This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).

주의 : 실험 방사성 동위 원소 32 P의 사용을 포함하는 모든 적절한 안전 조건이 충족 될 때까지 어떤 작업이 수행되지 않을 것이다. 일반적으로 사람은 안전 코스에 참석 전에 방사성 시약을 사용하여 실험에 감독 관행을 받게해야합니다. 반응을 수행 할 때 개인 보호 장비를 착용하십시오 (열 발광 선량계, 보호 안경, 장갑, 방사선 실 실험실 코트, 전체 길이 바지, 신발 - 발가락을 휴관). 분석 자료 ​​1. 준비 <ol><li> 전사 분석을위한 단백질 필요를 얻습니다. <ol><li> 여기에 설명 된 실험, 과잉 생산 및 E.을 정화 대장균 RNAP은 실험실에서 상용 소스 (자료 목록)에서 11 설명, 또는 얻을 수있다. 참고 : 모두 비슷한 결과를 제공합니다. 원시 또는 친화 표지 RNAP을 정제하는 다른 방법은 12, 13을 이용할 수있다. 시그마 / 누 인자 D로 얻을 수있다이전 작품 14, 15에 escribed. </li></ol></li><li> 디 에틸 피로 카보네이트의 제조 (DEPC) 처리 된 물 참고 : 또는의 RNA 분해 효소가없는 물을 상업적 출처 (자재 목록)에서 얻을 수있다. <ol><li> 정제 물 1 L에 1 ml의 디 에틸 피로 카보네이트 (DEPC)를 추가 (0.1 % v / v)의 하룻밤 섞는다. </li><li> 두 번 오토 클레이브 DEPC 물과 팁. </li></ol></li><li> DNA 템플릿 준비 <ol><li> 플라스미드 정제 키트 제조업체의 지시에 따라 (자재 목록)을 사용하여 플라스미드 pSG1154 16 및 / 또는 17 pIA226 정제. </li><li> 결선 전사 분석을위한 템플릿을 증폭합니다 (P xyl 프로모터 영역을 포괄하는 360 bp의 단편), 25 ㎕의 2 배 PCR 믹스 (자료 목록)를 포함하여 얼음에 PCR 반응을 조립 2 μL 프라이머의 각 (5 μM) 5&#39;-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 &#39;(정방향) 및 5&#39;-CCCATTAACATCACCATC-3&#39;(리버스), 1 μL pSG1154 플라스미드 PReparation (250 μM) 20 ㎕의 정제수). <ol><li> 또는 대안 적으로, 하나의 원형 전사 분석법, pIA226 (17)로부터 λ의 P R 프로모터 영역을 포괄 447 bp의 단편을 증폭한다. 25 ㎕의 2 배 PCR 믹스 2 ㎕를 프라이머 각각 (5 μM)을 사용하여 얼음에 PCR 반응 설정 : 5&#39;-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 &#39;(정방향) 및 5&#39;-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3&#39;(리버스), 1 μL의 pIA226 17 플라스미드 준비 (250 μM) 20 ㎕의 정제수). 참고 :이 템플릿 전사 시작 사이트에서 26 번째 염기 인 26 NT를 위치까지 시토신 없다. 따라서, 전사 개시, 프로모터 통관을 허용합니다이 템플릿을 사용하여 만 ATP, UTP 및 GTP 반응에있을 때 안정적인 전사 신장 복합체 (EC)을 형성 NT 26에 실속. </li></ol></li><li> 다음과 같은 조건으로 PCR 반응을 설정 : 95 °를30 사이클 반복 30 초, 30 초, 30 초 동안 50 ° C, 72 ° C에 대한 C. </li><li> 제조업체의 지침에 PCR 청소 키트 (자료 목록)에 따라를 사용하여 제품을 정화하고 전사 분석 100 μl의 전사 버퍼에 용출. </li><li> fluorospectrometer (자료 목록)을 사용하여 템플릿 DNA 농도를 결정합니다. </li></ol></li><li> NTP 준비 참고 : NTPS가 다른 상용 소스 (자료 목록)에서 얻을 수 있습니다. <ol><li> -20 ° C에서 1.5 ml의 튜브 (각 관에서 50 μL) 및 저장소에 1 M 주식, 나누어지는 용액 1 ㎖를 만들기 위해 DEPC 처리 된 물 (≥99 % 순수) NTPS을 녹인다. </li><li> 주문 32 P UTP (3000 CI / mmol)을 실험하기 전에. α- 32 P는 14.29 일의 짧은 반감기를 가지고있다. 참고 : 알파 - 표지 된 UTP를 사용하여 길이가 다른 밴드의 강도를 비교 피한다. </li></ol></li><li> RNA 사다리 준비 <ol><li> 후속 조립실온에서 보내고 반응 0.5 μg의 RNA 템플릿 믹스 (자재 목록), 80 mM의 HEPES 완충액 pH7.5, 12 밀리미터의 MgCl 2, 10mM의 염화나트륨, 10 mM의 DTT, 2 mM의 ATP / CTP / GTP, 0.5 mM의 UTP 2 μL 32 P UTP, 0.5 μL T7 RNAP (자료 목록), α- 20 μL에 물을 DEPC를 처리. </li><li> 반응은 1 시간 동안 37 ° C에서 할 수있게합니다. 즉시 사용 또는 -80 ° C에 저장합니다. </li></ol></li></ol> RNA 시퀀싱 젤 2. 준비 <ol><li> 젤 준비 <ol><li> 시퀀싱 겔 장치 배의 70 % 에탄올과 정제수 (자재 목록)에서 접시를 닦고 빗살 두 스페이서 셀을 조립한다. 주 : 하나의 판은 단계 4.2에서 겔의 제거를 용이하게 siliconizing 시약 (자재 목록)으로 코팅 될 수있다. </li><li> 22 ml의 물에 33.6 g 우레아를 용해시키고, 5 배 트리스 / 붕산염 / EDTA (TBE) 완충액 (54g 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 16.4 ㎖; 27.5 g 붕산을 1 M 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 10 ㎖ (자기 교반기를 사용 EDTA), 1 L의 물에서의 pH 7.4). </li><li> (19 : 1) 40 % 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드 용액 16 ml를 추가 우레아 용액 및 0.45 μm의 필터로 필터링. </li><li> 514 ㎕의 10 %를 추가 (W / V) 상기 필터링 된 용액에 51.4 μL의 N, N, N &#39;, N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)이어서 물에 새로 제조 한 황산 암모늄. </li><li> 부드럽게 과도한 폭기를 방지 바닥 주입구로부터 수평 위치 사전 충전 시퀀싱 셀에 바로 원활하게 주입 겔 용액을 반전. 주입하는 동안 거품을 만드는 않도록주의하십시오. </li><li> 젤이 완전히 전사 분석에서 사용하기 전에 설정 될 때까지 1.5 시간을 허용합니다. 시퀀싱 셀의 위에 수분 습윤 티슈 래핑 때 겔 2, 3 일 동안 실온에서 저장 될 수있다. </li></ol></li></ol> 3. 전사 반응 <ol><li> 전사 신장 일시 중지 분석 <ol><li> 전사 신장 착물 형성 <ol><li> 1.5 ML 튜브에 RNAP 핵심 효소 (전사 버퍼에 1 μM 주) 1 μl를 추가합니다. </li><li> RNAP와 RNAP의 완전 효소를 형성하기 위해 10 분 동안 얼음에 품어 (전사 버퍼에 3 μm의 주식을 σ 70) 정제 시그마 - 70 인자의 1 μl를 추가합니다. </li><li> RNAP의 완전 효소에 전사 버퍼에 3 ㎕를 500 nM의 정제 템플릿 DNA합니다 (pIA226 PCR 제품에서 λ P의 R 프로모터)를 추가 오픈 복합체를 형성하기 위해 5 분 동안 37 ºC에서 품어. </li><li> 처리 DEPC 400 mM의 트리스 -HCl, 1.6 M KCl을 100 밀리미터의 MgCl 2, 10 mM의 DTT, 50 % 글리세롤, pH를 7.9 : 10 배 전사 완충액 5 μL (자재 목록을 사용하여 다른 1.5 ㎖의 튜브에 반응 성분의 혼합물을 제조 물), 250 μM 각 GTP 및 UTP, 1 mM의 ATP의 1 μL 2 μL 및 α- 32 P UTP (3000 CI / mmol)을 1 μL. 41 μL에 DEPC 처리 된 물을 추가합니다. 아니TE : RNA 분해 효소 억제제 (자재 목록)을 RNA 분해 효소의 오염을 최소화 할 수있다. </li><li> 개방 착체를 함유하는 튜브에 혼합 용액을 옮기고 전사 신장 복합체 NT +26에서 정지 형성을 15 분 동안 37 ºC 부화. </li><li> 실내 온도 (~ 21 ° C)에 대한 반응을 이동하고 50 μg / ML의 최종 농도 2.5 ㎎ / ㎖ 리팜피신 1 μl를 추가합니다. </li><li> 반응 혼합물에 누사 정제는 0.1mm 1 μl를 첨가하고 실온에서 5 분 동안 배양한다. </li><li> 50 μL의 최종 부피를하고, 타이머를 사용하여, 반응 시간을 측정하기 위해 반응 혼합물에 250 μM C​​TP 2 μL를 추가한다. </li><li> 전송 5~30에서 RNA 겔 로딩 완충액 (95 % 포름 아미드, 0.05 % 브로 모 페놀 블루, 0.05 % 크실렌 cyanol) 2 μL로 반응 액의 μL, 60, 120, 240, 480, 1200 초의 반응을 종결. </li><li> 방사성 폐기물 계속에서 32 P의 UTP 팁 및 튜브를 폐기ainer. </li></ol></li></ol></li><li> 전사 개시 분석 <ol><li> 열기 단지의 형성 <ol><li> 0.5 μM 70 σ 정제 희석. </li><li> 단계를 반복 3.1.1.1 0.5 μM (대신 3 μM의) (70) σ 정제하고, DNA 템플릿 (pSG1154 PCR 제품에서 P xyl의 프로모터 영역)를 사용하여 3.1.1.3에. </li></ol></li><li> 전사 개시 저해 분석 <ol><li> 억제제가 완전 효소의 형성을 방해 할 수 있는지 여부를 검토하는 단계 3.1.1.2 및 3.1.1.3 다음 (단계 3.1.1.1 이후) σ (70) 또한 이전에 RNAP 핵심 효소에 RNAP의 완전 효소의 형성을 방지하기위한 억제제를 추가합니다. </li><li> 또한, 단계 3.1.1.2 후, 경쟁력 RNAP 바인딩 (70) σ 억제 할 수 있는지 여부를 검사 할 억제제를 추가합니다. </li><li> 대신 (S)의 억제제, DMSO, 억제제의 용매의 동일한 양을 사용하여제어 반응에서 째깍. </li></ol></li><li> 반응 완료 <ol><li> -20 ° C에서 1 ㎎ / ㎖ 및 주식의 재고 농도로 물에 헤파린을 녹인다. 참고 : 헤파린 오픈 복합체를 형성하지 않은 RNAP을 격리한다 수있는 DNA의 경쟁이다. 개방 복합체가 형성되면, 헤파린 RNAP의 DNA 결합 부위를 선택하고 예비 형성된 개방 착체로부터 전사를 억제 할 수 없다. 따라서, 헤파린은 단일 라운드 분석이 필요합니다; 그것은 다중 라운드 분석을 위해 필요하지 않습니다. </li><li> 5 μL의 10 배 전사 완충액 (자재 목록), 1 ㎎ / ㎖ 헤파린 용액 1 ㎕를 10 mM의 각각의 ATP, GTP, 및 CTP 2.5 mM의 UTP 1 μL 및 α- (32)의 1 μL를 사용하여 반응 혼합물을 제조 P UTP (3000 CI / mmol)을 첨가 하였다. 45 μL에 DEPC 처리 된 물을 추가합니다. </li><li> 전사 오픈 복소 펄스 스핀과의 반응 혼합물을 혼합하고 20 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 그래서 반응의 10 μl를 전송RNA 겔 로딩 완충액 (95 % 포름 아미드, 0.05 % 브로 모 페놀 블루, 0.05 % 크실렌 cyanol) 5 μL로 lution 반응을 종결. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. RNA 젤 실행 및 개발 <ol><li> 변성 폴리 아크릴 아미드 젤을 실행 <ol><li> 겔의 온도까지 약 1.5 시간 동안 1X TBE 버퍼에서 50 ºC에서 겔 50 W를 실행하고 버퍼는 50 ºC에서 안정적입니다. </li><li> 30 초 90 ºC에서 열 샘플 및 겔에 얼음 전에로드로 이동합니다. </li><li> (100 희석 1) 2 μL의 RNA 사다리를 포함하는 하나의 차선과 함께 겔의 상단에있는 우물에로드 샘플. </li><li> 브로 모 페놀 블루 염료가 젤 아래 ~ 2 / 3에 도달 할 때까지 1X TBE 버퍼에 50 W 50 ºC에서 젤을 실행합니다. </li></ol></li><li> 젤 치료 <ol><li> 열기 천천히 조심스럽게 시퀀싱 세포에서 상판을 분리합니다. 젤을 깨는 방지하기 위해 상당한주의를 기울입니다. </li><li> 컷 chromatograpHY 용지 (자료 목록)은 브로 모 페놀 블루 염료 상단에서 젤 크기와 일치합니다. 방사성 표지 된 RNA 전 사체의 대략적인 위치를 확인하기 위해 가이거 카운터를 사용합니다. </li><li> 겔 필터 종이에 부착까지 조심스럽게 단단히 필터 종이 젤 누릅니다 커버. 잘라와 비법 NTPS이 매우 뜨거울 수 있습니다 겔의 하단에 실행으로 방사성 폐기물에 겔의 바닥을 폐기하십시오. </li><li> 진공 건조기의 건조 침대에 여과지의 비슷한 크기의 조각을 놓고 조심스럽게 겔 쪽이 위로 그것에 겔 코팅 용지를 배치합니다. </li><li> 1.5 시간 동안 60 ° C에서 플라스틱 포장과 건조와 젤을 커버. </li><li> 1 시간마다 다를 수있는 적절한 노출 시간으로, 플라스틱 랩 겔 코팅 된 여과지의 다른 측 랩, 촬상 경우의 photostimulable 형광체 접시에 놓고 밤새 반응 효율에 의존한다. </li><li> 사용하여 형광 이미지 플레이트제조업체의 지시에 따라 이미 저 스캐너. 소프트웨어 설명서에 따라 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 상대 밴드 강도를 결정합니다. </li><li> 작업 영역의 방사능 오염을 검사 조직 및 세정제로 의심되는 항목 및 영역을 닦고 폐기 용기에 조직을 배치하는 가이거 카운터를 사용한다. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

모든 생물에서 전사가 단단히 통제 프로세스이다. 전사 분석법이 전사 인자, 작은 분자의 전사 억제제의 효과를 테스트하기위한 플랫폼을 제공하기 위해 개발 된 시험 관내. 이 방법 논문에서는 일반 세균 전사에 대한 분석은 설명했다. 그들은 타임 라인을 따라 모든 전사 제품의 시각화를 허용하는 성적 증명서의 순서 겔 전기 영동과 결합 전사 분석은 기계적인 연구에 매우 중요하다. 결?...

RNA 전사는 특정 DNA를 주형으로 합성되는 과정이다. 진핵 세포에서 세 가지 RNAPs있다 : RNAP 내가 rRNA의 전구체 사본을 만듭니다가, RNAP II는 mRNA의 특정 작은 핵 RNA를 합성에 대한 책임이며, 5S rRNA의와의 tRNA의 합성은 RNAP III에 의해 수행된다. 박테리아에서, RNA의 모든 클래스의 전사에 대한 책임 하나만 RNAP있다. 개시, 신장 및 종료 : 전사의 세 단계가 있습니다. 전사는 셀의 가장 높은 조정 프로세스이다. 전사주기의 각 단계는 하나의 유전자 발현의 조절에 대한 검사를 나타낸다. 개시 내용 RNAP 오픈 프로모터 복합체를 형성 촉진제 2라고 특정 사이트에 효소를 유도 할 필요가있는 완전 효소 형성 시그마 인자와 연관이있다. 그 후, 전사 인자의 넓은 스위트 룸은 규제 오에 대한 책임이 있습니다신장 및 종료 단계에서 F RNAP 활동. 여기서 조사 전사 인자는 누사 고도로 보존 필수적인 단백질이다. 이것은 rRNA의 합성 3-5 중에 전사 일시 정지 및 종료뿐만 아니라 항 - 종단 조절에 관여한다. 시험 관내에서 전사 분석은 전사 6시 복잡한 규제 단계를 연구하는 강력한 도구로 개발되었다. 일반적으로, 프로모터 영역을 포함하는 DNA의 단편은 선형 전사 주형으로 요구된다. DNA를 템플릿은 일반적으로 PCR에 의해 또는 플라스미드를 선형화에 의해 생성된다. 정제 된 단백질 (검출을 위해 하나의 방사성 NTP 포함) NTPS을 첨가하고 생성물을 배양 필요한 기간 후의 분석된다. 적절한 템플릿과 반응 조건을 사용하여, 전사의 모든 단계는 transcr의 상세한 분자 특성을 활성화 한이 접근법을 사용하여 검사 된지난 반세기 이상 7 iption. RNAP의 3 차원 구조에 대한 정보와 함께 또한 항생제 항생제 리드에 의해 전사 억제의 분자 메커니즘을 조사하고, 새롭게 개선 된 약제 8-10의 개발에이 정보를 사용할 수있다. 본 연구에서 우리는 전사 분석법 전사 신장 / 종료 인자 누사 방법 및 신규 한 전사 개시 저해 리드의 작용 메카니즘이 결정될 수에 의해 규제기구를 결정하는 데 사용될 수있는 방법의 예를 제공한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Obtain the proteins required for transcription assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli RNAP</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>S90250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparation of DEPC-treated water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethyl pyrocarbonate (DEPC)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>D5758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambion Nuclease-Free Water</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA template preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard&#160;Plus&#160;SV Minipreps DNA Purification System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACCUZYME Mix</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-25028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 3300 fluorospectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A6559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>U1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>G3776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>C9274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Purity rNTPs</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27-2025-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-32P UTP&#160;</td>
			<td>PerkinElmer&#160;&#160;</td>
			<td>BLU007C001MC</td>
			<td>Radioactive compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA ladder preparation&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1&#8211;1 kb</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>69003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>H7006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>DTT-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNAP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;&#160;</td>
			<td>165-3804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigmacote&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>SL2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>urea&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>U6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tris(hydroxymethyl)aminomethane&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>154563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boric acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>B7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>ED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide/bis-acrylamide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium persulfate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#697;&#8242;,N&#697;&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N",N"-Tetramethylethylenediamine (TEMED) </td>
			<td>Sigma-Aldrich </td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rifampicin&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>R3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F9037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene cyanol&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>X4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heparin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>84020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin Ribonuclease Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transcription buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>M2393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>DTT-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman&#160;3MM Chr Chromatography Paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-714-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioactive decontaminant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decon 90</td>
			<td>decon</td>
			<td>decon90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon Trio+ imager</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>63-0055-89</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro transcription assays and their application in drug discovery

시험 관내 전사 분석법이 개발되어 널리 전사에 관여하는 분자 메커니즘을 연구하기 위해 수년 동안 사용된다. 이 프로세스는 다중 서브 유니트 DNA 의존성 RNA 폴리머 라제 (RNAP) 유전자 발현시 RNAP의 활성을 조절하는 작용을하는 전사 인자의 연속을 필요로한다. 방사성 표지 성적 시퀀싱 겔 전기 영동이란 파라미터를 미치는 영향 전사 진행하여 기계적 상세한 정보를 제공하기 위해 사용된다. 본 논문에서는 필수 연장 인자는 전사 누사 일시뿐만 아니라 RNAP 완전 효소 형성의 억제를 통해 전사 개시 타겟팅 항균제를 식별하는 방법을 조절하는 방법을 연구하는 프로토콜을 기술한다. 이 방법은 아직 불분명 남아있는 전사 인자의 작용 메커니즘뿐만 아니라 새로운 항균 카발라을 탐구하는 추가 방법의 개발을위한 플랫폼으로 사용할 수 있습니다TS는 항생제 연구 개발의 활용도가 낮은 약물 표적 인 전사를 대상으로.

전사 효율이 서로 다른 시점에서 주파수 대역에 방사선의 수준을 측정함으로써 결정될 수있다. 일시 중지 분석은 일시 정지, 종료의 시각화를 사용 누사 인자의 기능을 테스트하고 실행 - 오프 제품 (그림 1A)를합니다. (누사 NTD; 아미노산 잔기 1-137) 누사의 N- 말단 도메인의 존재에있어서, RNA 제품의 외관이 크게 누사 부족한 대조 실험에 비해 늦어졌다. 아미노...

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In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

시험 관내 전사 분석 실험 및 약물 발견에의 응용

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

15.1K 조회수.  University of Newcastle. In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

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siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend diseases related to pregnancy. In this protocol, human primary villous cytotrophoblasts freshly isolated from placentas through a standard DNase/trypsin protocol are microporated with small interfering RNA (siRNA). This approach provided greater efficiency for siRNA transfection when compared to a lipofection-based method. Transfected cells can subsequently be analyzed by standard Western blot within a time frame of 3-4 days post-transfection. In addition, using cultured primary villous cytotrophoblasts, Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) analysis was optimized and performed on extracts from days 1 to 4. The use of these cultured primary cells and the protocol described allow for an evaluation of the implication of specific genes and transcription factors in the process of villous cytotrophoblast differentiation into a syncytiotrophoblast-like cell layer. However, the limited time span allowable in culture precludes the use of methods requiring more time, such as generation of a stable cell population. Therefore testing of this cell population requires highly optimized gene transfer protocols.

This protocol describes a method for efficiently transfecting siRNA in freshly isolated human villous cytotrophoblasts using microporation and identifying DNA-protein complexes in these cells. Transfected cells can be monitored by Western blot and EMSA analyses during the 4-day culture time.

갓 고립 된 인간의 산모 Cytotrophoblasts에 siRNA를 형질 및 EMSA 분석

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

연구

유전학

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Genetically-encoded histone-miniSOG induces genome-wide heritable mutations in a blue&#160;light-dependent manner. This mutagenesis method is simple, fast, free of toxic chemicals, and well-suited for forward genetic screening and transgene integration.

히스톤 - miniSOG에서 사용 Optogenetic 무작위 돌연변이 유발<em&gt; C. 엘레</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to sleep behavior. In vertebrates, circadian rhythm is controlled by a molecular oscillator that functions in both the suprachiasmatic nucleus (SCN; central pacemaker) and individual cells comprising most peripheral tissues. More importantly, disruption of circadian rhythm by exposure to light-at-night, environmental stressors and/or toxicants is associated with increased risk of chronic diseases and aging. The ability to identify agents that can disrupt central and/or peripheral biological clocks, and agents that can prevent or mitigate the effects of circadian disruption, has significant implications for prevention of chronic diseases. Although rodent models can be used to identify exposures and agents that induce or prevent/mitigate circadian disruption, these experiments require large numbers of animals. In vivo studies also require significant resources and infrastructure, and require researchers to work all night. Thus, there is an urgent need for a cell-type appropriate in vitro system to screen for environmental circadian disruptors and enhancers in cell types from different organs and disease states. We constructed a vector that drives transcription of the destabilized luciferase in eukaryotic cells under the control of the human PERIOD 2 gene promoter. This circadian reporter construct was stably transfected into human mammary epithelial cells, and circadian responsive reporter cells were selected to develop the in vitro bioluminescence assay. Here, we present a detailed protocol to establish and validate the assay. We further provide details for proof of concept experiments demonstrating the ability of our in vitro assay to recapitulate the in vivo effects of various chemicals on the cellular biological clock. The results indicate that the assay can be adapted to a variety of cell types to screen for both environmental disruptors and chemopreventive enhancers of circadian clocks.

In Vitro Bioluminescence Assay to Characterize Circadian Rhythm in Mammary Epithelial Cells

An in vitro bioluminescence assay to determine cellular circadian rhythm in mammary epithelial cells is presented. This method utilizes mammalian cell reporter plasmids expressing destabilized luciferase under the control of the PERIOD 2 gene promoter. It can be adapted to other cell types to evaluate organ-specific effects on circadian rhythm.

생체 외에서 유 방 상피 세포에서 Circadian 리듬 특성 분석 결과 생물 발광

The circadian rhythm is a fundamental physiological process present in all organisms that regulates biological processes ranging from gene expression to ...

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in humans, but more tools and research efforts are needed to better elucidate the mechanisms involved. For over a century, the genetically highly tractable model of Drosophila has been instrumental in the discovery of key genes and molecular pathways that proved to be highly conserved across species. Many biological processes and disease mechanisms are functionally conserved in the fly, such as development (e.g., body plan, heart), cancer, and neurodegenerative disease. Recently, the study of obesity and secondary pathologies, such as heart disease in model organisms, has played a highly critical role in the identification of key regulators involved in metabolic syndrome in humans.
Here, we propose to use this model organism as an efficient tool to induce obesity, i.e., excessive fat accumulation, and develop an efficient protocol to monitor fat content in the form of TAGs accumulation. In addition to the highly conserved, but less complex genome, the fly also has a short lifespan for rapid experimentation, combined with cost-effectiveness. This paper provides a detailed protocol for High Fat Diet (HFD) feeding in Drosophila to induce obesity and a high throughput triacylglyceride (TAG) assay for measuring the associated increase in fat content, with the aim to be highly reproducible and efficient for large-scale genetic or chemical screening. These protocols offer new opportunities to efficiently investigate regulatory mechanisms involved in obesity, as well as provide a standardized platform for drug discovery research for rapid testing of the effect of drug candidates on the development or prevention of obesity, diabetes and related metabolic diseases.

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

This is a high fat diet feeding protocol to induce obesity in Drosophila, a model for understanding fundamental molecular mechanisms implicated in lipotoxicity. It also provides a high throughput triacylglyceride assay for measuring fat accumulation in Drosophila and potentially other (insect) models under various dietary, environmental, genetic or physiological conditions.

높은 지방 다이어트 먹이 초파리 Melanogaster 의 높은 처리량 Triacylglyceride 분석 결과

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that control the fidelity of transcription. To fill this gap in scientific knowledge, we recently optimized the circle-sequencing assay to detect transcription errors throughout the transcriptome of Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster, and Caenorhabditis elegans. This protocol will provide researchers with a powerful new tool to map the landscape of transcription errors in eukaryotic cells so that the mechanisms that control the fidelity of transcription can be elucidated in unprecedented detail.

This protocol provides researchers with a new tool to monitor the fidelity of transcription in multiple model organisms.

진 핵 생물의 전사 오류의 게놈 넓은 감시

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a larger genomic context. Subtractive genomics enables a researcher to isolate a target sequence of interest (T) by comprehensive sequencing and subtracting out known genetic elements (reference, R). The method can be used to identify novel sequences such as mitochondria, chloroplasts, viruses, or germline restricted chromosomes, and is particularly useful when T cannot be easily isolated from R. Beginning with the comprehensive genomic data (R + T), the method uses Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) against a reference sequence, or sequences, to remove the matching known sequences (R), leaving behind the target (T). For subtraction to work best, R should be a relatively complete draft that is missing T. Since sequences remaining after subtraction are tested through quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR), R does not need to be complete for the method to work. Here we link computational steps with experimental steps into a cycle that can be iterated as needed, sequentially removing multiple reference sequences and refining the search for T. The advantage of subtractive genomics is that a completely novel target sequence can be identified even in cases in which physical purification is difficult, impossible, or expensive. A drawback of the method is finding a suitable reference for subtraction and obtaining T-positive and negative samples for qPCR testing. We describe our implementation of the method in the identification of the first gene from the germline-restricted chromosome of zebra finch. In that case computational filtering involved three references (R), sequentially removed over three cycles: an incomplete genomic assembly, raw genomic data, and transcriptomic data.

The purpose of this protocol is to use a combination of computational and bench research to find novel sequences that cannot be easily separated from a co-purifying sequence, which may be only partially known.

빼기 게놈에 의해 소설 시퀀스 검색

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

효 모 신경 Proteinopathy 모델에서 특성화 히스톤 포스트 번역 상 수정 변경

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant viruses they vector. Despite numerous studies of the biology of these species in different environments, a key life history parameter, offspring sex ratios, has received little attention, yet is important for predicting population dynamics. The primary sex ratio (sex ratio at oviposition) of Bemisia tabaci has never been reported but can be found by determining the egg fertilization rate of this haplodiploid insect. The technique involves the dechorionation of eggs with bleach, a series of fixation steps, and the application of the general DNA fluorescent stain, DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole, a DNA-binding fluorescent dye), to bind to female and male pronuclei. Here, we present the technique, and an example of its application, to test whether an endosymbiotic bacterium, Rickettsia sp. nr. bellii, influenced the primary sex ratio of B. tabaci. This method may assist in population studies of whiteflies, or in determining if sex allocation exists with certain environmental stimuli.

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

We present a simple cytogenetic technique using 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) to determine the fertilization rate and primary sex ratio of the haplodiploid invasive pest Bemisia tabaci.

Bemisia tabaci Cytogenetic 기술을 사용 하 여 계란 수정 속도 결정

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental methods to study protein-nucleic acid interactions require the use of fluorescent tags, radioactive isotopes, or other labels to detect and analyze specific target molecules. Biotin, a non-radioactive nucleic acid label, is commonly used in electrophoretic mobility shift assays (EMSA) but has not been regularly employed to monitor protein activity during nucleic acid processes. This protocol illustrates the utility of biotin labeling during in vitro enzymatic reactions, demonstrating that this label works well with a range of different biochemical assays. Specifically, in alignment with previous findings using radioisotope 32P-labeled substrates, it is confirmed via biotin-labeled EMSA that MEIOB (a protein specifically involved in the meiotic recombination) is a DNA-binding protein, that MOV10 (an RNA helicase) resolves biotin-labeled RNA duplex structures, and that MEIOB cleaves biotin-labeled single-stranded DNA. This study demonstrates that biotin is capable of substituting 32P in various nucleic acid-related biochemical assays in vitro.&#160;

Presented here are protocols for in vitro biochemical assays using biotin labels that may be widely&#160;applicable for studying protein-nucleic acid interactions.

비오틴 라벨을 사용하여 단백질-핵산 상호 작용을 연구하는 생체외 생화학 적 분석을 통해

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

시험 관내 전사 분석 실험 및 약물 발견에의 응용

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