이 프로토콜에서, 우리는 단백질과 DNA 사이 상호 작용을 확인할 수 있습니다, 유전자의 전사 적인 규정을 공개. 이것은 세포에 있는 분자 기계장치를 이해하는 것을 돕습니다. 기존 프로토콜을 수정한 다음 간단하고 명확한 분석 프로토콜을 설정합니다.
첫 번째 단계에서 프로토콜을 따르기만 하면 분석이 성공적으로 수행될 수 있습니다. 교차 연결된 크로마틴을 연기 후드에 넣고 1%VCaP 세포 배양 배지의 4밀리리터와 18.5%의 PFA0.229 밀리리터를 6센티미터 접시에 넣습니다. 접시를 부드럽게 소용돌이어 PFA를 고르게 분배합니다.
실온에서 정확히 10분 동안 배양하세요. 그런 다음 접시에 1.25-어어 글리신 용액의 0.47 밀리리터를 추가하고 실온에서 5 분 동안 배양하여 추가 교차 연결을 중지합니다. 원고에 따라 세포를 세척한 후 세포를 긁어 내고 세포 현탁액을 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 옮김합니다.
세포 현탁액을 가진 튜브를 실온에서 5분 동안 3, 000배 g에서 원심분리하여 세포 펠릿을 회수합니다. 파이펫을 사용하여 PBS를 완전히 제거합니다. 튜브 당 세포 수를 기록하고 셀 펠릿을 영하 80도에서 저장합니다.
세포 리시스를 수행하기 위해 먼저 저장된 VCaP 세포 펠릿을 얼음 위에 해동하십시오. 각 튜브에 PIC로 보충된 준비된 ChIP 셀 리시스 버퍼 300마이크로리터를 추가하고 펠릿을 철저히 재보냅니다. 튜브를 15초 동안 소용돌이치게 하고, 10분 동안 얼음에 서스펜션을 배양합니다.
섭씨 4도에서 3분간 9, 000배 g의 원심분리기. 상체를 완전히 제거하고 MNase 소화 버퍼300 마이크로리터를 추가하여 펠릿을 다시 일시 중지합니다. 1.5 밀리리터 튜브에 MNase 소화 버퍼로 MNase를 희석하여 마이크로리터 당 50 젤 단위를 산출합니다.
희석된 MNase를 서스펜션에 넣고 정확히 10분 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 2 1/2 분마다 반전으로 믹싱을 설정합니다. MNase 소화를 종료하려면 pH 8에 0.5-어금다EDTA의 30 마이크로리터를 추가하고 잠시 소용돌이를 추가하십시오.
얼음에 5 분 동안 잠복 후, 원심 분리기는 섭씨 4도에서 5 분 동안 9, 000 배 g에서. 상체를 완전히 제거하고 PIC로 보충된 제조된 ChIP 희석 버퍼의 300 마이크로리터에서 펠릿을 다시 분리합니다. 그런 다음 마이크로팁 프로브가 장착된 초음파 처리기에서 초음파 처리 조건을 2, 처리 시간 15초, 펄스 5초, 펄스 OFF 30초로 설정합니다.
얼음에 서스펜션을 초음파 처리합니다. 서스펜션의 마이크로리터 1개를 끌어내고 슬라이드 글래스에 반점합니다. 현미경의 밑에, 세포 구조가 거의 끊어졌는지 확인하기 위하여 관찰하십시오.
원심 분리튜브는 9, 000배 g에서 섭씨 4도에서 10분 동안, 새로운 1.5밀리리터 미세센트심분리기 튜브로 상전자관을 옮긴다. 소화된 크로마틴 20마이크로리터를 1.5밀리리터 스크류 튜브에 저장하여 추가 치료를 위해 나머지는 영하 80도에 보관하십시오. 첫째, 각 1.5 밀리리터 나사 튜브에서 75마이크로리터의 물, 5마리의 염화나트륨 4마이크로리터, 단백질과 DNA 사이의 교차 연결을 제거할 K.To 단백질아제 1마이크로리터를 추가하고, 각 MNase 소화 조건에서 20마이크로리터의 소화된 크로마틴을 스크류 튜브에 추가합니다.
캡을 단단히 닫고 완전히 섞은 다음 밤새 섭씨 65도에서 튜브를 배양합니다. 아침에는 튜브를 2~3, 000배, 몇 초 동안 원심분리한 후 100마이크로리터의 PCI를 추가합니다. 소용돌이는 적극적으로 에멀젼을 형성합니다.
실온에서 30초 동안 최대 속도로 튜브를 다시 원심분리합니다. 그런 다음 조건당 1.5 밀리리터 미세 센심 분리구 두 개를 준비합니다. 하나의 튜브에 100 마이크로리터의 PCI를 추가합니다.
pH 5.2에 3개의 어진 나트륨 아세테이트 10개, 글리코겐 2개를 다른 튜브에 넣습니다. 원심분리기에서 꺼낸 튜브에서 DNA를 함유한 상면을 조심스럽게 끌어들이고 PCI를 함유하는 튜브에 추가합니다. 소용돌이를 적극적으로, 실온에서 30 초 동안 최대 속도로 튜브를 원심 분리합니다.
다음으로, 이전에 제조된 아세테이트 나트륨과 글리코겐을 함유한 튜브로 상위를 이송한다. 에탄올 250 마이크로리터를 넣고 반전으로 섞습니다. 실온에서 10분 동안 배양하세요.
4섭씨에서 30분 동안 최대 속도로 튜브를 원심분리합니다. 튜브 바닥의 펠릿을 확인합니다. 펠릿을 방해하지 않도록 상체를 조심스럽게 제거하고 70 %의 마이크로 리터 500 을 추가하십시오.
4섭씨에서 최대 속도로 튜브를 원심분리합니다. 상체를 완전히 제거하고 실온에서 약 5 분 동안 펠릿을 건조시십시오. 그런 다음 20 개의 마이크로 리터를 추가하여 펠릿을 녹입니다.
UV 분광계를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다. 소화 된 크로마틴을 준비 한 후 얼음에 있는 모든 샘플을 해동하십시오. 500 마이크로리터 당 5 마이크로 그램의 농도로 소화 된 크로마틴을 희석하기 위해 PIC로 보충 된 준비 된 ChIP 희석 버퍼1200 마이크로 리터를 추가하십시오.
희석된 소화 된 크로마틴의 마이크로 리터 5 를 입력 샘플로 1.5 밀리리터 나사 튜브에 추가합니다. 샘플을 영하 80도에 보관하십시오. 희석된 소화된 크로마틴 을 각각 500마이크로리터를 면역 침전 시료로 1.5밀리리터 나사 관에 추가합니다.
각 튜브에 2 마이크로그램의 항체를 추가하고 뚜껑을 닫습니다. 하룻밤 사이에 4도에서 튜브를 배양하고 흔들 기 장에서 부드럽게 섞습니다. 아침에는 각 튜브에 ChIP 급 단백질 G 자기 구슬 30 마이크로리터를 추가합니다.
부드러운 혼합으로 2 시간 동안 섭씨 4도에서 튜브를 다시 배양하십시오. 그 후, 튜브를 2~3, 000배로 짧게 회전시키고, 1분 동안 네오디뮴 자석이 들어있는 폴리에틸렌 랙에 튜브를 놓습니다. 그런 다음, 조심스럽게 포부에 의해 상부를 제거합니다.
다음으로, 각 튜브에 저염 면역 복합 세척 버퍼의 0.5 밀리리터를 추가합니다. 튜브를 잠시 소용돌이쳐 구슬을 분산시합니다. 흔들리는 플랫폼에서 부드러운 혼합으로 5 분 동안 섭씨 4도에서 튜브를 배양하십시오.
원고에 따라 고염 면역 복합체및 염화리 면역 복합체로 세척을 반복합니다. 나머지 상체를 완전히 제거한 후 튜브에 용출 버퍼 150 마이크로리터를 추가합니다. 튜브를 소용돌이하여 구슬을 완전히 분산시합니다.
뚜껑을 닫고 튜브를 섭씨 65도에서 30분 동안 배양합니다. 구슬을 완전히 분산하려면 5분마다 반전으로 섞습니다. 인큐베이션 동안 1.5 밀리리터 나사 튜브를 준비하고, 5개의 어금니 나트륨염화와 2개의 미백제 K.Thaw의 마이크로리터 6개를 얼음에 미리 준비한 1%의 입력 샘플을 추가합니다.
용출 완충제 150마이크로리터, 염화나트륨 5개소미리터 6개, 단백질제 K 마이크로리터 2개를 입력 시료에 추가합니다. 구슬이 들어 있는 튜브의 잠복 후, 아래로 회전. 튜브를 자기 랙에 1분 동안 놓고, 초음파 처리 전후의 교차 연결된 세포 펠릿의 염화 나트륨 과 단백질을 포함하는 나사 튜브로 상체를 전송한다.
초음파 처리없이, 세포 구조는 크롬틴이 핵에 존재한다는 것을 나타내는 그대로 유지됩니다. 간단한 초음파 처리는 세포 구조를 깨뜨립니다. 크로스 링크 크로 마틴VCaP 세포에서 제조 하 고 MNase의 다양 한 금액으로 소화.
MNase를 추가하지 않고, 매우 높은 분자량을 가진 얼룩 패턴이 나타났습니다. MNase의 추가는 MNase가 중핵을 소화한다는 것을 보여주는 사다리 패턴을 주었습니다. 최대 900bp까지 크롬타닌 단편을 생성한 조건만 적절한 소화로 간주될 수 있지만 부적절한 소화 패턴은 주로 단핵증 생성을 초래한 과다소화를 보여줍니다.
VCaP 세포에서 크로마틴의 소화 패턴은 크로마틴의 적절한 소화를 나타냅니다. H3K4methyl3의 가장 높은 점유율은 AR-TSS의 약 0.5 킬로베이스와 1킬로베이스 상류로 관찰되었다. 그러나 AR-TSS의 19킬로베이스와 8kb 상류 및 12킬로베이스 하류에 위치한 지역은 H3K4methyl3의 점유율이 거의 없었기 때문에 부정적인 영역으로 사용할 수 있음을 나타냅니다.
MNase 소화 상태를 결정하는 것이 가장 중요합니다. 모든 실험에서 세포 수, 완충부 및 효소 양을 유지합니다. 조건은 각 세포 모형에 대해 확인되어야 합니다.
우리는 변성 게놈 병변 사이의 상호 작용을 결정하기 위해 요인과 크로마틴 형성 캡처의 글로벌 점유를 위한 ChIP 순서를 수행할 수 있습니다. 이 방법은 전사의 공정 메커니즘을 공개할 수 있다. ChIP 분석은 전사 적 규제를 조사하기위한 강력한 도구이지만 번거롭고 재현 할 수 없습니다.
우리의 방법은 연구원이 일상적으로 쉽게 분석법을 수행하도록 장려합니다.
