Name: in vitro transcription assays and their application in drug discovery
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
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This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).

주의 : 실험 방사성 동위 원소 32 P의 사용을 포함하는 모든 적절한 안전 조건이 충족 될 때까지 어떤 작업이 수행되지 않을 것이다. 일반적으로 사람은 안전 코스에 참석 전에 방사성 시약을 사용하여 실험에 감독 관행을 받게해야합니다. 반응을 수행 할 때 개인 보호 장비를 착용하십시오 (열 발광 선량계, 보호 안경, 장갑, 방사선 실 실험실 코트, 전체 길이 바지, 신발 - 발가락을 휴관). 분석 자료 ​​1. 준비 <ol><li> 전사 분석을위한 단백질 필요를 얻습니다. <ol><li> 여기에 설명 된 실험, 과잉 생산 및 E.을 정화 대장균 RNAP은 실험실에서 상용 소스 (자료 목록)에서 11 설명, 또는 얻을 수있다. 참고 : 모두 비슷한 결과를 제공합니다. 원시 또는 친화 표지 RNAP을 정제하는 다른 방법은 12, 13을 이용할 수있다. 시그마 / 누 인자 D로 얻을 수있다이전 작품 14, 15에 escribed. </li></ol></li><li> 디 에틸 피로 카보네이트의 제조 (DEPC) 처리 된 물 참고 : 또는의 RNA 분해 효소가없는 물을 상업적 출처 (자재 목록)에서 얻을 수있다. <ol><li> 정제 물 1 L에 1 ml의 디 에틸 피로 카보네이트 (DEPC)를 추가 (0.1 % v / v)의 하룻밤 섞는다. </li><li> 두 번 오토 클레이브 DEPC 물과 팁. </li></ol></li><li> DNA 템플릿 준비 <ol><li> 플라스미드 정제 키트 제조업체의 지시에 따라 (자재 목록)을 사용하여 플라스미드 pSG1154 16 및 / 또는 17 pIA226 정제. </li><li> 결선 전사 분석을위한 템플릿을 증폭합니다 (P xyl 프로모터 영역을 포괄하는 360 bp의 단편), 25 ㎕의 2 배 PCR 믹스 (자료 목록)를 포함하여 얼음에 PCR 반응을 조립 2 μL 프라이머의 각 (5 μM) 5&#39;-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 &#39;(정방향) 및 5&#39;-CCCATTAACATCACCATC-3&#39;(리버스), 1 μL pSG1154 플라스미드 PReparation (250 μM) 20 ㎕의 정제수). <ol><li> 또는 대안 적으로, 하나의 원형 전사 분석법, pIA226 (17)로부터 λ의 P R 프로모터 영역을 포괄 447 bp의 단편을 증폭한다. 25 ㎕의 2 배 PCR 믹스 2 ㎕를 프라이머 각각 (5 μM)을 사용하여 얼음에 PCR 반응 설정 : 5&#39;-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 &#39;(정방향) 및 5&#39;-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3&#39;(리버스), 1 μL의 pIA226 17 플라스미드 준비 (250 μM) 20 ㎕의 정제수). 참고 :이 템플릿 전사 시작 사이트에서 26 번째 염기 인 26 NT를 위치까지 시토신 없다. 따라서, 전사 개시, 프로모터 통관을 허용합니다이 템플릿을 사용하여 만 ATP, UTP 및 GTP 반응에있을 때 안정적인 전사 신장 복합체 (EC)을 형성 NT 26에 실속. </li></ol></li><li> 다음과 같은 조건으로 PCR 반응을 설정 : 95 °를30 사이클 반복 30 초, 30 초, 30 초 동안 50 ° C, 72 ° C에 대한 C. </li><li> 제조업체의 지침에 PCR 청소 키트 (자료 목록)에 따라를 사용하여 제품을 정화하고 전사 분석 100 μl의 전사 버퍼에 용출. </li><li> fluorospectrometer (자료 목록)을 사용하여 템플릿 DNA 농도를 결정합니다. </li></ol></li><li> NTP 준비 참고 : NTPS가 다른 상용 소스 (자료 목록)에서 얻을 수 있습니다. <ol><li> -20 ° C에서 1.5 ml의 튜브 (각 관에서 50 μL) 및 저장소에 1 M 주식, 나누어지는 용액 1 ㎖를 만들기 위해 DEPC 처리 된 물 (≥99 % 순수) NTPS을 녹인다. </li><li> 주문 32 P UTP (3000 CI / mmol)을 실험하기 전에. α- 32 P는 14.29 일의 짧은 반감기를 가지고있다. 참고 : 알파 - 표지 된 UTP를 사용하여 길이가 다른 밴드의 강도를 비교 피한다. </li></ol></li><li> RNA 사다리 준비 <ol><li> 후속 조립실온에서 보내고 반응 0.5 μg의 RNA 템플릿 믹스 (자재 목록), 80 mM의 HEPES 완충액 pH7.5, 12 밀리미터의 MgCl 2, 10mM의 염화나트륨, 10 mM의 DTT, 2 mM의 ATP / CTP / GTP, 0.5 mM의 UTP 2 μL 32 P UTP, 0.5 μL T7 RNAP (자료 목록), α- 20 μL에 물을 DEPC를 처리. </li><li> 반응은 1 시간 동안 37 ° C에서 할 수있게합니다. 즉시 사용 또는 -80 ° C에 저장합니다. </li></ol></li></ol> RNA 시퀀싱 젤 2. 준비 <ol><li> 젤 준비 <ol><li> 시퀀싱 겔 장치 배의 70 % 에탄올과 정제수 (자재 목록)에서 접시를 닦고 빗살 두 스페이서 셀을 조립한다. 주 : 하나의 판은 단계 4.2에서 겔의 제거를 용이하게 siliconizing 시약 (자재 목록)으로 코팅 될 수있다. </li><li> 22 ml의 물에 33.6 g 우레아를 용해시키고, 5 배 트리스 / 붕산염 / EDTA (TBE) 완충액 (54g 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 16.4 ㎖; 27.5 g 붕산을 1 M 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 10 ㎖ (자기 교반기를 사용 EDTA), 1 L의 물에서의 pH 7.4). </li><li> (19 : 1) 40 % 아크릴 아미드 / 비스 아크릴 아미드 용액 16 ml를 추가 우레아 용액 및 0.45 μm의 필터로 필터링. </li><li> 514 ㎕의 10 %를 추가 (W / V) 상기 필터링 된 용액에 51.4 μL의 N, N, N &#39;, N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)이어서 물에 새로 제조 한 황산 암모늄. </li><li> 부드럽게 과도한 폭기를 방지 바닥 주입구로부터 수평 위치 사전 충전 시퀀싱 셀에 바로 원활하게 주입 겔 용액을 반전. 주입하는 동안 거품을 만드는 않도록주의하십시오. </li><li> 젤이 완전히 전사 분석에서 사용하기 전에 설정 될 때까지 1.5 시간을 허용합니다. 시퀀싱 셀의 위에 수분 습윤 티슈 래핑 때 겔 2, 3 일 동안 실온에서 저장 될 수있다. </li></ol></li></ol> 3. 전사 반응 <ol><li> 전사 신장 일시 중지 분석 <ol><li> 전사 신장 착물 형성 <ol><li> 1.5 ML 튜브에 RNAP 핵심 효소 (전사 버퍼에 1 μM 주) 1 μl를 추가합니다. </li><li> RNAP와 RNAP의 완전 효소를 형성하기 위해 10 분 동안 얼음에 품어 (전사 버퍼에 3 μm의 주식을 σ 70) 정제 시그마 - 70 인자의 1 μl를 추가합니다. </li><li> RNAP의 완전 효소에 전사 버퍼에 3 ㎕를 500 nM의 정제 템플릿 DNA합니다 (pIA226 PCR 제품에서 λ P의 R 프로모터)를 추가 오픈 복합체를 형성하기 위해 5 분 동안 37 ºC에서 품어. </li><li> 처리 DEPC 400 mM의 트리스 -HCl, 1.6 M KCl을 100 밀리미터의 MgCl 2, 10 mM의 DTT, 50 % 글리세롤, pH를 7.9 : 10 배 전사 완충액 5 μL (자재 목록을 사용하여 다른 1.5 ㎖의 튜브에 반응 성분의 혼합물을 제조 물), 250 μM 각 GTP 및 UTP, 1 mM의 ATP의 1 μL 2 μL 및 α- 32 P UTP (3000 CI / mmol)을 1 μL. 41 μL에 DEPC 처리 된 물을 추가합니다. 아니TE : RNA 분해 효소 억제제 (자재 목록)을 RNA 분해 효소의 오염을 최소화 할 수있다. </li><li> 개방 착체를 함유하는 튜브에 혼합 용액을 옮기고 전사 신장 복합체 NT +26에서 정지 형성을 15 분 동안 37 ºC 부화. </li><li> 실내 온도 (~ 21 ° C)에 대한 반응을 이동하고 50 μg / ML의 최종 농도 2.5 ㎎ / ㎖ 리팜피신 1 μl를 추가합니다. </li><li> 반응 혼합물에 누사 정제는 0.1mm 1 μl를 첨가하고 실온에서 5 분 동안 배양한다. </li><li> 50 μL의 최종 부피를하고, 타이머를 사용하여, 반응 시간을 측정하기 위해 반응 혼합물에 250 μM C​​TP 2 μL를 추가한다. </li><li> 전송 5~30에서 RNA 겔 로딩 완충액 (95 % 포름 아미드, 0.05 % 브로 모 페놀 블루, 0.05 % 크실렌 cyanol) 2 μL로 반응 액의 μL, 60, 120, 240, 480, 1200 초의 반응을 종결. </li><li> 방사성 폐기물 계속에서 32 P의 UTP 팁 및 튜브를 폐기ainer. </li></ol></li></ol></li><li> 전사 개시 분석 <ol><li> 열기 단지의 형성 <ol><li> 0.5 μM 70 σ 정제 희석. </li><li> 단계를 반복 3.1.1.1 0.5 μM (대신 3 μM의) (70) σ 정제하고, DNA 템플릿 (pSG1154 PCR 제품에서 P xyl의 프로모터 영역)를 사용하여 3.1.1.3에. </li></ol></li><li> 전사 개시 저해 분석 <ol><li> 억제제가 완전 효소의 형성을 방해 할 수 있는지 여부를 검토하는 단계 3.1.1.2 및 3.1.1.3 다음 (단계 3.1.1.1 이후) σ (70) 또한 이전에 RNAP 핵심 효소에 RNAP의 완전 효소의 형성을 방지하기위한 억제제를 추가합니다. </li><li> 또한, 단계 3.1.1.2 후, 경쟁력 RNAP 바인딩 (70) σ 억제 할 수 있는지 여부를 검사 할 억제제를 추가합니다. </li><li> 대신 (S)의 억제제, DMSO, 억제제의 용매의 동일한 양을 사용하여제어 반응에서 째깍. </li></ol></li><li> 반응 완료 <ol><li> -20 ° C에서 1 ㎎ / ㎖ 및 주식의 재고 농도로 물에 헤파린을 녹인다. 참고 : 헤파린 오픈 복합체를 형성하지 않은 RNAP을 격리한다 수있는 DNA의 경쟁이다. 개방 복합체가 형성되면, 헤파린 RNAP의 DNA 결합 부위를 선택하고 예비 형성된 개방 착체로부터 전사를 억제 할 수 없다. 따라서, 헤파린은 단일 라운드 분석이 필요합니다; 그것은 다중 라운드 분석을 위해 필요하지 않습니다. </li><li> 5 μL의 10 배 전사 완충액 (자재 목록), 1 ㎎ / ㎖ 헤파린 용액 1 ㎕를 10 mM의 각각의 ATP, GTP, 및 CTP 2.5 mM의 UTP 1 μL 및 α- (32)의 1 μL를 사용하여 반응 혼합물을 제조 P UTP (3000 CI / mmol)을 첨가 하였다. 45 μL에 DEPC 처리 된 물을 추가합니다. </li><li> 전사 오픈 복소 펄스 스핀과의 반응 혼합물을 혼합하고 20 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 그래서 반응의 10 μl를 전송RNA 겔 로딩 완충액 (95 % 포름 아미드, 0.05 % 브로 모 페놀 블루, 0.05 % 크실렌 cyanol) 5 μL로 lution 반응을 종결. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. RNA 젤 실행 및 개발 <ol><li> 변성 폴리 아크릴 아미드 젤을 실행 <ol><li> 겔의 온도까지 약 1.5 시간 동안 1X TBE 버퍼에서 50 ºC에서 겔 50 W를 실행하고 버퍼는 50 ºC에서 안정적입니다. </li><li> 30 초 90 ºC에서 열 샘플 및 겔에 얼음 전에로드로 이동합니다. </li><li> (100 희석 1) 2 μL의 RNA 사다리를 포함하는 하나의 차선과 함께 겔의 상단에있는 우물에로드 샘플. </li><li> 브로 모 페놀 블루 염료가 젤 아래 ~ 2 / 3에 도달 할 때까지 1X TBE 버퍼에 50 W 50 ºC에서 젤을 실행합니다. </li></ol></li><li> 젤 치료 <ol><li> 열기 천천히 조심스럽게 시퀀싱 세포에서 상판을 분리합니다. 젤을 깨는 방지하기 위해 상당한주의를 기울입니다. </li><li> 컷 chromatograpHY 용지 (자료 목록)은 브로 모 페놀 블루 염료 상단에서 젤 크기와 일치합니다. 방사성 표지 된 RNA 전 사체의 대략적인 위치를 확인하기 위해 가이거 카운터를 사용합니다. </li><li> 겔 필터 종이에 부착까지 조심스럽게 단단히 필터 종이 젤 누릅니다 커버. 잘라와 비법 NTPS이 매우 뜨거울 수 있습니다 겔의 하단에 실행으로 방사성 폐기물에 겔의 바닥을 폐기하십시오. </li><li> 진공 건조기의 건조 침대에 여과지의 비슷한 크기의 조각을 놓고 조심스럽게 겔 쪽이 위로 그것에 겔 코팅 용지를 배치합니다. </li><li> 1.5 시간 동안 60 ° C에서 플라스틱 포장과 건조와 젤을 커버. </li><li> 1 시간마다 다를 수있는 적절한 노출 시간으로, 플라스틱 랩 겔 코팅 된 여과지의 다른 측 랩, 촬상 경우의 photostimulable 형광체 접시에 놓고 밤새 반응 효율에 의존한다. </li><li> 사용하여 형광 이미지 플레이트제조업체의 지시에 따라 이미 저 스캐너. 소프트웨어 설명서에 따라 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 상대 밴드 강도를 결정합니다. </li><li> 작업 영역의 방사능 오염을 검사 조직 및 세정제로 의심되는 항목 및 영역을 닦고 폐기 용기에 조직을 배치하는 가이거 카운터를 사용한다. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

모든 생물에서 전사가 단단히 통제 프로세스이다. 전사 분석법이 전사 인자, 작은 분자의 전사 억제제의 효과를 테스트하기위한 플랫폼을 제공하기 위해 개발 된 시험 관내. 이 방법 논문에서는 일반 세균 전사에 대한 분석은 설명했다. 그들은 타임 라인을 따라 모든 전사 제품의 시각화를 허용하는 성적 증명서의 순서 겔 전기 영동과 결합 전사 분석은 기계적인 연구에 매우 중요하다. 결?...

RNA 전사는 특정 DNA를 주형으로 합성되는 과정이다. 진핵 세포에서 세 가지 RNAPs있다 : RNAP 내가 rRNA의 전구체 사본을 만듭니다가, RNAP II는 mRNA의 특정 작은 핵 RNA를 합성에 대한 책임이며, 5S rRNA의와의 tRNA의 합성은 RNAP III에 의해 수행된다. 박테리아에서, RNA의 모든 클래스의 전사에 대한 책임 하나만 RNAP있다. 개시, 신장 및 종료 : 전사의 세 단계가 있습니다. 전사는 셀의 가장 높은 조정 프로세스이다. 전사주기의 각 단계는 하나의 유전자 발현의 조절에 대한 검사를 나타낸다. 개시 내용 RNAP 오픈 프로모터 복합체를 형성 촉진제 2라고 특정 사이트에 효소를 유도 할 필요가있는 완전 효소 형성 시그마 인자와 연관이있다. 그 후, 전사 인자의 넓은 스위트 룸은 규제 오에 대한 책임이 있습니다신장 및 종료 단계에서 F RNAP 활동. 여기서 조사 전사 인자는 누사 고도로 보존 필수적인 단백질이다. 이것은 rRNA의 합성 3-5 중에 전사 일시 정지 및 종료뿐만 아니라 항 - 종단 조절에 관여한다. 시험 관내에서 전사 분석은 전사 6시 복잡한 규제 단계를 연구하는 강력한 도구로 개발되었다. 일반적으로, 프로모터 영역을 포함하는 DNA의 단편은 선형 전사 주형으로 요구된다. DNA를 템플릿은 일반적으로 PCR에 의해 또는 플라스미드를 선형화에 의해 생성된다. 정제 된 단백질 (검출을 위해 하나의 방사성 NTP 포함) NTPS을 첨가하고 생성물을 배양 필요한 기간 후의 분석된다. 적절한 템플릿과 반응 조건을 사용하여, 전사의 모든 단계는 transcr의 상세한 분자 특성을 활성화 한이 접근법을 사용하여 검사 된지난 반세기 이상 7 iption. RNAP의 3 차원 구조에 대한 정보와 함께 또한 항생제 항생제 리드에 의해 전사 억제의 분자 메커니즘을 조사하고, 새롭게 개선 된 약제 8-10의 개발에이 정보를 사용할 수있다. 본 연구에서 우리는 전사 분석법 전사 신장 / 종료 인자 누사 방법 및 신규 한 전사 개시 저해 리드의 작용 메카니즘이 결정될 수에 의해 규제기구를 결정하는 데 사용될 수있는 방법의 예를 제공한다.

<table><tbody><tr><td>Obtain the proteins required for transcription assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; RNAP</td><td>Epicentre</td><td>S90250</td><td></td></tr><tr><td>Preparation of DEPC-treated water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>diethyl pyrocarbonate (DEPC)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free water&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambion Nuclease-Free Water</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>DNA template preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard&amp;nbsp;Plus&amp;nbsp;SV Minipreps DNA Purification System</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td></td></tr><tr><td>ACCUZYME Mix</td><td>Bioline</td><td>BIO-25028</td><td></td></tr><tr><td>PCR primers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300 fluorospectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-3300</td><td></td></tr><tr><td>NTP Preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>U1006</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G3776</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>C9274</td><td></td></tr><tr><td>High Purity rNTPs</td><td>GE Healthcare</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P UTP&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BLU007C001MC</td><td>Radioactive compound</td></tr><tr><td>RNA ladder preparation&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1&amp;ndash;1 kb</td><td>Millipore</td><td>69003</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNAP</td><td>Promega</td><td>P2075</td><td></td></tr><tr><td>Gel preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>165-3804</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>urea&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>tris(hydroxymethyl)aminomethane&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>154563</td><td></td></tr><tr><td>boric acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>ethylenediaminetetraacetic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrylamide/bis-acrylamide&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A9926</td><td></td></tr><tr><td>ammonium persulfate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N,N&#039;,N&#039;&lt;/em&gt;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich </td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Transcription Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>glycerol&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>rifampicin&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>formamide&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>xylene cyanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>heparin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>84020</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Ribonuclease Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>Transcription buffer&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>DTT&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>glycerol&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman&amp;nbsp;3MM Chr Chromatography Paper</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-714-5</td><td></td></tr><tr><td>Radioactive decontaminant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Decon 90</td><td>decon</td><td>decon90</td><td></td></tr><tr><td>Gel Treatment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typhoon Trio+ imager</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>63-0055-89</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro transcription assays and their application in drug discovery

시험 관내 전사 분석법이 개발되어 널리 전사에 관여하는 분자 메커니즘을 연구하기 위해 수년 동안 사용된다. 이 프로세스는 다중 서브 유니트 DNA 의존성 RNA 폴리머 라제 (RNAP) 유전자 발현시 RNAP의 활성을 조절하는 작용을하는 전사 인자의 연속을 필요로한다. 방사성 표지 성적 시퀀싱 겔 전기 영동이란 파라미터를 미치는 영향 전사 진행하여 기계적 상세한 정보를 제공하기 위해 사용된다. 본 논문에서는 필수 연장 인자는 전사 누사 일시뿐만 아니라 RNAP 완전 효소 형성의 억제를 통해 전사 개시 타겟팅 항균제를 식별하는 방법을 조절하는 방법을 연구하는 프로토콜을 기술한다. 이 방법은 아직 불분명 남아있는 전사 인자의 작용 메커니즘뿐만 아니라 새로운 항균 카발라을 탐구하는 추가 방법의 개발을위한 플랫폼으로 사용할 수 있습니다TS는 항생제 연구 개발의 활용도가 낮은 약물 표적 인 전사를 대상으로.

전사 효율이 서로 다른 시점에서 주파수 대역에 방사선의 수준을 측정함으로써 결정될 수있다. 일시 중지 분석은 일시 정지, 종료의 시각화를 사용 누사 인자의 기능을 테스트하고 실행 - 오프 제품 (그림 1A)를합니다. (누사 NTD; 아미노산 잔기 1-137) 누사의 N- 말단 도메인의 존재에있어서, RNA 제품의 외관이 크게 누사 부족한 대조 실험에 비해 늦어졌다. 아미노...

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In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

시험 관내 전사 분석 실험 및 약물 발견에의 응용

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

15.1K 조회수.  University of Newcastle. In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

비디오: In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

TRNA Isopentenyl 전이 효소 활동을 감지 하는 체 외에서 분석 결과

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

연구

생화학

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for anti-cancer therapies. However, directly targeting transcription factors is often difficult and can cause adverse side effects if the transcription factor is necessary in one or more adult tissues. Identifying upstream regulators that aberrantly activate transcription factors in cancer cells offers a more feasible alternative, particularly if these proteins are easy to drug. Here, we describe a protocol that can be used to combine arrayed medium-scale lentiviral libraries and a dual-luciferase-based transcriptional reporter assay to identify novel regulators of transcription factors in cancer cells. Our approach offers a quick, easy, and inexpensive way to test hundreds of genes in a single experiment. To demonstrate the use of this approach, we performed a screen of an arrayed lentiviral RNAi library containing several regulators of Yes-associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ), two transcriptional co-activators that are the downstream effectors of the Hippo pathway. However, this approach could be modified to screen for regulators of virtually any transcription factor or co-factor and could also be used to screen CRISPR/CAS9, cDNA, or ORF libraries.

To identify novel regulators of transcription factors, we developed an approach to screen arrayed lentiviral or retroviral RNAi libraries using a dual-luciferase-based transcriptional reporter assay. This approach offers a quick and relatively inexpensive way to screen hundreds of candidates in a single experiment.

배열된 라이브러리의 중간 처리량 스크리닝및 이중 루시퍼라제 기반 리포터를 이용한 전사 계수 조절기 식별

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

암 연구학

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

배양 세포에서 암과 연관된 신호 전달을 심문위한 멀티 플렉스 루시 페라 기반 스크리닝 플랫폼

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

의학

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

HIV 역전사 및 인테그라 제 억제제의 빠른 검사

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

면역학 및 감염병학

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance--prior to or following clinical onset--is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

구현<em&gt; 체외</em&gt; 약물 저항 분석법 : 임상 적 저항 메커니즘을 폭로 가능성을 극대화

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Optimization of In vitro Transcription Reaction for mRNA Production Using Chromatographic At-Line Monitoring

In vitro transcription reaction (IVT) is a complex, multi-component enzymatic synthesis of mRNA from a linear DNA template, catalyzed by an RNA polymerase, e.g. T7. Due to the high cost of IVT reagents,&#160; IVT is a critical step in the mRNA drug substance production process and has been the focus of intense optimization in the field. To decrease the cost of mRNA production, reagents must be utilized optimally. Effective optimization necessitates a comprehensive understanding of the impact of individual reagents on reaction kinetics, i.e., the consumption of nucleoside triphosphates (NTPs) and the production of mRNA. Traditionally, low-throughput, end-point analytical techniques have been used for the analysis of mRNA. Though such methods give valuable information on mRNA content, at-line, near real-time analytics is needed to fully understand IVT reaction. We demonstrate how a liquid chromatography analytical method that separates NTPs, as well as pDNA and mRNA, can be used in near real-time to study IVT reaction kinetics. With the knowledge of the influence of different IVT components on kinetics and yield, rapid chromatographic analysis can be used to convert batch IVT reaction into a fed-batch mode that further increases productivity and reduces the overall cost of the reaction.

Optimizing in vitro transcription (IVT) is critical for cost-effective mRNA production. This protocol details an analytical chromatographic method for at-line analysis of IVT reaction, monitoring NTP depletion and mRNA production in batch or fed-batch modes, applicable to various RNA modalities, enhancing productivity and reducing costs.

크로마토그래피 앳라인(At-line) 모니터링을 사용한 mRNA 생산을 위한 체외 전사 반응 최적화(Optimization of in vitro transcription reaction for mRNA production using Chromatographic At-line monitoring)

In vitro transcription reaction (IVT) is a complex, multi-component enzymatic synthesis of mRNA from a linear DNA template, catalyzed by an RNA ...

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To dissect the role of 5&#39;-poly(A) leader in mRNA translation during poxvirus infection we developed an in vitro transcribed RNA-based luciferase reporter assay. This reporter assay comprises of four core steps: (1) PCR to amplify the DNA template for in vitro transcription; (2) in vitro transcription to generate mRNA using T7 RNA polymerase; (3) Transfection to introduce in vitro transcribed mRNA into cells; (4) Detection of luciferase activity as the indicator of translation. The RNA-based luciferase reporter assay described here circumvents issues of plasmid replication in poxvirus-infected cells and cryptic transcription from the plasmid. This protocol can be used to determine translation regulation by cis-elements in an mRNA including 5&#39;-UTR and 3&#39;-UTR in systems other than poxvirus-infected cells. Moreover, different modes of translation initiation like cap-dependent, cap-independent, re-initiation, and internal initiation can be investigated using this method.

We present a protocol to study mRNA translation regulation in poxvirus-infected cells using in vitro Transcribed RNA-based luciferase reporter assay. The assay can be used for studying translation regulation by cis-elements of an mRNA, including 5&#8217;-untranslated region (UTR) and 3&#8217;-UTR. Different translation initiation modes can also be examined using this method.

시험관 내 전사 된 RNA-기반 루시퍼 라 제 리포터 검정은 폭스 바이러스 감염 세포에서 번역 조절을 연구 하기 위해

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among traditional technologies, RNA interference suffers from partial target abrogation and the requirement for life-long treatments. In contrast, artificial nucleases can impose stable gene inactivation through induction of a DNA double strand break (DSB), but recent studies are questioning the safety of this approach. Targeted epigenetic editing via engineered transcriptional repressors (ETRs) may represent a solution, as a single administration of specific ETR combinations can lead to durable silencing without inducing DNA breaks.
ETRs are proteins containing a programmable DNA-binding domain (DBD) and effectors from naturally occurring transcriptional repressors. Specifically, a combination of three ETRs equipped with the KRAB domain of human ZNF10, the catalytic domain of human DNMT3A and human DNMT3L, was shown to induce heritable repressive epigenetic states on the ETR-target gene. The hit-and-run nature of this platform, the lack of impact on the DNA sequence of the target, and the possibility to revert to the repressive state by DNA demethylation on demand, make epigenetic silencing a game-changing tool. A critical step is the identification of the proper ETRs&#39; position on the target gene to maximize on-target and minimize off-target silencing. Performing this step in the final ex vivo or in vivo preclinical setting can be cumbersome.
Taking the CRISPR/catalytically dead Cas9 system as a paradigmatic DBD for ETRs, this paper describes a protocol consisting of the in vitro screen of guide RNAs (gRNAs) coupled to the triple-ETR combination for efficient on-target silencing, followed by evaluation of the genome-wide specificity profile of top hits. This allows for reduction of the initial repertoire of candidate gRNAs to a short list of promising ones, whose complexity is suitable for their final&#160;evaluation in the therapeutically relevant setting of interest.

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Here, we present a protocol for the in vitro selection of engineered transcriptional repressors (ETRs) with high, long-term, stable, on-target silencing efficiency and low genome-wide, off-target activity. This workflow allows for reducing an initial, complex repertoire of candidate ETRs to a short list, suitable for further evaluation in therapeutically relevant settings.

In Vitro (시험관 ) 표적 후성유전학적 침묵을 위한 엔지니어링된 전사 억제제 선택

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

생체공학

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, and multiwell-based assays are used to measure transcription factor activity. However, these assays are nonquantitative, lack specificity, may involve the use of radiolabeled oligonucleotides, and may not be adaptable for the screening of inhibitors of DNA binding. On the other hand, using a quantitative DNA-binding enzyme-linked immunosorbent assay (D-ELISA) assay, we demonstrate nuclear protein interactions with DNA using the RUNX2 transcription factor that depend on specific association with consensus DNA-binding sequences present on biotin-labeled oligonucleotides. Preparation of cells, extraction of nuclear protein, and design of double stranded oligonucleotides are described. Avidin-coated 96-well plates are fixed with alkaline buffer and incubated with nuclear proteins in nucleotide blocking buffer. Following extensive washing of the plates, specific primary antibody and secondary antibody incubations are followed by the addition of horseradish peroxidase substrate and development of the colorimetric reaction. Stop reaction mode or continuous kinetic monitoring were used to quantitatively measure protein interaction with DNA. We discuss appropriate specificity controls, including treatment with non-specific IgG or without protein or primary antibody. Applications of the assay are described including its utility in drug screening and representative positive and negative results are discussed.

We developed a quantitative DNA-binding, ELISA-based assay to measure transcription factor interactions with DNA. High specificity for the RUNX2 protein was achieved with a consensus DNA-recognition oligonucleotide and specific monoclonal antibody. Colorimetric detection with an enzyme-coupled antibody substrate reaction was monitored in real time.

유전자 발현의 DNA 상호 작용, 디스 전사 레귤레이터, 그리고 소설 안티 종양 에이전트를 식별 : 단백질을 연구하는 정량 분석

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

생물학

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...