 마이그레이션 평가 하는 새로운 체 외에

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple organs. With the development of therapies, most patients survive the hyperinflammatory phase but progress to an immunosuppressive phase, which increases the emergence of secondary infections. Therefore, improved understanding of the pathogenesis underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive phase during sepsis is of tremendous importance. Reported here is a model to test infectious outcomes by creating double-hit infections in mice. A standard surgical procedure is used to induce polymicrobial peritonitis by cecal ligation and puncture (CLP) and followed by intranasal infection of Staphylococcus aureus to simulate pneumonia occurring in immune suppression that is frequently seen in septic patients. This dual model can reflect the immunosuppressive state occurring in patients with protracted sepsis and susceptibility to secondary infection from nosocomial pneumonia. Hence, this model provides a simple experimental approach to investigate the pathophysiology of sepsis-induced secondary bacterial pneumonia, which may be used for discovering novel treatments for sepsis and its complications.

This protocol describes techniques to measure infectious outcomes underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive condition, first by establishing cecal ligation/puncture mice then challenging them with intranasal infection to create a clinically relevant model of immunosuppression sepsis.

세칼 결찰 및 천자 및 비강 내 감염 이중 모델 패혈증 유발 면역 억제 설계

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte (CTL) responses elicited against tumor- and pathogen-derived peptides. They offer several advantages over traditional killing assays. First, they permit the monitoring of CTL-mediated cytotoxicity within architecturally intact secondary lymphoid organs, typically in the spleen. Second, they allow for mechanistic studies during the priming, effector and recall phases of CTL responses. Third, they provide useful platforms for vaccine/drug efficacy testing in a truly in vivo setting. Here, we provide an optimized protocol for the examination of concomitant CTL responses against more than one peptide epitope of a model tumor antigen (Ag), namely, simian virus 40 (SV40)-encoded large T Ag (T Ag). Like most other clinically relevant tumor proteins, T Ag harbors many potentially immunogenic peptides. However, only four such peptides induce detectable CTL responses in C57BL/6 mice. These responses are consistently arranged in a hierarchical order based on their magnitude, which forms the basis for TCD8 &#8220;immunodominance&#8221; in this powerful system. Accordingly, the bulk of the T Ag-specific TCD8 response is focused against a single immunodominant epitope while the other three epitopes are recognized and responded to only weakly. Immunodominance compromises the breadth of antitumor TCD8 responses and is, as such, considered by many as an impediment to successful vaccination against cancer. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular factors and mechanisms that dictate or shape TCD8 immunodominance. The protocol we describe here is tailored to the investigation of this phenomenon in the T Ag immunization model, but can be readily modified and extended to similar studies in other tumor models. We provide examples of how the impact of experimental immunotherapeutic interventions can be measured using in vivo cytotoxicity assays.

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

We describe here a flow cytometry-based in vivo killing assay that enables examination of immunodominance in cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to a model tumor antigen. We provide examples of how this elegant assay may be employed for mechanistic studies and for drug efficacy testing.

종양 특이 CD8+ T 세포 반응에서 면역 우세를 연구 하기 위한 생체 내 세포 독성 분석 법

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

광견병 백신 효능을 평가하기 위한 시험관 내 ELISA 테스트

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...