의료 응용 분야를 위한 신소재가 폭발적으로 증가함에 따라 초기 스크리닝이 체계적으로 이루어져야 하므로 이 프로토콜은 새로운 생체 재료를 개발하고 특성화하는 것을 목표로 하는 연구자에게 기본 도구가 될 수 있습니다. 이 방법론을 통해 고체 및 액체 모두의 생체 재료 및 제약 제형의 세포 독성 및 생체 활성에 대한 정량적 및 정성적 평가가 가능합니다. 세포 노출 후 몇 가지 보완 분석을 수행할 수 있습니다.
생체 재료 세포 독성의 확립은 임상 실습에 적절한 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 이 지식은 임상의가 특정 환자 또는 상태에 가장 적합한 생체 재료를 선택할 수 있도록 권한을 부여할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하면 치과, 정형외과, 수술, 안과, 심장학 등과 같은 다양한 영역에서 새로운 생체 재료의 특성을 분석할 수 있습니다.
상기 평가성능은 세포독성 외에 생체 조직에서의 생체 재료 생리활성에 대한 결론을 내릴 수 있도록 해야 한다. 실험 시작에 최대한 가깝게 주걱을 사용하여 새로 준비된 생체 재료를 PVC 몰드에 넣고 재료를 실온에서 적절한 시간 동안 설정합니다. 재료가 굳으면, 금형에서 펠릿을 제거, 적절한 크기의 용기에 넣습니다.
그런 다음 자외선 램프 아래에서 펠릿을 한 면당 20분 동안 살균합니다. 펠릿에서 생체 재료를 추출하려면 멸균된 펠릿을 50밀리리터 튜브에 넣고 적절한 세포 배양 배지를 펠릿에 추가합니다. 튜브를 섭씨 37도에서 24시간 동안 두십시오.
다음날, 신선한 배지를 사용하여 추출물을 적절한 관심 부피로 희석하십시오. 생체 재료 노출에 대한 반응으로 세포 형태를 평가하려면 멸균 핀셋을 사용하여 적절한 크기의 멸균 유리 커버슬립을 멀티웰 플레이트의 각 웰에 넣습니다. 적절한 농도로 각 커버슬립에 세포를 추가하고 밤새 인큐베이터에 넣습니다.
적절한 부피의 목적하는 추출물 희석액을 각 웰에 첨가하고, 적절한 배양 기간 동안 세포를 세포 배양 배양기로 되돌린다. 배양이 끝나면 각 웰에서 상청액을 흡인하여 커버 슬립이 실온에서 건조되도록합니다. 샘플이 건조되면 실온에서 3 분 동안 충분한 양의 May-Grunwald 용액으로 각 커버 슬립을 덮습니다.
염료를 제거한 후, 커버슬립을 적절한 부피의 증류수로 1분 동안 세척한 후, 충분한 부피의 김사 용액에서 15분간 배양한다. 배양이 끝나면 흐르는 물에 커버 슬립을 씻고 광학 현미경으로 세포를 이미지화합니다. 입증된 바와 같이 관심 있는 생체 재료에 노출된 후 단백질 발현 평가에 의해 세포 기능을 평가하기 위해 실온에서 30분 동안 3.7% 파라포름알데히드로 세포를 고정하기 전에 PBS로 세포의 각 웰을 세척합니다.
배양이 끝나면 PBS로 세포를 두 번 세척하고 PBS에서 0.5% Triton으로 세포를 15분 동안 투과시킵니다. 투과가 끝나면 PBS에서 0.3% 과산화수소로 과산화효소를 5분 동안 차단한 다음 PBS로 2회 세척합니다. 2차 세척 후 0.5%BSA로 세포를 2회 세척한 후 2%BSA로 비특이적 결합을 45분 동안 차단한다.
배양이 끝나면 실온에서 60분 동안 관심 단백질에 대한 1차 항체로 세포를 배양하기 전에 0.5% BSA로 세포를 한 번 세척한 다음 신선한 0.5% BSA로 5회 세척합니다. 마지막 세척 후, 실온에서 90분 동안 관심있는 적절한 2차 항체와 함께 세포를 배양한 다음, 0.5% BSA에서 1분 동안 5회 세척합니다. 마지막 세척 후, 세포를 적절한 기질 및 발색원 혼합물과 함께 기질 농도 밀리리터당 20마이크로리터의 발색원에서 25분 동안 배양합니다.
배양이 끝나면 배양물을 PBS에서 0.5% BSA로 두 번 세척하고 15분 동안 헤마톡실린으로 세포를 대조염색합니다. 대조염색된 세포를 암모니아 리터당 0.037몰로 5분 동안 세척한다. 그런 다음 증류수로 5분 동안 세척하여 과도한 염료를 제거하고 글리세롤을 사용하여 커버슬립을 슬라이드에 장착합니다.
추출물 처리된 세포 배양액 내에서 광물화된 침전물의 형성을 평가하기 위해 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정하기 전에 PBS로 각 웰을 3회 세척합니다. 마지막 세척 후, 적절한 양의 알리자린 레드 염색 용액으로 세포를 암흑 속에서 섭씨 37도에서 20 분 동안 염색합니다. 배양이 끝나면 과잉 염료가 완전히 제거될 때까지 PBS로 웰을 세척하고 광학 현미경으로 세포를 이미지화합니다.
그 후 추출 용액을 각 웰에 첨가하여 실온에서 교반하면서 40분간 배양하고, 490 나노미터 파장의 분광광도계로 각 웰의 흡광도를 측정하였다. MTT 분석은 대사 활성에 미치는 영향으로 측정할 때 빠르고 간단한 방식으로 물질의 세포 독성에 대한 개요를 얻는 데 사용할 수 있습니다. 세포 생존율 분석은 또한 세포 독성이 높은 물질이 동일한 농도에서 더 높은 비율의 세포 사멸을 유도하기 때문에 관심 물질의 세포 독성을 평가할 수 있습니다.
30% 이상의 감소는 중요한 것으로 간주되며 재료를 낮은 생체 적합성의 위험이 있는 것으로 정의합니다. 또한, 더 많은 세포독성 물질은 세포 생존율의 두드러진 감소 및 후기 세포자멸사 및 괴사 세포 사멸 프로파일을 특징으로 하는 반면, 더 적은 세포독성 물질은 더 적은 세포 사멸 및 더 많은 세포자멸사 및 후기 세포사멸 프로파일을 유도한다. 형태학적 평가는 세포 형태의 변화가 세포사멸 또는 괴사 프로필을 나타낼 수 있을 뿐만 아니라 물질 입자의 존재를 나타낼 수 있기 때문에 세포 생존율 평가를 보완합니다.
또한, 단백질 발현에 대한 관심 물질의 효과는 생존력에 대한 효과와 독립적으로 관찰될 수 있다. 예를 들어, 이 분석에서 한 물질은 단백질 발현의 증가를 유도한 반면 다른 물질은 상당한 감소를 촉진했습니다. 두 경우 모두 추출물의 농도가 단백질 발현에 직접적인 영향을 미쳤습니다.
추출물 준비에서 적절한 생체 재료 표면 대 중간 부피 비율이 중요합니다. 또한 샘플은 특성을 변경하지 않는 방법을 사용하여 멸균해야 합니다. 기억해야 할 또 다른 세부 사항은 pH를 추출하는 것인데, 이는 조정 없이 등록되어야 합니다.
필요한 경우 추가 제어를 수행합니다. 생체 재료 추출물은 화학 및 생화학 연구뿐만 아니라 여러 다른 분자 생물학 기술에 사용할 수 있습니다. 얻어진 결과는 미래의 생체 내 생체 적합성 테스트를위한 기초를 제공합니다.
세포 독성 평가는 의료용 물질의 개발에 매우 중요합니다. 따라서 이 프로토콜은 새로운 생체 재료 또는 이미 다른 의료 분야에 존재하는 다른 생체 재료의 새로운 응용 프로그램을 평가하기 위한 체계적이고 포괄적인 접근 방식을 제공합니다.
