Name: an in vitro enzymatic assay to measure transcription inhibition by gallium(iii) and h3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles
Uploaded: 2015-03-18T13:00:00.000+00:00
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Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles at JoVE.com

우리는 진심 겔 전기 영동에 대한 도움말 박사 신디 N. 애기를 감사하고, DNA 및 제한 효소의 관대 한 기부 앤디 저우와 마이클 Grodick. 우리는 기꺼이 장비 및 재료에 관대 한 접근을 위해 교수 J. 히스 교수 D. 프로 버를 인정합니다. 우리는 도움이 제안 박사 깐 Sorasaenee 감사합니다. 우리는 비디오의 개략도에 사용 된 그림을 만드는 메리 H. 당나라 감사합니다. 자금은 존슨 앤 존슨 (Johnson &amp; Johnson)과 USC Y86786에 의해 제공되었다.

참고 : RNA로 작업 할 때 DNA 및 RNA를 저하의 DNase와의 RNase 효소에 의한 오염을 방지하기 위해 깨끗한 작업 환경을 유지한다. 그 피펫 팁 및 튜브의 DNase와의 RNase 무료로 확인합니다. 여기에는 오염 제거 솔루션 등을 피펫, 튜브 홀더, 같은 실험실 표면과 장비를 닦아하는 것이 도움이된다. Corrole 치료 1. RNA 전사 <ol><li> corrole을 준비하고 0.01 화합물 억제제 : [DNA] : [복잡한] 1 몰비. 주 : 0.43 pmol의 DNA를 사용 DNA 템플릿에서 E. LIGA 유전자 APET-28C 벡터이었다 : 우리의 경우, 비율은 4.3 fmol 복합체이었다 T7 프로모터의 제어하에 대장균. T7 프로모터와 다른 DNA는 또한 전사 분석을 실행하기위한 유효한 후보들이다. <ol><li> 티노 마이신 D, 깨끗하고, 별도의 용기에 triptolide, tpfc, 디메틸 설폭 사이드에서 조지아 (tpfc) (DMSO)에 용해. [C의 몰비가 1 : 0.01의 최종 농도를 얻omplex] : 뉴 클레아없는 물과 희석액을 사용하여 [DNA]. <ol><li> 1.8 ml의 DMSO에 1 mg의 티노 마이신 D 녹인다. 나누어지는 10 별도의 용기에 μL와는 1/100 희석을 만들 핵산 분해 효소가없는 물 1까지 희석. 나누어지는 한 별도의 용기에 희석의 μL 및 1 / 1,000 희석을 만들 핵산 분해 효소가없는 물 1까지 희석. 주 : 티노 마이신 D의 용액의 최종 농도는 4.3 fmol이다. </li><li> 0.64 ml의 DMSO에 1 mg을 triptolide을 녹여. 나누어지는 1 별도의 용기에 μL 및 1 / 1,000 희석을 만들 핵산 분해 효소가없는 물 1까지 희석. 나누어지는 한 별도의 용기에 희석의 μL 및 제 1 / 1,000 희석을 만들 핵산 분해 효소가없는 물 1까지 희석. 참고 : triptolide의 최종 용액의 농도는 4.3 fmol이다. </li><li> 2.9 ml의 DMSO에 1 mg을 tpfc을 녹여. 10 μL 별도의 용기와 뉴 클레아없는 물 1까지 희석 나누어은 1/100 D를 생성하는ilution. 나누어지는 한 별도의 용기에 희석의 μL 및 1 / 1,000 희석을 만들 핵산 분해 효소가없는 물 1까지 희석. 참고 : tpfc의 최종 용액의 농도는 4.3 fmol이다. </li><li> 2.6 ml의 DMSO에 1 mg의 가인 (tpfc)을 녹여. 나누어지는 10 별도의 용기에 μL와는 1/100 희석을 만들 핵산 분해 효소가없는 물 1까지 희석. 나누어지는 한 별도의 용기에 희석의 μL 및 1 / 1,000 희석을 만들 핵산 분해 효소가없는 물 1까지 희석. 참고 : 조지아 (tpfc)의 최종 용액의 농도는 4.3 fmol이다. 참고 :이 co​​rroles 및 억제제는 물에 용해되지 않고 DMSO에 미리 용해해야합니다. (1 % 이하) DMSO 소량의 세포 (게시되지 않은 데이터)에서 세포 독성을 유발하지 말 것. </li></ol></li></ol></li><li> 이전 전사 반응을 시작으로, 개별적으로 필요한 시약을 준비하거나 상용 공급 업체를 구입할 수 있습니다. <ol><li> 얼음 모든 동결에 해동n 개의 시약 (냉동 시약의 목록은 표 1 참조). </li><li> 그들이 완전히 용액에 용해 될 때까지 혼합 10 배 반응 버퍼 및 4 리보 뉴클레오티드 (ATP, CTP, GTP 및 UTP) 솔루션 시간을 허용합니다. </li><li> 간단히 튜브의 테두리에 물질의 손실을 방지하기 위해 모든 시약을 원심 분리기. RT에서 10 배 반응 버퍼를 유지하면서 얼음에 일단 저장 리보 뉴클레오티드를 해동. </li><li> RT에서 전사 반응 용 시약 수확기 (시약의 목록은 표 2 참조). 주 : 상기 반응을 얼음보다는 RT에서 조립되는 경우 10 배 반응 완충액 스퍼는 템플릿 DNA 공 침물을 할 수있다. </li><li> 튜브를 튕기거나 위 아래로 부드럽게 혼합물을 피펫 팅에 의해 철저하게 섞는다. 혼합 한 후, 원심 간단히 튜브의 하단에 반응 혼합물을 수집한다. </li><li> 2-4 시간의 합계 37 ℃에서 반응 혼합물을 배양한다. 참고 : 필요한 반응 시간이 달라집니다DNA 템플릿 크기와 순서에. 이 단계는 특정 순서에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다. 짧은 템플릿은 총 RNA의 높은 수율에 대한 이상 반응 시간을 필요로 할 수있다. </li><li> -20 ° C에서 각각의 시간 및 저장 후 각 반응에서 4 μL 씩을 제거합니다. 원하는 시점들에 대해 필요에 따라 수정합니다. </li></ol></li></ol> 2. RNA 스핀 열 <ol><li> 전사 반응 후, 마이크로 원심 호환 크로마토 그래피 컬럼을 사용하여 RNA를 정제. 주 :. RNA 스핀 컬럼의 사용은 80 % 이상 회복에 20 개 이상의 염기 결과와 RNA를 정제 44 참고 : 컬럼 크로마토 그래피는 RNA를 정화하는 일반적이고 편리한 방법입니다. 클로로포름 추출, 이소프로판올 침전뿐만 아니라 다른 시판 키트 : 다른 정제 방법은 또한, 염화 리튬의 석출, 페놀로서 존재한다. <ol><li> 균등 격렬 반전시킴으로써 열 버퍼에 세파 덱스 행렬을 재현 탁열 세 번 이상. 급격하게 열을 쓸어 넘겨이 작업을 수행합니다. </li><li> 열에서 상단 캡을 제거합니다. 캡의 일부 잔여 세파 덱스 매트릭스가있을 것이다; 캡 매트릭스 충전되면 열의 상 캡을 교체 행렬의 대부분이 열에 때까지 이전 단계를 반복한다. </li><li> 컬럼의 하단 끝을 스냅. 참고 : 일부 액체는 컬럼에서 탈출 할 수 있습니다. </li><li> 열을 포장합니다. <ol><li> 멸균 (의 RNase와 DNase의 자유)를 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 열을 놓습니다. </li><li> 1 분 동안 1,000 XG에서 탁상 원심 분리기에서 튜브를 원심 분리기. </li></ol></li><li> 컬럼에서 용출 버퍼와 1.5 ML의 microcentrifuge 관을 폐기하십시오. </li><li> 즉시 새로운 살균 된 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에 열을 배치하고 열 베드의 중심 샘플 피펫. 열 과부하를 방지하기 위해 샘플의 20 ~ 50 μl를 사용합니다. </li><li> 1000 XG에서 탁상 원심 분리기에서 튜브를 원심 분리기1 분. 참고 : 리제 정제 된 RNA 샘플입니다. </li></ol></li></ol> 아가 로스 겔 전기 영동 (3) (1 % 아가로 스겔) 42 주 : 티듐 브로마이드 DNA 및 RNA에 결합하는 형광에 따라서 이러한 생체 분자는 0.5 ㎍ / ㎖의에 티듐 브로마이드 수용액으로 이들을 배양하여 UV 광으로 가시화 될 수있다. <ol><li> 물 5 ㎎ 티듐 브로마이드 10 ml에 용해시켜 티듐 브로마이드 (0.5 ㎎ / ㎖)의 1000 배 스톡 용액을 준비한다. </li><li> 겔 전기 영동에 대한 트리스 아세테이트 EDTA (TAE) 실행 버퍼를 준비합니다. 50 배 TAE 버퍼가 2.0 M 트리스 - 아세테이트 0.05 M 에틸렌 디아민 산 (EDTA)와 결합하고 8.5로 pH를 조절할 수 있도록합니다. </li><li> 버퍼 1 L에 1X TAE 아가로 오스 10g을 초순수에 용해하고, 종래의 전자 레인지 아가를 용융하여 1 % (중량 / 부피) 아가로 오스 겔을 준비한다. 이를 50 ° C로 냉각되면, 1 % 아가 로스 겔 솔루로 1000 배에 티듐 브로마이드 용액 1ml를 첨가하여기, 부드럽게 소용돌이에 의해 밀폐 된 용기에 반전 혼합 한 후 겔 캐스팅 플랫폼에 아가로 오스 솔루션을 부어 젤 실온에서 응고 할 수 있습니다. 참고 : 에티 디움 브로마이드 돌연변이 잠재적 인 발암 물질이다. 장갑을 착용하고 조심스럽게 솔루션을 처리합니다. 에티 디움 브로마이드의 적절한 처리 절차 내용은 다음을 참조하십시오 <a href="http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667">http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667을</a> . </li><li> 겔 고화 후, 전기 영동 탱크 세트 겔을 배치. 우물이 침수 될 때까지 젤을 충당하기에 충분한 TAE 버퍼를 추가합니다. TAE 버퍼의 레벨이 약 1mm 겔의 수준 이상 있는지 확인합니다. 겔 빗를 제거합니다. 참고 : 우물 침수 후 빗 제거는 우물에 갇혀되는 공기 주머니를 방지 할 수 있습니다. </li><li> RNA 샘플을 준비합니다. 1 μL 젤 로딩 버퍼 각 정제 샘플 나누어지는 1 μl를 결합 (또는 1 ㎕의 10 배 로딩 버퍼와 dilut와에드 뉴 클레아없는 물 10 μL)과에 마이크로 피펫과 피펫 팅에 의해 아래로 완전히 혼합. 참고 : 10 배 로딩 버퍼는 20 % 피콜 (400), 0.1 M 나 2 EDTA, pH가 8.0, 1.0 % SDS, 푸른 0.25 % 브로 모 페놀이 포함되어 있습니다. 이 브로 모 페놀 블루만큼 빠르게 ~ 50 %를 실행하며 매우 긴 실행을 모니터링하는 데 유용 할 수 0.25 % 크실렌 cyanol 또한, 로딩 완충액에 첨가 할 수있다. (42) </li><li> 신중하게 잘 각각의 바닥에 솔루션을 피펫 팅하여 각 샘플 젤을로드합니다. 공기 방울을 떠나거나 우물 사이에 샘플을 혼합하지 않도록주의하십시오. 주 : RNA 래더도 사체의 크기를 결정하는데 사용될 수있다. </li><li> DNA는 양극 도선을 향해 젤로 마이그레이션 할 수 있도록 리드를 연결합니다. 원하는 수준으로 일반적으로 1 V 10 / 젤 cm를 전압을 설정합니다. 그러나 오랫동안 겔 분리의 진행을 모니터하기 위해 염료를 이용하여 이주 RNA 단편 사이에 상당한 간격, 실행을 위해 충분하다. NOTE : 150 V에서 약 20 분 소요됩니다 8cm가 X 8cm 젤 동안 250 V에서 23cm X 25cm 젤, 약 1 시간이 소요됩니다. 더 높은 전압에서 실행할 때 작은 RNA 조각이 더 나은 해상도를 가지고있다. </li><li> 로딩 버퍼에서 염료가 RNA 조각 사이의 분리를위한 충분한 판단의 거리를 마이그레이션 한 경우에는 전원 공급 장치를 끕니다. </li><li> 에티 디움 브로마이드 UV 빛 아래 RNA는 형광 것 이미지. </li><li> 이미지의 사진을 촬영하고 각 조건에서 정제 된 RNA의 형광 강도를 비교합니다. </li></ol> UV-마주 분광학을 통해 4. RNA 정량 <ol><li> NanoDrop 2000, 또는 유사한 시스템에 2 μL의 H 2 O를 놓고 빈을 측정한다. </li><li> 다음에, 분광 광도계에, 정제 다음 각 RNA 샘플 2 μL를 넣고 800 내지 200 nm의 파장 범위에서 UV-비스 측정한다. 참고 : 1.0 (260) 독서는 RNA의 약 40 μg의 / ㎖로 동일합니다,순수 RNA는 260 / 2.1 280 비율을 가지고있다. (45) </li><li> 경우에서 흡광도 OD보다 하나 적은 수득 클레아없는 물 샘플을 희석 한 OD 이상이다. </li><li> 다양한 샘플을 플롯 260 nm에서 OD를 비교하는 그래프 소프트웨어를 사용합니다. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

상기 분석의 Ga (tpfc)의 첨가는 공지 된 DNA 결합 항암제 복합체 티노 마이신 D와 대등 triptolide RNA의 전사를 억제하는 것을 보여준다. 조지아 (tpfc) (GI 50 = 58.1-154.7 μM)의 세포 독성 동작은 방청 특성으로 인해 수 있습니다. 어떠한 전사 억제가 관찰되지 tpfc 이래 tpfc의 세포 독성은 RNA 전사 억제에 의한 것이 아니라 아직 조사되지 않은 다른 수단에 의해 발생된다. 수행 네 ...

화학 요법은 종종 바람직하지 않은 부작용과 제한 대상을 지정하는 광범위한 스펙트럼 세포 독성 제를 포함, 아직 암 생물학의 더 큰 이해와 높은 암을 대상으로 효능과 부작용이 거의 항암제에 대한 수요는 계속 증가하고있다. 한 인간의 암 세포는 자주가 생존 한 활성화되거나 과발현되는 암 유전자에 의존. 따라서이 많은 항암제는 RNA의 전사를 억제하는 그들의 능력에 의해 평가된다. 이러한 변형 유전자의 발현을 차단 치료는 암세포를 효과적으로 제거하고 세포 사멸과 리드. 정상 세포에 대응하는 것보다 3 형질 전환 된 세포는 RNA 전사의 중단에 더 민감하다. 선택적으로 억제 할 것으로 예상된다 전사를 억제하는 4 항암제 암 세포가 생존에 필요한 암 유전자의 발현. (5) 따라서, RNA 전사 전nhibition 잠재적 인 항암제 후보를 식별하고 이들의 작용 메커니즘에 대한 자세한 내용을 배울 수있는 유용한 방법입니다. 이 프로토콜은 조지아 (tpfc)는 화학 요법 약물 티노 마이신 D 및 triptolide와 같은 순서에 RNA의 전사를 억제하는 것을 보여줍니다; 유사한 비교는 다른 항암제 후보 물질이 프로토콜을 이용하여 제조 될 수있다. 악 티노 마이신 D 일반적 임신성 융모 암, 고환암, Wilm의 종양, rhabdomyosacoma 치료에 사용 RNA 전사 억제제이며, 유잉 육종 6. 이 제 1964.Triptolide에 FDA에 의해 시험 관내에서 30 년 동안 다양 담암 동물 모델에서 연구되어왔다 선택적 전사 억제제 인 승인 된 이후 티노 마이신 D는 50여 년간 암 치료에 이용되고있다. (7) corroles의 양친 거대 고리 성격은 작은 분자 나 생물학적으로 다른 약 종류에 비해 상당한 장점을 부여S. 8-14 마크로 문자 같은 큰 분자 예상보다 큰 셀룰러 투과성을 허용하고, 이들이 단백질의 것과 같은 거대 분자의 표면과 상호 작용하기에 충분히 크다. 8 Corroles 생체 분자와 엄격한 비공유 복합체를 형성하는 것으로 알려져있다 약물. corrole 워크의 고유 독성 외에도 10, 우리는 보여준 화학 요법 제를위한 담체 분자, 특히 DNA 인터 - 안트라 사이클린 약물 독소루비신 폰화 corrole 작용있다. 폰화 corrole가 독소루비신와 공동 투여되었을 때, 독소루비신의 IC (50)의 3 배 향상은 DU-145 세포에 대해 관찰 하였다.도 9 corrole 구조가 안정하고, 관능 때 고유 흡광도 변화를 겪는다 고유 흡광도 및 형광 특성을 갖는다 그는 특성에 사용할 수 있습니다. 비계의 10 기능화는 본질적으로 affec하지 않습니다선택적으로 실질적으로 생물학적 속성을 변경할 수 있습니다 corrole의 틀을 수정, 술 폰화 corrole으로 볼 때, corrole, 9-15의 광 물리 특성을 t하지만. (16) 우리는 이전에 일곱 사람의 암 세포주에 대한 여섯 metallocorroles을 평가 하였다. 결과는 인간의 암세포 독성을 향해 특정 금속 이온뿐만 아니라 관능기 교체에 의존하는 것을 나타낸다. 예를 들면, 설 폰화 갈륨 corroles 높은 세포 흡수를 경험 뇌 전이성 전립선 암 세포 (DU-145)의 핵으로 선택적으로 침투; 보다 그것이 다른 세포주의 핵 내로 침투하지 않더라도, 동일한 corrole는 유방암에 대한 더 큰 세포 독성을 나타낸다 (MDA-MB-231), 흑색 종 (SK-MEL-28), 난소 (OVCAR-3) 암세포 전립선 암. 9 초기 세포 기반 분석은 이들 화합물은 항암 치료제, 푸르트 장점으로 약속을 보여 나타냅니다작용 기전에 어 조사. 전사 억제는 특정 유기 금속 착물 17 ~ 27 관찰 그리고 우리는 corrole 가족의 세포 독성 행동에 대한 가능한 메커니즘으로이 과정을 검토하고자한다. 이 전사 분석은 살아있는 세포에서 이러한 분자의 효과에 대한 자세한 정보는 이어질 것 전사 억제를 평가하기위한, 간단 저렴하고 손쉬운 방법을 제공한다. 여기에, 갈륨의 전사 억제는 (III) 5,10,15- (트리스) pentafluorophenylcorrole (GA (tpfc))과 유리 염기 아날로그 5,10,15- (트리스) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (그림 1) 테스트됩니다. 일부 전이 금속 착물과 달리, 갈륨 (III) 산화 환원 비활성이므로 직접 산화 환원 계 대사 경로의 산화 환원 과정에 참여하지 않는다. (28)에 관계없이, 갈륨 (III) 세포 독성 특성을 나타내지 않으며, 치료 목적을 위해 연구되어왔다. 갈륨은 백금 후 항암 치료제에 대한 두 번째 가장 유망한 금속 많은 연구와 조사를 겪고있다; 질산과 염화 갈륨 염은 간암, 림프종, 방광암 및 기타 질병에 대한 임상 시험에서 평가되었다. 29 ~ 34 절은 갈륨 (III)이 항암 corrole 연구에 따라서 이상적입니다. 초기 데이터는 (도 2 참조)의 Ga (tpfc) 및 tpfc이 다양한 암 세포주 낮은 GI (50)의 최대 세포 증식을 50 % 억제하는데 필요한 약물 농도를 보여준다; 이것은 그들의 방청 특성을 결정하기 위해 이들 두 화합물에 대한 상기 실험의 유효성을 확증한다. 우리는 일반적인 항암제 티노 마이신 D 및 triptolide 이러한 화합물을 비교합니다. 악 티노 마이신 D하게 인터는 DNA, RNA 신장을 억제하고, 피코 몰 농도에서 특정 세포주에서 세포 자멸사를 유도 6,35-37 Triptolide가 종양 성장을 억제하는 것으로 나타났다.; 그것은 인간의 XPB / ERCC3, 서브 유닛 O를 결합F 전사 인자 TFIIH, RNA 중합 효소 II 활동의 저해로 이어지는. 6-7,38-40 그것은 일반적 corroles 세포 독성 특성을 보일 것으로 알려져 있지만, 작용으로부터 발생하는 다양한 메커니즘에 대한 약간의 정보가 존재한다. RNA 전사의 Corrole 억제는 생체 거대 분자와의 상호 작용에 더 큰 통찰력을 제공합니다. 같은 다이 로듐 등의 DNA에 결합하는 것으로 알려져 다른 단지, (II, II) 단지, 크롬 (III) 단지, 루테늄 (II) 폴리 피리 단지, 로듐 (III) 단지, 기타 다양한 분야, 18-, RNA 전사 분석을 실시 하였다 27 생체 거대 분자와의 상호 작용에 대한 이해의 결과. 이 손쉬운하고 널리 사용되는 실험은 주어진 분자의 세포 독성 특성을 평가하고 있는지 그 장점을 더 생물학적 테스트를 결정하는 좋은 초기 테스트입니다. RNA 전사 분석은 또한 varyin 많은 수정 가능g 사용되는 화합물 또는 효소의 양; 잠복기, 반응 시간 및 샘플 시점을 변화; 따라서 잠재적으로 많은 양의 데이터를 제공하고, 관심있는 다른 변수 중 DNA 템플릿 길이 및 서열을 변화. 구성 요소를 구입하고 개별적으로 제조 될 수 있지만이 전사 분석도 제공 필요한 모든 반응 구성 요소와 저렴한 키트로 쉽게 사용할 수 있습니다. 이 실험에서는, 높은 수율을 갖는 것으로 알려져 시판 키트를 사용한다. (41) 아가로 오스 겔 전기 영동 및 UV-마주 분광 : 전사 억제를 평가하기 위해, 우리는 두 가지 방법을 사용합니다. 아가 로스 겔 전기 영동 분리, 식별하고, 정화 0.5 25 kb의 DNA 및 RNA 단편에 대한 간단하고 효과적인 방법이다. UV-42 비스 분광법 RNA의 농도 및 순도를 결정하기 위해 사용될 수있다. (43)

<table><tbody><tr><td>Actinomycin D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1410</td><td>Store at 2-8 &amp;deg;C , protect from light</td></tr><tr><td>Triptolide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3652</td><td>Store at 2-8 &amp;deg;C , protect from light</td></tr><tr><td>nuclease-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Transcription Kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td>Store at &amp;ndash;20 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td>CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</td></tr><tr><td>Tris Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6025</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Life Technologies</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>mini Quick Spin RNA Columns</td><td>Roche Life Science</td><td>11814427001</td><td>Store at 2-8 &amp;deg;C , do not freeze</td></tr><tr><td>1 kb DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232S</td><td>Store at &amp;ndash;20 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

an in vitro enzymatic assay to measure transcription inhibition by gallium(iii) and h3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

화학 요법은 종종 많은 부작용과 제한 대상을 지정하는 광범위한 스펙트럼 세포 독성 제를 포함한다. Corroles은 금속 킬레이트 관능기의 신원에 따라 특정 세포주에서 세포 증식 및 세포 독성 차동 특성을 나타낼 tetrapyrrolic 거대 고리의 클래스이다. 특정 세포 라인으로 작용 corroles의 고유 한 동작은 대상 화학 요법의 가능성을 소개합니다. 많은 항암제 RNA의 전사를 억제하는 그들의 능력에 의해 평가된다. 여기에서 우리는 알려진 잠재적 인 억제제의 존재에 RNA 전사를위한 단계별 프로토콜을 제시한다. 겔 전기 영동 및 UV-비스 분광법 전사 RNA 반응 생성물의 평가는 이들의 작용 메카니즘에 대한 자세한 분석에 대한 수정과, 잠재적 항암제 후보 방청 특성에 대한 정보를 제공한다. 작은corrole 세포 독성의 작용 기작에 대한 알려져있다. 갈륨 (III) 5,10,15- (트리스) pentafluorophenylcorrole (GA (tpfc))과 유리 염기 아날로그 5,10,15- (트리스) pentafluorophenylcorrole (tpfc) :이 실험에서, 우리는 두 corrole 화합물을 고려하십시오. RNA 전사 분석법 corroles 방청의 특성을 조사하는데 사용되었다. 다섯 전사 반응을 제조 하였다 : 각각 0.01,의 [템플릿 DNA베이스] 비, 및 치료를받지 않은 : [복잡한]에서 티노 마이신 D, triptolide, 조지아 (tpfc), tpfc 치료 DNA. 전사 반응은 아가로 오스 겔 전기 영동 및 비스 - UV 분광법을 사용하여 4 시간 후에 분석 하였다. 조지아 (tpfc), 티노 마이신 D, 및 triptolide에 의한 명확한 억제가 있습니다. 이 RNA 전사 분석법 또는 공단과 DNA 폴리머 라제 또는 잠복기에 의해 항암제 복합체, DNA, 또는 중합 효소의 농도를 변화시킴으로써, 더욱 상세 기작을 제공하도록 변형 될 수있다이전에 RNA 전사에 XES; 이러한 수정 또는 DNA를 포함하는 효소 억제기구를 구별한다. RNA 전사가 단지이 저하 여부를 테스트 또는 RNA를 가수 분해하는 데 사용할 수 있습니다 후 복잡한 추가. 이 분석은 또한 추가적인 항암 후보를 연구하는데 이용 될 수있다.

아가로 오스 젤 전기 영동에 의해 평가 RNA 전사 질적 아가 로스 겔 전기 영동 화상에 전사 된 RNA를 사용한다. 에티 디움 브로마이드 RNA의 46 수 있도록 영상 (λ 안에 605 nm의, λ 전 = 210 nm의, 285 nm의 =) 바인딩에 형광. 젤 어두운 밴드는 RNA의 높은 농도에 해당합니다. 티노 마이신 D는, triptolide, 또는 하나 corrole 복잡한 RNA의 전사를 억제하면, RN...

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An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

갈륨 (III) 5,10,15- (트리스) pentafluorophenylcorrole 및 유리 염기 유사체 마이크로 낮은 세포 독성을 나타낸다. 이 원고는 corroles에 의해 전사 억제를 평가하기 위해, UV-마주 분광와 RNA 전사 반응, 에티 디움 브로마이드 묻은 젤 이미징 RNA 및 정량화 RNA를 설명하고 항암 후보 속성을 평가하는 간단한 방법을 보여줍니다.

<em&gt; 체외</em&gt; 효소 분석은 갈륨 (III) 및 H에 의해 전사 억제를 측정하기 위해<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15 트리스 (펜타 플루오로 페닐) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

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Bioengineering

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

11.5K 조회수.  California Institute of Technology.  갈륨 (III) 5,10,15- (트리스) pentafluorophenylcorrole 및 유리 염기 유사체 마이크로 낮은 세포 독성을 나타낸다. 이 원고는 corroles에 의해 전사 억제를 평가하기 위해, UV-마주 분광와 RNA 전사 반응, 에티 디움 브로마이드 묻은 젤 이미징 RNA 및 정량화 RNA를 설명하고 항암 후보 속성을 평가하는 간단한 방법을 보여줍니다. 

비디오: An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process requires multi-subunit DNA-dependent RNA polymerase (RNAP) and a series of transcription factors that act to modulate the activity of RNAP during gene expression. Sequencing gel electrophoresis of radiolabeled transcripts is used to provide detailed mechanistic information on how transcription proceeds and what parameters can affect it. In this paper we describe the protocol to study how the essential elongation factor NusA regulates transcriptional pausing, as well as a method to identify an antibacterial agent targeting transcription initiation through inhibition of RNAP holoenzyme formation. These methods can be used a as platform for the development of additional approaches to explore the mechanism of action of the transcription factors which still remain unclear, as well as new antibacterial agents targeting transcription which is an underutilized drug target in antibiotic research and development.

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

시험 관내 전사 분석 실험 및 약물 발견에의 응용

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

연구

유전학

Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation

Embryonic development is a multistep process involving activation and repression of many genes. Enhancer elements in the genome are known to contribute to tissue and cell-type specific regulation of gene expression during the cellular differentiation. Thus, their identification and further investigation is important in order to understand how cell fate is determined. Integration of gene expression data (e.g., microarray or RNA-seq) and results of chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based genome-wide studies (ChIP-seq) allows large-scale identification of these regulatory regions. However, functional validation of cell-type specific enhancers requires further in vitro and in vivo experimental procedures. Here we describe how active enhancers can be identified and validated experimentally. This protocol provides a step-by-step workflow that includes: 1) identification of regulatory regions by ChIP-seq data analysis, 2) cloning and experimental validation of putative regulatory potential of the identified genomic sequences in a reporter assay, and 3) determination of enhancer activity in vivo by measuring enhancer RNA transcript level. The presented protocol is detailed enough to help anyone to set up this workflow in the lab. Importantly, the protocol can be easily adapted to and used in any cellular model system.

In this work we provide an experimental workflow of how active enhancers can be identified and experimentally validated.

예측 및 유전자 규제 요소의 검증은 레티노 산 유도 배아 동안 활성화 된 세포 분화 줄기

Embryonic development is a multistep process involving activation and repression of many genes. Enhancer elements in the genome are known to contribute to ...

발생학

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

포유류 세포에서 미세 Coccal 뉴클레아제사용 염색질 면역침전 분석

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including cancers. These small regulatory RNAs mainly interact with the 3&#8217; untranslated regions (3&#8217; UTR) of their target messenger RNAs (mRNAs) ultimately resulting in the inhibition of decoding processes of mRNAs and the augmentation of target mRNA degradations. Based on the expression levels and intracellular functions, miRNAs are able to serve as regulatory factors of oncogenic and tumor-suppressive mRNAs. Identification of bona fide target genes of a miRNA among hundreds or even thousands of computationally predicted targets is a crucial step to discern the roles and basic molecular mechanisms of a miRNA of interest. Various miRNA target prediction programs are available to search possible miRNA-mRNA interactions. However, the most challenging question is how to validate direct target genes of a miRNA of interest. This protocol describes a reproducible strategy of key methods on how to identify miRNA targets related to the function of a miRNA. This protocol presents a practical guide on step-by-step procedures to uncover miRNA levels, functions, and related target mRNAs using the probe-based real-time polymerase chain reaction (PCR), sulforhodamine B (SRB) assay following a miRNA mimic transfection, dose-response curve generation, and luciferase assay along with the cloning of 3&#8217; UTR of a gene, which is necessary for proper understanding of the roles of individual miRNAs.

This protocol uses a probe-based real-time polymerase chain reaction (PCR), a sulforhodamine B (SRB) assay, 3&#8217; untranslated regions (3&#8217; UTR) cloning, and a luciferase assay to verify the target genes of a miRNA of interest and to understand the functions of miRNAs.

종양 세포에서 MicroRNA 수준, 기능 및 관련 표적 유전자를 평가하기 위한 시험관 내 프로토콜

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

의학

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. Currently, the characterization of novel drugs towards their interactions with &#946;-arrestins and other cytosolic proteins is extremely valuable in the field of GPCR drug discovery particularly during the study of GPCR biased agonism. Here, we show the application of a novel structural complementation assay to accurately monitor receptor-&#946;-arrestin interactions in real time living systems. This method is simple, accurate and can be easily extended to any GPCR of interest and also it has the advantage that it overcomes unspecific interactions due to the presence of a low expression promoter present in each vector system. This structural complementation assay provides key features that allow an accurate and precise monitoring of receptor-&#946;-arrestin interactions, making it suitable in the study of biased agonism of any GPCR system as well as GPCR c-terminus &#8216;phosphorylation codes&#8217; written by different GPCR-kinases (GRKs) and post-translational modifications of arrestins that stabilize or destabilize the receptor-&#946;-arrestin complex.

GPCR-&#946;-arrestin interactions are an emerging field in GPCR drug discovery. Accurate, precise and easy to set up methods are necessary to monitor such interactions in living systems. We show a structural complementation assay to monitor GPCR-&#946;-arrestin interactions in real time living cells, and it can be extended to any GPCR.

약물 발견을 가속화하기 위해 실시간 생활 시스템에서 GPCR-β-arrestin1/2 상호 작용 모니터링

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...

생화학

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent one of the most promising targets for the pharmaceutical industry. Ergo, the design, implementation, and optimization of GPCR ligand screening assays is crucial, as they represent remote-control tools for drug discovery and for manipulating GPCR pharmacology and outcomes. In the past, G-protein dependent assays typified this area of research, detecting ligand-induced events and quantifying the generation of secondary messengers. However, since the advent of functional selectivity, as well as an increased awareness of several other G protein-independent pathways and the limitations associated with G-protein dependent assays, there is a greater push towards the creation of alternative GPCR ligand screening assays. Towards this endeavor, we describe the application of one such resource, the PRESTO-Tango platform, a luciferase reporter-based system that enables the parallel and simultaneous interrogation of the human GPCR-ome, a feat which was previously considered technically and economically unfeasible. Based on a G-protein independent &#946;-arrestin2 recruitment assay, the universality of &#946;-arrestin2-mediated trafficking and signaling at GPCRs makes PRESTO-TANGO an apt tool for studying approximately 300 non-olfactory human GPCRs, including approximately 100 orphan receptors. PRESTO-Tango&#39;s sensitivity and robustness make it suitable for primary high-throughput screens using compound libraries, employed to uncover new GPCR targets for known drugs or to discover new ligands for orphan receptors.

Given that GPCRs are attractive druggable targets, GPCR ligand screening is thus indispensable for the identification of lead compounds and for deorphanization studies. Towards these efforts, we describe PRESTO-Tango, an open-source resource platform used for simultaneous profiling of transient &#946;-arrestin2 recruitment at approximately 300 GPCRs using a TEV-based reporter assay.

PRESTO-탱고 분석기를 사용하여 GPCR 전체 규모의 리간드 스크리닝을 위한 β-Arrestin2 모집의 병렬 심문

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) establish and maintain the DNA methylation pattern. Changes to the normal DNA methylation pattern are linked to cancer development and progression, making DNMTs potential cancer drug targets. Thus, identifying and characterizing novel small molecule inhibitors of these enzymes is of great importance. This paper presents a protocol that can be used to screen for DNA methyltransferase inhibitors. The continuous coupled kinetics assay allows for initial velocities of DNA methylation to be determined in the presence and absence of potential small molecule inhibitors. The assay uses the methyl-sensitive endonuclease Gla I to couple methylation of a hemimethylated DNA substrate to fluorescence generation.
This continuous assay allows for enzyme activity to be monitored in real time. Conducting the assay in small volumes in microtiter plates reduces the cost of reagents. Using this assay, a small example screen was conducted for inhibitors of DNMT1, the most abundant DNMT isozyme in humans. The highly substituted anthraquinone natural product, laccaic acid A, is a potent, DNA-competitive inhibitor of DNMT1. Here, we examine three potential small molecule inhibitors &#8212; anthraquinones or anthraquinone-like molecules with one to three substituents &#8212; at two concentrations to describe the assay protocol. Initial velocities are used to calculate the percent activity observed in the presence of each molecule. One of three compounds examined exhibits concentration-dependent inhibition of DNMT1 activity, indicating that it is a potential inhibitor of DNMT1.

DNA methyltransferases are potential cancer drug targets. Here, a protocol is presented to assess small molecules for DNA methyltransferase inhibition. This assay utilizes an endonuclease to couple DNA methylation to fluorescence generation and allows for enzyme activity to be monitored in real time.&#160;

DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

In Vitro Enzyme Measurement to Test Pharmacological Chaperone Responsiveness in Fabry and Pompe Disease

The use of personalized medicine to treat rare monogenic diseases like lysosomal storage disorders (LSDs) is challenged by complex clinical trial designs, high costs, and low patient numbers. Hundreds of mutant alleles are implicated in most of the LSDs. The diseases are typically classified into 2 to 3 different clinical types according to severity. Moreover, molecular characterization of the genotype can help predict clinical outcomes and inform patient care. Therefore, we developed a simple cell culture assay based on HEK293H cells heterologously over-expressing the mutations identified in Fabry and Pompe disease. A similar assay has recently been introduced as a preclinical test to identify amenable mutations for Pharmacological Chaperone Therapy (PCT) in Fabry disease. This manuscript describes an amended cell culture assay which enables rapid phenotypic assessment of allelic variants in Fabry and Pompe disease to identify eligible patients for PCT and may aid in the development of novel pharmacochaperones.

In Vitro Enzyme Measurement to Test Pharmacological Chaperone Responsiveness in Fabry and Pompe Disease

There is a demand to make pre-clinical testing for a novel class of "orphan" drugs called pharmacological chaperones reproducible, fast, and efficient. We developed a simple, highly standardized, and versatile cell culture-based assay to screen for eligible patients as well as novel pharmacological chaperone drugs.

생체 외에서 Fabry에 Pompe 질병 테스트 약리 보호자 응답성을 효소 측정

The use of personalized medicine to treat rare monogenic diseases like lysosomal storage disorders (LSDs) is challenged by complex clinical trial designs, ...

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, and multiwell-based assays are used to measure transcription factor activity. However, these assays are nonquantitative, lack specificity, may involve the use of radiolabeled oligonucleotides, and may not be adaptable for the screening of inhibitors of DNA binding. On the other hand, using a quantitative DNA-binding enzyme-linked immunosorbent assay (D-ELISA) assay, we demonstrate nuclear protein interactions with DNA using the RUNX2 transcription factor that depend on specific association with consensus DNA-binding sequences present on biotin-labeled oligonucleotides. Preparation of cells, extraction of nuclear protein, and design of double stranded oligonucleotides are described. Avidin-coated 96-well plates are fixed with alkaline buffer and incubated with nuclear proteins in nucleotide blocking buffer. Following extensive washing of the plates, specific primary antibody and secondary antibody incubations are followed by the addition of horseradish peroxidase substrate and development of the colorimetric reaction. Stop reaction mode or continuous kinetic monitoring were used to quantitatively measure protein interaction with DNA. We discuss appropriate specificity controls, including treatment with non-specific IgG or without protein or primary antibody. Applications of the assay are described including its utility in drug screening and representative positive and negative results are discussed.

We developed a quantitative DNA-binding, ELISA-based assay to measure transcription factor interactions with DNA. High specificity for the RUNX2 protein was achieved with a consensus DNA-recognition oligonucleotide and specific monoclonal antibody. Colorimetric detection with an enzyme-coupled antibody substrate reaction was monitored in real time.

유전자 발현의 DNA 상호 작용, 디스 전사 레귤레이터, 그리고 소설 안티 종양 에이전트를 식별 : 단백질을 연구하는 정량 분석

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

요약

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