우리는 진심 겔 전기 영동에 대한 도움말 박사 신디 N. 애기를 감사하고, DNA 및 제한 효소의 관대 한 기부 앤디 저우와 마이클 Grodick. 우리는 기꺼이 장비 및 재료에 관대 한 접근을 위해 교수 J. 히스 교수 D. 프로 버를 인정합니다. 우리는 도움이 제안 박사 깐 Sorasaenee 감사합니다. 우리는 비디오의 개략도에 사용 된 그림을 만드는 메리 H. 당나라 감사합니다. 자금은 존슨 앤 존슨 (Johnson &amp; Johnson)과 USC Y86786에 의해 제공되었다.

참고 : RNA로 작업 할 때 DNA 및 RNA를 저하의 DNase와의 RNase 효소에 의한 오염을 방지하기 위해 깨끗한 작업 환경을 유지한다. 그 피펫 팁 및 튜브의 DNase와의 RNase 무료로 확인합니다. 여기에는 오염 제거 솔루션 등을 피펫, 튜브 홀더, 같은 실험실 표면과 장비를 닦아하는 것이 도움이된다. Corrole 치료 1. RNA 전사 <ol><li> corrole을 준비하고 0.01 화합물 억제제 : [DNA] : [복잡한] 1 몰비. 주 : 0.43 pmol의 DNA를 사용 DNA 템플릿에서 E. LIGA 유전자 APET-28C 벡터이었다 : 우리의 경우, 비율은 4.3 fmol 복합체이었다 T7 프로모터의 제어하에 대장균. T7 프로모터와 다른 DNA는 또한 전사 분석을 실행하기위한 유효한 후보들이다. <ol><li> 티노 마이신 D, 깨끗하고, 별도의 용기에 triptolide, tpfc, 디메틸 설폭 사이드에서 조지아 (tpfc) (DMSO)에 용해. [C의 몰비가 1 : 0.01의 최종 농도를 얻omplex] : 뉴 클레아없는 물과 희석액을 사용하여 [DNA]. <ol><li> 1.8 ml의 DMSO에 1 mg의 티노 마이신 D 녹인다. 나누어지는 10 별도의 용기에 μL와는 1/100 희석을 만들 핵산 분해 효소가없는 물 1까지 희석. 나누어지는 한 별도의 용기에 희석의 μL 및 1 / 1,000 희석을 만들 핵산 분해 효소가없는 물 1까지 희석. 주 : 티노 마이신 D의 용액의 최종 농도는 4.3 fmol이다. </li><li> 0.64 ml의 DMSO에 1 mg을 triptolide을 녹여. 나누어지는 1 별도의 용기에 μL 및 1 / 1,000 희석을 만들 핵산 분해 효소가없는 물 1까지 희석. 나누어지는 한 별도의 용기에 희석의 μL 및 제 1 / 1,000 희석을 만들 핵산 분해 효소가없는 물 1까지 희석. 참고 : triptolide의 최종 용액의 농도는 4.3 fmol이다. </li><li> 2.9 ml의 DMSO에 1 mg을 tpfc을 녹여. 10 μL 별도의 용기와 뉴 클레아없는 물 1까지 희석 나누어은 1/100 D를 생성하는ilution. 나누어지는 한 별도의 용기에 희석의 μL 및 1 / 1,000 희석을 만들 핵산 분해 효소가없는 물 1까지 희석. 참고 : tpfc의 최종 용액의 농도는 4.3 fmol이다. </li><li> 2.6 ml의 DMSO에 1 mg의 가인 (tpfc)을 녹여. 나누어지는 10 별도의 용기에 μL와는 1/100 희석을 만들 핵산 분해 효소가없는 물 1까지 희석. 나누어지는 한 별도의 용기에 희석의 μL 및 1 / 1,000 희석을 만들 핵산 분해 효소가없는 물 1까지 희석. 참고 : 조지아 (tpfc)의 최종 용액의 농도는 4.3 fmol이다. 참고 :이 co​​rroles 및 억제제는 물에 용해되지 않고 DMSO에 미리 용해해야합니다. (1 % 이하) DMSO 소량의 세포 (게시되지 않은 데이터)에서 세포 독성을 유발하지 말 것. </li></ol></li></ol></li><li> 이전 전사 반응을 시작으로, 개별적으로 필요한 시약을 준비하거나 상용 공급 업체를 구입할 수 있습니다. <ol><li> 얼음 모든 동결에 해동n 개의 시약 (냉동 시약의 목록은 표 1 참조). </li><li> 그들이 완전히 용액에 용해 될 때까지 혼합 10 배 반응 버퍼 및 4 리보 뉴클레오티드 (ATP, CTP, GTP 및 UTP) 솔루션 시간을 허용합니다. </li><li> 간단히 튜브의 테두리에 물질의 손실을 방지하기 위해 모든 시약을 원심 분리기. RT에서 10 배 반응 버퍼를 유지하면서 얼음에 일단 저장 리보 뉴클레오티드를 해동. </li><li> RT에서 전사 반응 용 시약 수확기 (시약의 목록은 표 2 참조). 주 : 상기 반응을 얼음보다는 RT에서 조립되는 경우 10 배 반응 완충액 스퍼는 템플릿 DNA 공 침물을 할 수있다. </li><li> 튜브를 튕기거나 위 아래로 부드럽게 혼합물을 피펫 팅에 의해 철저하게 섞는다. 혼합 한 후, 원심 간단히 튜브의 하단에 반응 혼합물을 수집한다. </li><li> 2-4 시간의 합계 37 ℃에서 반응 혼합물을 배양한다. 참고 : 필요한 반응 시간이 달라집니다DNA 템플릿 크기와 순서에. 이 단계는 특정 순서에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다. 짧은 템플릿은 총 RNA의 높은 수율에 대한 이상 반응 시간을 필요로 할 수있다. </li><li> -20 ° C에서 각각의 시간 및 저장 후 각 반응에서 4 μL 씩을 제거합니다. 원하는 시점들에 대해 필요에 따라 수정합니다. </li></ol></li></ol> 2. RNA 스핀 열 <ol><li> 전사 반응 후, 마이크로 원심 호환 크로마토 그래피 컬럼을 사용하여 RNA를 정제. 주 :. RNA 스핀 컬럼의 사용은 80 % 이상 회복에 20 개 이상의 염기 결과와 RNA를 정제 44 참고 : 컬럼 크로마토 그래피는 RNA를 정화하는 일반적이고 편리한 방법입니다. 클로로포름 추출, 이소프로판올 침전뿐만 아니라 다른 시판 키트 : 다른 정제 방법은 또한, 염화 리튬의 석출, 페놀로서 존재한다. <ol><li> 균등 격렬 반전시킴으로써 열 버퍼에 세파 덱스 행렬을 재현 탁열 세 번 이상. 급격하게 열을 쓸어 넘겨이 작업을 수행합니다. </li><li> 열에서 상단 캡을 제거합니다. 캡의 일부 잔여 세파 덱스 매트릭스가있을 것이다; 캡 매트릭스 충전되면 열의 상 캡을 교체 행렬의 대부분이 열에 때까지 이전 단계를 반복한다. </li><li> 컬럼의 하단 끝을 스냅. 참고 : 일부 액체는 컬럼에서 탈출 할 수 있습니다. </li><li> 열을 포장합니다. <ol><li> 멸균 (의 RNase와 DNase의 자유)를 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 열을 놓습니다. </li><li> 1 분 동안 1,000 XG에서 탁상 원심 분리기에서 튜브를 원심 분리기. </li></ol></li><li> 컬럼에서 용출 버퍼와 1.5 ML의 microcentrifuge 관을 폐기하십시오. </li><li> 즉시 새로운 살균 된 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에 열을 배치하고 열 베드의 중심 샘플 피펫. 열 과부하를 방지하기 위해 샘플의 20 ~ 50 μl를 사용합니다. </li><li> 1000 XG에서 탁상 원심 분리기에서 튜브를 원심 분리기1 분. 참고 : 리제 정제 된 RNA 샘플입니다. </li></ol></li></ol> 아가 로스 겔 전기 영동 (3) (1 % 아가로 스겔) 42 주 : 티듐 브로마이드 DNA 및 RNA에 결합하는 형광에 따라서 이러한 생체 분자는 0.5 ㎍ / ㎖의에 티듐 브로마이드 수용액으로 이들을 배양하여 UV 광으로 가시화 될 수있다. <ol><li> 물 5 ㎎ 티듐 브로마이드 10 ml에 용해시켜 티듐 브로마이드 (0.5 ㎎ / ㎖)의 1000 배 스톡 용액을 준비한다. </li><li> 겔 전기 영동에 대한 트리스 아세테이트 EDTA (TAE) 실행 버퍼를 준비합니다. 50 배 TAE 버퍼가 2.0 M 트리스 - 아세테이트 0.05 M 에틸렌 디아민 산 (EDTA)와 결합하고 8.5로 pH를 조절할 수 있도록합니다. </li><li> 버퍼 1 L에 1X TAE 아가로 오스 10g을 초순수에 용해하고, 종래의 전자 레인지 아가를 용융하여 1 % (중량 / 부피) 아가로 오스 겔을 준비한다. 이를 50 ° C로 냉각되면, 1 % 아가 로스 겔 솔루로 1000 배에 티듐 브로마이드 용액 1ml를 첨가하여기, 부드럽게 소용돌이에 의해 밀폐 된 용기에 반전 혼합 한 후 겔 캐스팅 플랫폼에 아가로 오스 솔루션을 부어 젤 실온에서 응고 할 수 있습니다. 참고 : 에티 디움 브로마이드 돌연변이 잠재적 인 발암 물질이다. 장갑을 착용하고 조심스럽게 솔루션을 처리합니다. 에티 디움 브로마이드의 적절한 처리 절차 내용은 다음을 참조하십시오 <a href="http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667">http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667을</a> . </li><li> 겔 고화 후, 전기 영동 탱크 세트 겔을 배치. 우물이 침수 될 때까지 젤을 충당하기에 충분한 TAE 버퍼를 추가합니다. TAE 버퍼의 레벨이 약 1mm 겔의 수준 이상 있는지 확인합니다. 겔 빗를 제거합니다. 참고 : 우물 침수 후 빗 제거는 우물에 갇혀되는 공기 주머니를 방지 할 수 있습니다. </li><li> RNA 샘플을 준비합니다. 1 μL 젤 로딩 버퍼 각 정제 샘플 나누어지는 1 μl를 결합 (또는 1 ㎕의 10 배 로딩 버퍼와 dilut와에드 뉴 클레아없는 물 10 μL)과에 마이크로 피펫과 피펫 팅에 의해 아래로 완전히 혼합. 참고 : 10 배 로딩 버퍼는 20 % 피콜 (400), 0.1 M 나 2 EDTA, pH가 8.0, 1.0 % SDS, 푸른 0.25 % 브로 모 페놀이 포함되어 있습니다. 이 브로 모 페놀 블루만큼 빠르게 ~ 50 %를 실행하며 매우 긴 실행을 모니터링하는 데 유용 할 수 0.25 % 크실렌 cyanol 또한, 로딩 완충액에 첨가 할 수있다. (42) </li><li> 신중하게 잘 각각의 바닥에 솔루션을 피펫 팅하여 각 샘플 젤을로드합니다. 공기 방울을 떠나거나 우물 사이에 샘플을 혼합하지 않도록주의하십시오. 주 : RNA 래더도 사체의 크기를 결정하는데 사용될 수있다. </li><li> DNA는 양극 도선을 향해 젤로 마이그레이션 할 수 있도록 리드를 연결합니다. 원하는 수준으로 일반적으로 1 V 10 / 젤 cm를 전압을 설정합니다. 그러나 오랫동안 겔 분리의 진행을 모니터하기 위해 염료를 이용하여 이주 RNA 단편 사이에 상당한 간격, 실행을 위해 충분하다. NOTE : 150 V에서 약 20 분 소요됩니다 8cm가 X 8cm 젤 동안 250 V에서 23cm X 25cm 젤, 약 1 시간이 소요됩니다. 더 높은 전압에서 실행할 때 작은 RNA 조각이 더 나은 해상도를 가지고있다. </li><li> 로딩 버퍼에서 염료가 RNA 조각 사이의 분리를위한 충분한 판단의 거리를 마이그레이션 한 경우에는 전원 공급 장치를 끕니다. </li><li> 에티 디움 브로마이드 UV 빛 아래 RNA는 형광 것 이미지. </li><li> 이미지의 사진을 촬영하고 각 조건에서 정제 된 RNA의 형광 강도를 비교합니다. </li></ol> UV-마주 분광학을 통해 4. RNA 정량 <ol><li> NanoDrop 2000, 또는 유사한 시스템에 2 μL의 H 2 O를 놓고 빈을 측정한다. </li><li> 다음에, 분광 광도계에, 정제 다음 각 RNA 샘플 2 μL를 넣고 800 내지 200 nm의 파장 범위에서 UV-비스 측정한다. 참고 : 1.0 (260) 독서는 RNA의 약 40 μg의 / ㎖로 동일합니다,순수 RNA는 260 / 2.1 280 비율을 가지고있다. (45) </li><li> 경우에서 흡광도 OD보다 하나 적은 수득 클레아없는 물 샘플을 희석 한 OD 이상이다. </li><li> 다양한 샘플을 플롯 260 nm에서 OD를 비교하는 그래프 소프트웨어를 사용합니다. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

상기 분석의 Ga (tpfc)의 첨가는 공지 된 DNA 결합 항암제 복합체 티노 마이신 D와 대등 triptolide RNA의 전사를 억제하는 것을 보여준다. 조지아 (tpfc) (GI 50 = 58.1-154.7 μM)의 세포 독성 동작은 방청 특성으로 인해 수 있습니다. 어떠한 전사 억제가 관찰되지 tpfc 이래 tpfc의 세포 독성은 RNA 전사 억제에 의한 것이 아니라 아직 조사되지 않은 다른 수단에 의해 발생된다. 수행 네 ...

화학 요법은 종종 바람직하지 않은 부작용과 제한 대상을 지정하는 광범위한 스펙트럼 세포 독성 제를 포함, 아직 암 생물학의 더 큰 이해와 높은 암을 대상으로 효능과 부작용이 거의 항암제에 대한 수요는 계속 증가하고있다. 한 인간의 암 세포는 자주가 생존 한 활성화되거나 과발현되는 암 유전자에 의존. 따라서이 많은 항암제는 RNA의 전사를 억제하는 그들의 능력에 의해 평가된다. 이러한 변형 유전자의 발현을 차단 치료는 암세포를 효과적으로 제거하고 세포 사멸과 리드. 정상 세포에 대응하는 것보다 3 형질 전환 된 세포는 RNA 전사의 중단에 더 민감하다. 선택적으로 억제 할 것으로 예상된다 전사를 억제하는 4 항암제 암 세포가 생존에 필요한 암 유전자의 발현. (5) 따라서, RNA 전사 전nhibition 잠재적 인 항암제 후보를 식별하고 이들의 작용 메커니즘에 대한 자세한 내용을 배울 수있는 유용한 방법입니다. 이 프로토콜은 조지아 (tpfc)는 화학 요법 약물 티노 마이신 D 및 triptolide와 같은 순서에 RNA의 전사를 억제하는 것을 보여줍니다; 유사한 비교는 다른 항암제 후보 물질이 프로토콜을 이용하여 제조 될 수있다. 악 티노 마이신 D 일반적 임신성 융모 암, 고환암, Wilm의 종양, rhabdomyosacoma 치료에 사용 RNA 전사 억제제이며, 유잉 육종 6. 이 제 1964.Triptolide에 FDA에 의해 시험 관내에서 30 년 동안 다양 담암 동물 모델에서 연구되어왔다 선택적 전사 억제제 인 승인 된 이후 티노 마이신 D는 50여 년간 암 치료에 이용되고있다. (7) corroles의 양친 거대 고리 성격은 작은 분자 나 생물학적으로 다른 약 종류에 비해 상당한 장점을 부여S. 8-14 마크로 문자 같은 큰 분자 예상보다 큰 셀룰러 투과성을 허용하고, 이들이 단백질의 것과 같은 거대 분자의 표면과 상호 작용하기에 충분히 크다. 8 Corroles 생체 분자와 엄격한 비공유 복합체를 형성하는 것으로 알려져있다 약물. corrole 워크의 고유 독성 외에도 10, 우리는 보여준 화학 요법 제를위한 담체 분자, 특히 DNA 인터 - 안트라 사이클린 약물 독소루비신 폰화 corrole 작용있다. 폰화 corrole가 독소루비신와 공동 투여되었을 때, 독소루비신의 IC (50)의 3 배 향상은 DU-145 세포에 대해 관찰 하였다.도 9 corrole 구조가 안정하고, 관능 때 고유 흡광도 변화를 겪는다 고유 흡광도 및 형광 특성을 갖는다 그는 특성에 사용할 수 있습니다. 비계의 10 기능화는 본질적으로 affec하지 않습니다선택적으로 실질적으로 생물학적 속성을 변경할 수 있습니다 corrole의 틀을 수정, 술 폰화 corrole으로 볼 때, corrole, 9-15의 광 물리 특성을 t하지만. (16) 우리는 이전에 일곱 사람의 암 세포주에 대한 여섯 metallocorroles을 평가 하였다. 결과는 인간의 암세포 독성을 향해 특정 금속 이온뿐만 아니라 관능기 교체에 의존하는 것을 나타낸다. 예를 들면, 설 폰화 갈륨 corroles 높은 세포 흡수를 경험 뇌 전이성 전립선 암 세포 (DU-145)의 핵으로 선택적으로 침투; 보다 그것이 다른 세포주의 핵 내로 침투하지 않더라도, 동일한 corrole는 유방암에 대한 더 큰 세포 독성을 나타낸다 (MDA-MB-231), 흑색 종 (SK-MEL-28), 난소 (OVCAR-3) 암세포 전립선 암. 9 초기 세포 기반 분석은 이들 화합물은 항암 치료제, 푸르트 장점으로 약속을 보여 나타냅니다작용 기전에 어 조사. 전사 억제는 특정 유기 금속 착물 17 ~ 27 관찰 그리고 우리는 corrole 가족의 세포 독성 행동에 대한 가능한 메커니즘으로이 과정을 검토하고자한다. 이 전사 분석은 살아있는 세포에서 이러한 분자의 효과에 대한 자세한 정보는 이어질 것 전사 억제를 평가하기위한, 간단 저렴하고 손쉬운 방법을 제공한다. 여기에, 갈륨의 전사 억제는 (III) 5,10,15- (트리스) pentafluorophenylcorrole (GA (tpfc))과 유리 염기 아날로그 5,10,15- (트리스) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (그림 1) 테스트됩니다. 일부 전이 금속 착물과 달리, 갈륨 (III) 산화 환원 비활성이므로 직접 산화 환원 계 대사 경로의 산화 환원 과정에 참여하지 않는다. (28)에 관계없이, 갈륨 (III) 세포 독성 특성을 나타내지 않으며, 치료 목적을 위해 연구되어왔다. 갈륨은 백금 후 항암 치료제에 대한 두 번째 가장 유망한 금속 많은 연구와 조사를 겪고있다; 질산과 염화 갈륨 염은 간암, 림프종, 방광암 및 기타 질병에 대한 임상 시험에서 평가되었다. 29 ~ 34 절은 갈륨 (III)이 항암 corrole 연구에 따라서 이상적입니다. 초기 데이터는 (도 2 참조)의 Ga (tpfc) 및 tpfc이 다양한 암 세포주 낮은 GI (50)의 최대 세포 증식을 50 % 억제하는데 필요한 약물 농도를 보여준다; 이것은 그들의 방청 특성을 결정하기 위해 이들 두 화합물에 대한 상기 실험의 유효성을 확증한다. 우리는 일반적인 항암제 티노 마이신 D 및 triptolide 이러한 화합물을 비교합니다. 악 티노 마이신 D하게 인터는 DNA, RNA 신장을 억제하고, 피코 몰 농도에서 특정 세포주에서 세포 자멸사를 유도 6,35-37 Triptolide가 종양 성장을 억제하는 것으로 나타났다.; 그것은 인간의 XPB / ERCC3, 서브 유닛 O를 결합F 전사 인자 TFIIH, RNA 중합 효소 II 활동의 저해로 이어지는. 6-7,38-40 그것은 일반적 corroles 세포 독성 특성을 보일 것으로 알려져 있지만, 작용으로부터 발생하는 다양한 메커니즘에 대한 약간의 정보가 존재한다. RNA 전사의 Corrole 억제는 생체 거대 분자와의 상호 작용에 더 큰 통찰력을 제공합니다. 같은 다이 로듐 등의 DNA에 결합하는 것으로 알려져 다른 단지, (II, II) 단지, 크롬 (III) 단지, 루테늄 (II) 폴리 피리 단지, 로듐 (III) 단지, 기타 다양한 분야, 18-, RNA 전사 분석을 실시 하였다 27 생체 거대 분자와의 상호 작용에 대한 이해의 결과. 이 손쉬운하고 널리 사용되는 실험은 주어진 분자의 세포 독성 특성을 평가하고 있는지 그 장점을 더 생물학적 테스트를 결정하는 좋은 초기 테스트입니다. RNA 전사 분석은 또한 varyin 많은 수정 가능g 사용되는 화합물 또는 효소의 양; 잠복기, 반응 시간 및 샘플 시점을 변화; 따라서 잠재적으로 많은 양의 데이터를 제공하고, 관심있는 다른 변수 중 DNA 템플릿 길이 및 서열을 변화. 구성 요소를 구입하고 개별적으로 제조 될 수 있지만이 전사 분석도 제공 필요한 모든 반응 구성 요소와 저렴한 키트로 쉽게 사용할 수 있습니다. 이 실험에서는, 높은 수율을 갖는 것으로 알려져 시판 키트를 사용한다. (41) 아가로 오스 겔 전기 영동 및 UV-마주 분광 : 전사 억제를 평가하기 위해, 우리는 두 가지 방법을 사용합니다. 아가 로스 겔 전기 영동 분리, 식별하고, 정화 0.5 25 kb의 DNA 및 RNA 단편에 대한 간단하고 효과적인 방법이다. UV-42 비스 분광법 RNA의 농도 및 순도를 결정하기 위해 사용될 수있다. (43)

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="809">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:219px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Actinomycin D</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1410</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triptolide</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3652</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">nuclease-free H2O&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1334</td>
			<td>Store at &#8211;20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7637</td>
			<td>CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Tris Acetate</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">mini Quick Spin RNA Columns</td>
			<td style="width:219px;">Roche Life Science</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11814427001</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , do not freeze</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">1 kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:219px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">N3232S</td>
			<td>Store at &#8211;20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro enzymatic assay to measure transcription inhibition by gallium(iii) and h3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

화학 요법은 종종 많은 부작용과 제한 대상을 지정하는 광범위한 스펙트럼 세포 독성 제를 포함한다. Corroles은 금속 킬레이트 관능기의 신원에 따라 특정 세포주에서 세포 증식 및 세포 독성 차동 특성을 나타낼 tetrapyrrolic 거대 고리의 클래스이다. 특정 세포 라인으로 작용 corroles의 고유 한 동작은 대상 화학 요법의 가능성을 소개합니다. 많은 항암제 RNA의 전사를 억제하는 그들의 능력에 의해 평가된다. 여기에서 우리는 알려진 잠재적 인 억제제의 존재에 RNA 전사를위한 단계별 프로토콜을 제시한다. 겔 전기 영동 및 UV-비스 분광법 전사 RNA 반응 생성물의 평가는 이들의 작용 메카니즘에 대한 자세한 분석에 대한 수정과, 잠재적 항암제 후보 방청 특성에 대한 정보를 제공한다. 작은corrole 세포 독성의 작용 기작에 대한 알려져있다. 갈륨 (III) 5,10,15- (트리스) pentafluorophenylcorrole (GA (tpfc))과 유리 염기 아날로그 5,10,15- (트리스) pentafluorophenylcorrole (tpfc) :이 실험에서, 우리는 두 corrole 화합물을 고려하십시오. RNA 전사 분석법 corroles 방청의 특성을 조사하는데 사용되었다. 다섯 전사 반응을 제조 하였다 : 각각 0.01,의 [템플릿 DNA베이스] 비, 및 치료를받지 않은 : [복잡한]에서 티노 마이신 D, triptolide, 조지아 (tpfc), tpfc 치료 DNA. 전사 반응은 아가로 오스 겔 전기 영동 및 비스 - UV 분광법을 사용하여 4 시간 후에 분석 하였다. 조지아 (tpfc), 티노 마이신 D, 및 triptolide에 의한 명확한 억제가 있습니다. 이 RNA 전사 분석법 또는 공단과 DNA 폴리머 라제 또는 잠복기에 의해 항암제 복합체, DNA, 또는 중합 효소의 농도를 변화시킴으로써, 더욱 상세 기작을 제공하도록 변형 될 수있다이전에 RNA 전사에 XES; 이러한 수정 또는 DNA를 포함하는 효소 억제기구를 구별한다. RNA 전사가 단지이 저하 여부를 테스트 또는 RNA를 가수 분해하는 데 사용할 수 있습니다 후 복잡한 추가. 이 분석은 또한 추가적인 항암 후보를 연구하는데 이용 될 수있다.

아가로 오스 젤 전기 영동에 의해 평가 RNA 전사 질적 아가 로스 겔 전기 영동 화상에 전사 된 RNA를 사용한다. 에티 디움 브로마이드 RNA의 46 수 있도록 영상 (λ 안에 605 nm의, λ 전 = 210 nm의, 285 nm의 =) 바인딩에 형광. 젤 어두운 밴드는 RNA의 높은 농도에 해당합니다. 티노 마이신 D는, triptolide, 또는 하나 corrole 복잡한 RNA의 전사를 억제하면, RN...

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An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

갈륨 (III) 5,10,15- (트리스) pentafluorophenylcorrole 및 유리 염기 유사체 마이크로 낮은 세포 독성을 나타낸다. 이 원고는 corroles에 의해 전사 억제를 평가하기 위해, UV-마주 분광와 RNA 전사 반응, 에티 디움 브로마이드 묻은 젤 이미징 RNA 및 정량화 RNA를 설명하고 항암 후보 속성을 평가하는 간단한 방법을 보여줍니다.

<em&gt; 체외</em&gt; 효소 분석은 갈륨 (III) 및 H에 의해 전사 억제를 측정하기 위해<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15 트리스 (펜타 플루오로 페닐) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

11.5K 조회수.  California Institute of Technology.  갈륨 (III) 5,10,15- (트리스) pentafluorophenylcorrole 및 유리 염기 유사체 마이크로 낮은 세포 독성을 나타낸다. 이 원고는 corroles에 의해 전사 억제를 평가하기 위해, UV-마주 분광와 RNA 전사 반응, 에티 디움 브로마이드 묻은 젤 이미징 RNA 및 정량화 RNA를 설명하고 항암 후보 속성을 평가하는 간단한 방법을 보여줍니다. 

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Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural biology 1. In recent years, this method has achieved great success in studying structures of proteins and macromolecular complexes 2, 3. Compared with electron cryomicroscopy (cryoEM), in which frozen hydrated protein samples are embedded in a thin layer of vitreous ice 4, negative staining is a simpler sample preparation method in which protein samples are embedded in a thin layer of dried heavy metal salt to increase specimen contrast 5. The enhanced contrast of negative stain EM allows examination of relatively small biological samples. In addition to determining three-dimensional (3D) structure of purified proteins or protein complexes 6, this method can be used for much broader purposes. For example, negative stain EM can be easily used to visualize purified protein samples, obtaining information such as homogeneity/heterogeneity of the sample, formation of protein complexes or large assemblies, or simply to evaluate the quality of a protein preparation.
In this video article, we present a complete protocol for using an EM to observe negatively stained protein sample, from preparing carbon coated grids for negative stain EM to acquiring images of negatively stained sample in an electron microscope operated at 120kV accelerating voltage. These protocols have been used in our laboratory routinely and can be easily followed by novice users.

Visualizing protein samples by negative stain electron microscopy (EM) has become a popular structural analysis method. It is useful for quantitative structural analysis, such as calculating a 3D reconstruction of the molecules being studied, and also for qualitative examination of the quality of protein preparations. In this article we present detailed protocols for preparing the EM grids, staining the sample and visualizing the sample in an electron microscope. Novice users can follow these protocols easily and to utilize negative stain EM as a routine assay, in addition to other biochemical assays, for evaluating their protein samples.

부정적 얼룩 EM에 의해 단백질과 Macromolecular의 단지를 떠올리 : 그리드 준비에서 이미지 수집

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

연구

생체공학

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

복원 된 인간의 각막 모양의 상피 (RHCE) 조직 모델을 사용하여 눈에 자극성 화학 물질의 위험 식별을위한 눈 자극 시험 (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic physiological tear volumes.7 The traditional model also lacks the natural tear flow component and the blinking reflex, both of which are defining factors of the ocular environment. The development of a novel model is described in this study, which consists of a unique 2-piece design, eyeball and eyelid piece, capable of mimicking physiological tear volume. The models are created from 3-D printed molds (Polytetrafluoroethylene or Teflon molds), which can be used to generate eye models from various polymers, such as polydimethylsiloxane (PDMS) and agar. Further modifications to the eye pieces, such as the integration of an explanted human or animal cornea or human corneal construct, will permit for more complex in vitro ocular studies. A commercial microfluidic syringe pump is integrated with the platform to emulate physiological tear secretion. Air exposure and mechanical wear are achieved using two mechanical actuators, of which one moves the eyelid piece laterally, and the other moves the eyeballeyepiece circularly. The model has been used to evaluate CLs for drug delivery and deposition of tear components on CLs.

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Current in vitro models for evaluating contact lenses (CLs) and other eye-related applications are severely limited. The presented ocular platform simulates physiological tear flow, tear volume, air exposure and mechanical wear. This system is highly versatile and can be applied to various in vitro analyses with CLs.

개발<em&gt; 체외</em&gt; 안구 플랫폼은 콘택트 렌즈를 테스트하는

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

<em&gt; 체외</em쥐의 추간판의&gt; 장기 문화 모델

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

Vivo에서 부분 간 엔지니어링을에서 위한 쥐를 기초로 새로운 수술 기법

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

세포질 기계 화학 Epigenetic 한정자를 리디렉션하여 억압 유전자 전사

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

나노 제형에도 Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) 분석 실험을 사용 하 여

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

다중 스펙트럼 화상 진찰 교류 세포측정을 사용하여 시험관 내 미세핵 분석기를 능력을 발휘하는 자동화된 방법

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current in vitro screening models that have sufficient throughput only have limited physiological relevance, which hinders the translation of findings from in vitro to in vivo. On the other hand, microfluidic cell culture platforms have shown unparalleled physiological relevancy in vitro, but often lack the required throughput, scalability and standardization. We demonstrate a robust platform to study angiogenesis of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC-ECs) in a physiological relevant cellular microenvironment, including perfusion and gradients. The iPSC-ECs are cultured as 40 perfused 3D microvessels against a patterned collagen-1 scaffold. Upon the application of a gradient of angiogenic factors, important hallmarks of angiogenesis can be studied, including the differentiation into tip- and stalk cell and the formation of perfusable lumen. Perfusion with fluorescent tracer dyes enables the study of permeability during and after anastomosis of the angiogenic sprouts. In conclusion, this method shows the feasibility of iPSC-derived ECs in a standardized and scalable 3D angiogenic assay that combines physiological relevant culture conditions in a platform that has the required robustness and scalability to be integrated within the drug screening infrastructure.

This method describes the culture of iPSC-derived endothelial cells as 40 perfused 3D microvessels in a standardized microfluidic platform. This platform enables the study of gradient-driven angiogenic sprouting in 3D, including anastomosis and stabilization of the angiogenic sprouts in a scalable and high-throughput manner.

iPSC 유래 내피 세포의 퍼퓨비드 3D 혈관신생 발아연구를 위한 표준화 및 확장 성 분석

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

장기 나노 물질 노출 다음 체외 물질 독성 테스트를 위한 고급 3D 간 모델

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...