This work was supported by the United States Federal Drug Administration (FDA) contract HHSF223201310224C and the United States National Institutes of Health/FDA grant 1U01FD004573-01.

건강한 사람에서 드 확인 된 혈액 샘플은 콜로라도 병원의 대학 (오로라, 콜로라도)에서 있었다. 유효성 연구뿐만 아니라, 구경 및 품질 대조 시료의 제조 디 식별 혈액 은행 샘플의 사용은 콜로라도 멀티위원회 (Institutional Review Board COMIRB, 오로라, 콜로라도)에서 &quot;제외&quot;으로 간주 하였다. 참고 문헌 및 솔루션 1. 준비 <ol><li> 구매 타 크롤리 무스와 내부 표준 D 2, 재료 목록에 나열된 공급 업체의 13 C-타 크롤리 무스. <ol><li> 타크로리무스 1 ㎎ / ㎖의 농도 및 D (2) 10 ㎍ / ㎖, 13 C-타크로리무스의 농도로 순수 메탄올 중의 스톡 용액을 준비한다. 3 개의 독립적 인 가중치를 기반으로 표준 물질의 재고 솔루션을합니다. 나누어지는 재고 솔루션 및 저장 -70 ° C에서 이하. </li></ol></li><li> 단백질을 침전 솔루션을 준비합니다(: 3 V : 7 V) 물에 메탄올 / 0.2 M ZnSO 4를 사용하여 타 크롤리 무스의 압축을 풉니 다. 이 용액은 또한 내부 표준 D 2, 2.5 NG / ㎖의 농도에서 13 C-타크로리무스를 포함하고 빈 샘플의 추출을 제외한 모든 샘플 (1.3.3 참조)의 추출에 사용된다. <ol><li> 각 추출 날에 갓이 단백질 침전 솔루션을 준비하고 12 시간에서 솔루션의 만료를 설정합니다. </li></ol></li><li> 교정 곡선 및 품질 관리 (QC) 샘플의 제조 <ol><li> 순수한 메탄올 원액 적절한 희석액을 행하여 타크로리무스의 스톡 용액을 준비한다. </li><li> 교정기 및 품질 관리 샘플을 제조 EDTA 전혈로 적절히 희석 스톡 용액 20 μl를 스파이크, 20 분 및 분취위한 셀룰러 혈액 성분에 타크로리무스의 균일 분포를 허용하도록 수욕 진탕 부드러운하에 37 ℃에서 배양 1.5 ml의 용종에원뿔 바닥 ropylene 튜브 및 스냅인에 뚜껑. 유기 용매의 상대적 양이 5 %를 초과하지 않도록하십시오. </li><li> 스팟 피펫을 사용하여 필터 카드에 각 원의 중앙으로 아군 전체 혈액의 50 μL. </li><li> 3 시간 동안 실온에서 필터 카드에 혈액 반점을 건조. </li><li> 1, 2.5, 5, 10, 25, 50 NG / ㎖의 농도에서 타크로리무스 EDTA 인간 전혈에 타크로리무스 검정 표준을 준비한다. 내부 표준 D 2, 13 C-타 크롤리 무스 ( &quot;제로 샘플&quot;)을 포함하는 단백질 침전 용액으로 교정 표준 등의 추출을위한 빈 샘플을 준비합니다. </li><li> 0, 2, 4, 20, 40 NG / ㎖의 농도로 EDTA 인간 전혈에서 QC 샘플을 준비한다. 빈 샘플을 준비합니다. 내부 표준 D 2를 함유하는 침전으로 추출 QC 샘플들과 대조적으로, C-13 타크로리무스, 않는 단백질 침전 용액이 빈 샘플을 추출내부 표준 D 2, 13 C-타 크롤리 무스 ( &quot;빈 샘플을&quot;)가 포함되어 있지. </li></ol></li><li> 임상 샘플 컬렉션 <ol><li> 43, 44에 기술 된 바와 같이 건조 혈액 명소를 수집합니다. </li></ol></li></ol> 2. 타 크롤리 무스의 추출 건조 혈액 스팟 샘플 <ol><li> 시각적으로 허용되는 샘플의 품질과 양 (45)을 보장하기 위해 건조 혈액 자리를 검사합니다. </li><li> 6 mm의 구멍 펀치 필터 카드의 혈액 자리의 펀치 센터. 주 : 펀치의 품질은 계량에 의해 모니터링 될 수있다. 천공 포화 필터 디스크는 0.09 mg의 (: 4.83- 5.14 ㎎, N = 12 범위) ± 평균 5.02 밀리그램에 무게. </li><li> 원뿔 바닥 스냅인에 뚜껑 1.5 ml의 폴리 프로필렌 튜브에 장소 디스크. </li><li> 각각의 튜브에 20 ~ 30 글 머리 기호를 추가합니다. </li><li> 각각의 튜브에 (2.5 NG / ㎖의 내부 표준 V : 0.2 M ZnSO 4, 7 : 3, V 메탄올) 단백질 침전 용액 500 μl를 추가합니다. EXTR 들어빈 샘플의 동작은, 내부 표준없이 단백질 침전 솔루션을 사용합니다. </li><li> ( &quot;10&quot;을 설정, 최대 속도) 1 분 동안 총알 블렌더에 디스크를 균질화. </li><li> 10 분 동안 ( &quot;10&quot;을 설정, 최대 속도) 멀티 튜브의 소용돌이에 실온에서 샘플을 흔들어. </li><li> 원심 분리기 샘플 16,000 XG, 10 분 동안 4 ° C에서. </li><li> 300 μL 삽입 장착 유리 HPLC 바이알에 상층 액을 전송합니다. 미리 슬릿 테플론 씰을 사용합니다. 주 : 추출 된 샘플은 -20 ° C 이하에서 LC-MS / MS 분석 때까지 저장 될 수있다. </li></ol> 3. LC-MS / MS 분석 <ol><li> 부하 (100) C8 카트리지 추출​​ 컬럼으로 추출 된 샘플의 상등액 μL 및 7로 세척한다 : 물 중 0.1 % 포름산 : 3 비율을 5 ml의 아세토 니트릴 흐름 / 분으로 1 분 동안. 전환 밸브의 연결은도 2에 도시되고 구배 표 1 추출 펌프에 의해 실행 </st&gt; 룽. </li><li> 이하는 분석 컬럼에 미리 열에서 분석의 백 플러시의 결과로 전환 밸브를 활성화합니다. </li><li> 65 ° C의 열 온도를 설정합니다. </li><li> 표 1에 나타낸 유량과 구배를 사용하여 분석 컬럼에서 분석 물을 용리. </li><li> 터보 전기 분무 이온화 소스를 통해 탠덤 질량 분석기로 분석 컬럼을 연결합니다. 표 2에있어서 질량 분석의 주요 파라미터를 조정한다. </li><li> 여러 반응 모드 (MRM)의 양이온 ([M + 나] +)를 검출한다. 정량을 위해 다음과 같은 이온 전환을 사용하여 타 크롤리 무스 : M / Z (질량 / 충전) = 826.6를 616.2와 D 2, 13 C-타 크롤리 무스 → : M / Z = 619.2 → 829.6을. 참고 : 전체 실행 시간은 4.6 분입니다. </li></ol> 4. 정량 <ol><li> 각 실행에 대해, 1.3.5 및 제조 교정기에 기초 검량선을 생성각각의 분석 실행에 포함. <ol><li> 질량 분석 소프트웨어를 사용하여 (피크 면적 [분석 대상 물질] / 피크 면적 [내부 표준]) 검체의 응답 인자 대 공칭 농도를 플로팅함으로써 교정 곡선을 생성한다. </li><li> 1 / X 가중치와 함께 차 착용감을 사용하여 교정기를 장착한다. </li></ol></li><li> 건조 된 혈액 관광 명소 수량 타 크롤리 무스에 추출 된 MRM 크로마토 그램에서 타 크롤리 무스와 내부 표준 물질 피크를 통합 할 수 있습니다. 타 크롤리 무스에 대한 응답 인자 (피크 면적 [분석 대상 물질] / 피크​​ 면적 [내부 표준)를 계산하고 질량 분석 소프트웨어를 사용하여 검량선과 비교한다. </li></ol> 5. 검증 절차 <ol><li> 검출 (LLOD)의 하한과 정량 (LLOQ)의 하한. <ol><li> 검출부 (LLOD)의 하한으로서 1 : 4의 피크 - 대 - 잡음비와 낮은 타크로리무스 농도를 고려한다. 로서 정량화 (LLOQ)의 하한을 정의동일하거나 공칭 농도와 같거나 더 나은 20 %의 정밀도 (변동 계수)에서 ± 20 %의 편차를보다 나은 정확성으로 검량선의 최저 농도. </li></ol></li><li> 인트라 간 하루의 정확도 및 정밀도. <ol><li> 2 겨 / ㎖ (QC1), 4 겨 / ㎖ (QC2), 20 ng를 / ㎖ (QC3) 40 겨 / ㎖ (QC4)의 네 가지 농도 수준의 정확도와 정밀도를 테스트합니다. </li><li> 인간의 EDTA 전체 혈액의 각 검증 하루에 품질 관리 샘플을 준비 필터 카드, 추출물 건조, 전술 한 바와 같이 분석한다. </li><li> 품질 관리 농도 레벨 당 6 샘플 내 하루의 정확성과 정밀도를 결정합니다. </li><li> 이십일 동안 간 일의 정확도와 정밀도를 평가합니다. 4 샘플을 매일 각각의 품질 관리 수준을 측정한다. </li><li> 각각의 날에 품질 관리 샘플과 함께 두 교정 곡선을 분석합니다. </li><li> 공칭 농도 % (농도에 6 샘플, 5.2.2 참조)로 내 하루 정확도를 계산합니다. 석회질변동 (CV %)의 계수로서 ulate 정밀도. </li><li> 수용은 공칭 농도의 85 % 115 % 제한으로가 떨어지면 안 일 정밀도가 허용 고려한다. 그것은 15 % CV (변동 계수)과 같거나 더 나은 상 허용되는 경우 인트라 일 정밀도를 고려한다. </li><li> 20 검증 일 동안 분석 각각의 품질 관리 농도에 대한 평균으로 간 하루 정확도와 정밀도를 계산합니다. </li><li> 수용은 공칭 농도의 85 % 115 % 제한으로이 떨어지는 경우 평균 간 하루 정도는 허용 고려한다. 그것은 15 % CV (변동 계수)과 같거나 더 나은 상 허용되는 경우 일 간 정밀도를 고려한다. </li></ol></li><li> 매트릭스 간섭의 배제. <ol><li> 매트릭스 신호에 의해 발생할 수 있습니다 간섭의 배제를 들어, 빈 건조 혈액 명소 (8 다른 개인, 바람직하게는 4 명의 남성과 4 명의 여성)을 분석 할 수 있습니다. </li><li> 시각적으로 이온 크로마토 그램을 검사합니다. 만약 고정 된 시간 내에 피크타 크롤리 무스의 창은 LLOQ에서 타 크롤리 무스와 스파이크 통합하고 빈 샘플 타 크롤리 무스 피크의 사람들과 곡선에서 자신의 영역을 비교, 검색됩니다. 빈 샘플 피크의 면적은 LLOQ에서 타 크롤리 무스의 사람들의 15 %를 초과 할 것으로 예상되지 않습니다. </li></ol></li><li> 이온 억제 / 이온 향상. <ol><li> 동시 용출 매트릭스 성분에 의한 이온 진압 / 이온 향상의 잠재적 인 간섭을 평가하기 위해 45 바와 같이 포스트 칼럼 주입 프로토콜을 사용한다. </li><li> 0.1 % 포름산 10 ㎍ / ml의 농도에서 타크로리무스 달이다 : 메탄올 (30:70, v / v)로 포스트 - 컬럼을 10 μL / 분의 속도. <ol><li> 분석 컬럼과 질량 분석기의 전기 분무 소스 간 T 피스를 통해 시린지 펌프를 연결한다. </li><li> 타 크롤리 무스에 대한 MRM 전이 MS / MS 데이터 신호 강도를 모니터링하고 내부 표준 (m / z = 616.2 및 m / z = 829.6 → 619.2 → 826.6)의 주입 후 extrac테드 빈 샘플 (N = 다른 개인 8 샘플). 주 : 이온 억제 신호 및 이온 인핸스 피크 딥이 발생하는 동안, 이온 억압 / 이온 충실한없는 분석 물 주입에 의한 연속 신호는, 빈 매트릭스 주사에 의해 영향을받지 않을 것이다. </li></ol></li></ol></li><li> 이월. <ol><li> 가장 높은 구경 후 빈 샘플을 추출 분석하여 잠재적 인 캐리 오버 평가 (50 NG / ㎖, N = 6). </li><li> 시각적으로 이온 크로마토 그램을 검사합니다. 타 크롤리 무스의 체류 시간 윈도우 내의 피크가 검출되는 경우에 타크로리무스 LLOQ 타서 통합 및 빈 샘플 타크로리무스 피크들과 그 곡선 아래 영역을 비교한다. 빈 샘플 피크의 면적은 LLOQ에서 타 크롤리 무스의 사람들의 15 %를 초과 할 것으로 예상되지 않습니다. </li></ol></li><li> 추출 회복. <ol><li> QC SAM 추출한 후 분석 물 신호를 비교하여 회수율을 결정PLES 빈 건조 혈액 명소들과 네 가지 농도 수준 (N = 농도 당 6)에서 추출 후 타 크롤리 무스의 상응하는 양의 스파이크. </li><li> QCS의 4 세트 (2, 4, 20, 40 NG / ㎖ 농도 수준)을 준비한다. </li><li> 필터 종이 카드에 빈 EDTA 전체 혈액의 50 μl를 파악하고, 2 시간 동안 건조하여 &quot;복구 테스트 샘플을&quot;대응의 또 다른 4 세트를 준비합니다. </li><li> 이하, 품질 관리 및 빈 &quot;복구 테스트 샘플&quot;모두, 가위로 필터 카드의 전체 혈액의 자리를 잘라 원뿔 바닥과 스냅인에 뚜껑 폴리 프로필렌 튜브에 생성 된 디스크를 넣습니다. </li><li> 모든 샘플을 추출합니다. </li><li> 유리 HPLC 바이알에 상층 액 (400 μL)를 전송합니다. </li><li> 2, 4, 20, 40 ng를 / ㎖ (200, 400, 2,000, 4,000 NG / ㎖ 타크로리무스 스톡 졸 4 μL의 농도에 도달하는 빈 &quot;추출 회수 시험 샘플&quot;에 타크로리무스 스톡 용액을 첨가상층 액 400 μL)에 용액 사용. </li><li> LC-MS / MS 분석 한 결과, QC 샘플 및 해당 농도의 &quot;회복 시험 샘플&quot;모두에서 신호를 비교 (추출 / 신호 샘플이 추출 × 100 이후 아군 전에 회수 (%) = 신호 샘플은 아군). </li></ol></li><li> 희석의 무결성. <ol><li> 희석하여 무결성을 확립 시료 500, 250, 100ng의 / ㎖에서 분석 대상으로 스파이크. </li><li> 추출 후, 단백질 침전 용액을 사용하여 시료 희석 (1:10, N = 3 농도 수준 당). </li><li> 공칭 농도의 편차를 계산합니다. 85 % 내에서 공칭 허용의 -115 % 하락할 결과를 고려한다. </li></ol></li><li> 안정성. <ol><li> 네 농도 수준 (N = 농도에 따라 4) 다른 시간 지점에서와 다른 저장 조건에서 분석의 품질 관리 샘플을 사용하여 안정성을 조사합니다. </li><li> 공칭 값을 저장 한 후 결과를 비교한다. R을 고려85 % 내에서 공칭 허용의 -115 % 하락 esults. </li><li> 4 ° C, -20 ° C에서 1개월 및 -80 ° C에서 1 개월 일주, 상온에서 1 주일 동안 샘플의 안정성을 설정합니다. </li><li> 3주기를 통해 테스트 동결 - 해동 안정성 (-20 ° C). 4 ℃로 조정 된 항온 자동 시료 주입기로 샘플을 배치하여 테스트 추출 된 샘플 및 오토 샘플러 안정성. 72 시간 후 샘플을 주입한다. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

전술 한 바와 같이, 건조 혈액 반점에 기초 치료약 및 타 크롤리 무스의 부착 모니터링 개념 매력적이며, 비록 전형적 정맥 EDTA 전혈 샘플에 타크로리무스의 LC-MS / MS 분석과 연관된 넘어 분석 과제가있다. 이들은 다음을 포함하지만, 여기에 사용되는 행렬은 필터 카드 재료와 저 혈량 (20 μL)의 코튼 린터 재료에 담가 모세관 전혈 사실, 이에 한정되지 않는다. 그럼에도 불구하고, 중앙 연구소에서 ?...

타 크롤리 무스는 마크로 라이드 구조 (8) (그림 1)이 강력한 immonosuppressant 1-7이다. 653g / L, 에탄올 : - 시스로 인한 CN 결합의 트랜스 이성질체는 역상 고성능 액체 크로마토 그래피로 분리 될 수있는 용액을 9 개의 로타 머를 형성한다 (HPLC)은 타 크롤리 무스는 알코올 (메탄올 중의 지용성 및 수용성 355 G / L), 할로겐화 탄화수소 (클로로포름 : 573g / L) 및 에테르. . 0.1 G / L 및 물 (pH를 3 : 그것은 지방족 탄화수소 (헥산에 난 용성이다. 분자가 어떤 발색단과 자외선 최대 흡수를 포함하지 않는 9 0.0047 g / L) 칼시 뉴린 억제를 통해 192 nm의 타 크롤리 무스의 역할입니다 . 그 작용 메커니즘은 참조 10,11에서 검토되었다. 현재는 미국 (12)에 고체 기관 이식 환자의 80 % 이상으로 사용된다. 타크로리무스의 치료 지수는 considere있는 것이다D 13 좁은합니다. 또한, 타 크롤리 무스 및 투여 혈중 농도 간의 상관 관계는 좋지는 14,15 및 약동학 변수이다. 이식 환자에서 타 크롤리 무스 투여를 안내하는 치료 약물 모니터링 따라서 일반적으로 임상 실습 16 ~ 20입니다. 목표는 미리 정의 된 치료 범위 내에 타크로리무스의 혈중 농도를 유지하는 것이다. 치료 창 이상의 농도가 과다 면역, 암 등의 신 독성, 신경 독성, 고혈압, 당뇨병 등의 독성에 대한 위험이 증가하는 동안 치료 적 범위보다 타크로리무스 혈중 농도는 만성 또는 급성 동종 면역 반응의 활성이 증가 될 수 있습니다. 타 크롤리 무스의 높은 약동학 내 개인 변동성 이식 기관과 환자 생존율 (21, 22) 모두에 해가 될 수있다. 타 크롤리 무스의 약동학의 간 개별 변동은 주로 CYP3A5 다형성, 내 개인에 대한 이유에 의해 발생되는 동안변동성이 포함되지만, 약물 - 약물, 질병 - 약물 및 식품 - 약물 상호 작용 14, 15에 한정되는 것은 아니다. 또한 면역 억제 치료 약물 처방을 준수의 부족은 요인 및 이식 손실 (23, 24)에 대한 주요 이유입니다. 이러한 고려 사항은 빈번한 홈 치료약 및 타크로리무스 전혈 농도 부착 모니터링 환자가 항상 원하는 치료 창 내 타크로리무스 노출을 가질 수 있도록하는 것이 유익 할 수 있음을 시사한다. 그러나, 현재의 임상 15 금지 인 물류 및 더 빈번한 모니터링 치료약의 비용 때문이다. 그 이유 중 하나는 환자 phlebotomist 그린 필요한 정맥 혈액 샘플을 가지고 참조한다는 것이다. 말린 혈액 반점은 최근에 매력적인 개념 25-28로 등장했다. 환자 스틱 간단한 손가락 한 것은 특수 필터 종이 카드 및 혈액 자리가 거라고 한 후 혈액 방울을 수집리 에드, 그것은 타 크롤리 무스의 분석과 환자가 현재 복용 될 수 있음을 다른 면역 억제제를위한 중앙 실험실로 발송 될 수있다. 이는 건조 혈액 명소 (혈액의 일반적으로 20 μL) 25,29-43로 인해 아주 작은 혈액 볼륨에서 타 크롤리 무스와 다른 면역 억제제의 정량에 매우 민감하고 특정 LC-MS는 / MS 분석의 개발이 가능하게되었다. 또 다른 장점은 건조 혈액 명소로 최소 침습, 낮은 볼륨 시료 채취 전략은 크게 어린이 (28)의 치료 적 약물 모니터링 및 약동학 적 연구를 촉진한다는 것이다. 타 크롤리 무스는 일반적으로 정맥 EDTA 전혈 (15)로 측정됩니다. 이유는 타 크롤리 무스가 광범위하게 혈액 세포로 배포하는 것이 임상 연구는 임상 이벤트 15,18 플라즈마에 비해 혈중 타 크롤리 무스 통 농도 사이 좋은 상관 관계를보고했다고한다. 비교하여, TA의 분석건조 혈액 반점에서 crolimus은 여과지 매트릭스와 혼합 모세관 혈액에 기초한다. 이것은 LC-MS / MS 분석으로 타크로리무스 및 잠재적 간섭의 가용화면에서 과제를 제시한다. 여기에서 우리는 높은 흐름 온라인 열 샘플 정리 절차 및 LC-MS / MS 분석과 함께 총알 블렌더를 사용하여 건조 혈액 자리의 균질화를 기반으로 설립 검증 분석을 제시한다. 오늘날,이 분석은 임상 시험을 성공적으로 부착 모니터링 이상의 오천 타크로리무스 건조 혈액 샘플의 스폿 정량화에 사용되었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reference Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacrolimus</td>
			<td>U.S. Pharmacopeial Convention</td>
			<td>1642802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2,13C-Tacrolimus</td>
			<td>Toronto Research Chemicals Inc.</td>
			<td>F370002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cells</td>
			<td>University of Colorado Hospital</td>
			<td>W20091305500 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma</td>
			<td>University of Colorado Hospital</td>
			<td>W2017130556300Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone CHROMASOLV, HPLC, &#8805; 99,9 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>439126-4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/ MS, UHPLC- UV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol 99.9 %, HPLC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2632-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol Optima LC/ MS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Optima LC/ MS, UHPLC- UV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A118P-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Z68-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Instruments and Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 &#8211; 10 &#181;l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008649</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,5 mL- Eppendorf tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-550</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#8211; 100 &#181;L pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008651</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT 10XLS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#8211; 1000 &#181;l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008653</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>Multimax</td>
			<td>2940</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 &#8211; 20 &#181;L pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008650</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL- Eppendorf tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-258</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#8211; 200 &#181;L pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>P-1237-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L- pipet tips with filter</td>
			<td>Multimax</td>
			<td>2938T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>Multimax</td>
			<td>2936J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL- Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#956;L inserts for&#160; HPLC vials</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>ARO-9973-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance PR2002</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>1117050723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balances AX205 Delta Range</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>1119343379</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Biofuge Fresco</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>290395</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Wipes</td>
			<td>PDI</td>
			<td>Q55172</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass v ials, 4 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-334</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials, 20 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B7800-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves, nitrile</td>
			<td>Titan Brand Gloves</td>
			<td>44-100S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC vials, 9 mm, 2 mL, clear</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>ARO- 9921-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lids for HPLC vials</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>ARO- 8952-13-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 18G 1.5</td>
			<td>Precision Glide</td>
			<td>305196</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack for Eppendorf tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack for HPLC Vials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-541-29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel beads 0.9 &#8211; 2 mm</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB14B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage boxes for freezers / refrigerators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-395-464</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard multi-tube vortexer</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td>658816-115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK</td>
			<td>GE Whatman&#160;</td>
			<td>2016-05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Equipment and Columns</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler</td>
			<td>CTC PAL&#160;</td>
			<td>PAL.HTCABIx1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binary pump, Agilent 1260 Infinity</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 G1312B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binary pump, Agilent 1290 Infinity</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1290 G4220A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro vacuum degasser, Agilent 1260</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 G13798</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column oven,&#160; Agilent 1290 with 2 position&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1290 G1216C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valve</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1290 G1316C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 &#181;m particle size), 4.6 &#183; 12.5 mm</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>820950-926</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 &#181;m particle size), 4.6 &#183; 150 mm</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>993967-906</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tandem Mass Spectrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>API5000 MS/MS with TurboIonspray source</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>4364257</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometry software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Analyst 1.5.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of the immunosuppressant tacrolimus on dried blood spots using lc-ms/ms

칼시 뉴린 억제제 타 크롤리 무스는 미국에서 고체 장기 이식 후 대부분의 면역 치료 프로토콜의 초석이다. 타 크롤리 무스는 좁은 치료 지수 약물이며, 등은 치료 적 약물 모니터링 및 전체 혈액 통 농도를 기반으로 용량 조절이 필요합니다. 가정 치료 약물 및 준수 모니터링을 용이하게하기 위해, 건조 혈액 명소의 컬렉션은 매력적인 개념이다. 핑거 스틱 후, 환자는 집에서 필터 종이에 혈액 방울을 수집한다. 혈액이 건조 된 후에는 타크로리무스는 고성능 액체 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법을 이용하여 정량화 분석 실험실로 송부 (HPLC-MS / MS) 간단한 수동 단백질 침전 단계 및 온라인 열 추출과 조합. 타 크롤리 무스 분석을 위해, 6 mm 디스크는 혈액 스폿의 중심으로부터 펀칭 포화된다. 혈액 자리는 총알 블렌더를 사용하여 균질화ND 후 단백질은 메탄올 / 0.2 M ZnSO 4 내부 표준 D 2, C-13을 함유 타크로리무스로 침전된다. 볼 텍싱 및 원심 분리 후, 상청액 100 μL를가 온라인 추출 칼럼에 주입하고, 5 ㎖ / 0.1 포름산 / 아세토 니트릴로 세정 분 (7 : 3, V : V) 1 분. 이하, 전환 밸브가 작동하고 분석 물은 분석 컬럼에 백 플러시 (및 0.1 % 포름산 / 아세토 니트릴 구배를 사용하여 분리)된다. 타크로리무스는 탠덤 질량 분석 장치를 사용하여 다중 반응 양성 모드 (MRM)으로 정량화된다. 분석은 50 ng 내지 1 / ㎖에서 선형이다. 로 이십일에 걸쳐 평가 간 분석 변동 (3.6 % -6.1 %)과 정확성 (91.7 % -101.6 %)이 허용 기준을 충족. 평균 추출 회수는 95.5 %이다. 이월, 매트릭스 간섭 및 매트릭스 효과 아무런 관련이 없습니다. 타 크롤리 무스는 실온에서 1 주일 동안 4 ℃에서 건조 혈액 명소에서 안정적이다. 에서 추출 된 샘플오토 샘플러는 최소 72 시간 동안 4 ℃에서 안정하다.

블랭크 샘플의 대표적인 이온 크로마토 그램은, 샘플은도 3에 도시되어 정량화 및 환자 샘플의 하한에서 아군. 교정 곡선 검출 하한은 0.5 ml의 NG /이었고, 정량 하한은 1.0 ng를 / ㎖이었다. 높은 농도가 정상적인 상황에서 병원에 도달 할 가능성이 있습니다로 쉰 NG는 / ml로 가장 높은 교정기로 선정되었다. 교정 곡선은 갓...

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Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

LC-MS / MS를 사용하여 건조 혈액 명소에 면역 억제제 타 크롤리 무스의 정량화

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

quantification-immunosuppressant-tacrolimus-on-dried-blood-spots

Research

JoVE Journal

Medicine

16.7K 조회수.  University of Colorado, Anschutz Medical Campus. Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

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A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of spinal cord injury (SCI) in which the thoracic spinal cord is injured. Additionally, because most human cord injuries occur as the result of blunt, non-penetrating trauma (e.g. motor vehicle accident, sporting injury) where the spinal cord is violently struck by displaced bone or soft tissues, the majority of SCI researchers are of the opinion that the most clinically relevant injury models are those in which the spinal cord is rapidly contused.1 Therefore, an important step in the preclinical evaluation of novel treatments on their way to human translation is an assessment of their efficacy in a model of contusion SCI within the cervical spinal cord. Here, we describe the technical aspects and resultant anatomical and behavioral outcomes of an unilateral contusive model of cervical SCI that employs the Infinite Horizon spinal cord injury impactor.
Sprague Dawley rats underwent a left-sided unilateral laminectomy at C5. To optimize the reproducibility of the biomechanical, functional, and histological outcomes of the injury model, we contused the spinal cords using an impact force of 150 kdyn, an impact trajectory of 22.5&deg; (animals rotated at 22.5&deg;), and an impact location off of midline of 1.4 mm. Functional recovery was assessed using the cylinder rearing test, horizontal ladder test, grooming test and modified Montoya's staircase test for up to 6 weeks, after which the spinal cords were evaluated histologically for white and grey matter sparing.
The injury model presented here imparts consistent and reproducible biomechanical forces to the spinal cord, an important feature of any experimental SCI model. This results in discrete histological damage to the lateral half of the spinal cord which is largely contained to the ipsilateral side of injury. The injury is well tolerated by the animals, but does result in functional deficits of the forelimb that are significant and sustained in the weeks following injury. The cervical unilateral injury model presented here may be a resource to researchers who wish to evaluate potentially promising therapies prior to human translation.

A reliable and repeatable way to produce a cervical unilateral spinal cord injury using the Infinite Horizon impactor is described. The method takes advantage of a custom designed frame and clamp to stabilize the spine. The standardized procedure and biomechanical injury parameters result in sufficient and sustained injuries.

무한 호라이즌 임팩터을 사용하여 일방적 경부 척수의 부상의 Contusive 모델

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

연구

의학

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Progress in prostate cancer research is severely limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems, which limit our ability to understand genetic and molecular events underlying prostate disease initiation. Toward developing better model systems for studying human prostate carcinogenesis, we and others have taken advantage of the unique pro-prostatic inductive potential of embryonic rodent prostate stroma, termed urogenital sinus mesenchyme (UGSM). When recombined with certain pluripotent cell populations such as embryonic stem cells, UGSM induces the formation of normal human prostate epithelia in a testosterone-dependent manner. Such a human model system can be used to investigate and experimentally test the ability of candidate prostate cancer susceptibility genes at an accelerated pace compared to typical rodent transgenic studies. Since Human embryonic stem cells (hESCs) can be genetically modified in culture using inducible gene expression or siRNA knock-down vectors prior to tissue recombination, such a model facilitates testing the functional consequences of genes, or combinations of genes, which are thought to promote or prevent carcinogenesis.
The technique of isolating pure populations of UGSM cells, however, is challenging and learning often requires someone with previous expertise to personally teach. Moreover, inoculation of cell mixtures under the renal capsule of an immunocompromised host can be technically challenging. Here we outline and illustrate proper isolation of UGSM from rodent embryos and renal capsule implantation of tissue mixtures to form human prostate epithelium. Such an approach, at its current stage, requires in vivo xenografting of embryonic stem cells; future applications could potentially include in vitro gland formation or the use of induced pluripotent stem cell populations (iPSCs).

To unravel the earliest molecular mechanisms underlying prostate cancer initiation, novel and innovative human model systems and approaches are desperately needed. The potential of pre-prostatic urogenital sinus mesenchyme (UGSM) to induce pluripotent stem cell populations to form human prostate epithelium is a powerful experimental tool in prostate research.

설치류 비뇨 부비동 간엽 및 인간 줄기 세포의 조직 재조합을 사용하여 인간의 전립선 상피의 형성

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Dried Blood Spot Collection of Health Biomarkers to Maximize Participation in Population Studies

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spots meet this need, and can be collected in the field with high response rates. These elements are particularly important in longitudinal study designs including interventions where attrition is critical to avoid, and high response rates improve the interpretation of results. Dried Blood Spot sample collection is simple, quick, relatively painless, less invasive then venipuncture, and requires minimal field storage requirements (i.e.&#160;samples do not need to be immediately frozen and can be stored for a long period of time in a stable freezer environment before assay). The samples can be analyzed for a variety of different analytes, including cholesterol, C-reactive protein, glycosylated hemoglobin, numerous cytokines, and other analytes, as well as provide genetic material. DBS collection is depicted as employed in several recent studies.

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease or health. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spot (DBS) collection meets this need, can be collected in the field with high response rates&#160;and analyzed for a variety of biomarkers.

건강 바이오 마커의 혈액 스팟 컬렉션 인구 연구에의 참여를 극대화하기 위해 건조

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, ...

Absolute Quantification of A&#946;1-42 in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the diagnosis of AD is based on cognitive tests and mental state exams, but the peptide amyloid-beta (A&#946;) in cerebrospinal fluid (CSF) is increasingly used in clinical trials and settings. As for most protein and peptide biomarkers, quantification is performed using antibody-based techniques, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). However, intra- and inter-laboratory variability in these assays hamper its use as a diagnostic marker in clinical routine.
An antibody-independent Reference Measurement Procedure (RMP) was developed based on solid-phase extraction (SPE) and liquid chromatography (LC)-tandem mass spectrometry (MS/MS), where stable, isotope-labeled A&#946; peptides were used as internal standards, enabling absolute quantification. A high-resolution quadrupole-orbitrap hybrid instrument was used for the measurements. The method allows for the quantification of CSF A&#946;1-42 between 150-4,000 pg/mL.

Absolute Quantification of A&amp;#946;&lt;sub&gt;1-42&lt;/sub&gt; in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

A reference measurement procedure for the absolute quantification of A&#946;1-42 in human CSF based on solid-phase extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry is described.

Aβ의 절대 정량<sub&gt; 1-42</sub&gt; CSF의 질량 분석 참조 측정 절차를 사용하여

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Ivacaftor, 그것의 주요 대사 산물, 및 생물 학적 체액의 낭 성 섬유 증 환자에서 Lumacaftor의 임상 샘플의 높은 처리량 분석에 대 한 최적화 된 LC-MS/MS 방법

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

A Chronic Cardiac Ischemia Model in Swine Using an Ameroid Constrictor

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but regardless of the approach, an in vivo model is needed to test each treatment. The pig is one of the most used large animal models for cardiovascular disease. Its heart is very similar in anatomy and function to that of a human. The ameroid placement technique creates an ischemic area of the heart, which has many useful applications in studying myocardial infarction. This model has been used for surgical research, pharmaceutical studies, imaging techniques, and cell therapies.
There are several ways of inducing an ischemic area in the heart. Each has its advantages and disadvantages, but the placement of an ameroid constrictor remains the most widely used technique. The main advantages to using the ameroid are its prevalence in existing research, its availability in various sizes to accommodate the anatomy and size of the vessel to be constricted, the surgery is a relatively simple procedure, and the post-operative monitoring is minimal, since there are no external devices to maintain. This paper provides a detailed overview of the proper technique for the placement of the ameroid constrictor.

The purpose of this protocol is to demonstrate the placement of a delayed constricting device (an ameroid constrictor) around a coronary artery in a swine model. This device creates an ischemic area of the heart that is useful for studying new diagnostic imaging techniques and new methods of treatment.

Ameroid 압축을 사용 하 여 돼지에서 만성 심장 허 혈 모델

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

생체 외에서 혈액-뇌 장벽 돼지 뇌 내 피 세포를 기반으로 하는 모델의 설립에 대 한 방법 개선

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained using laser Doppler flowmetry (LDF). This paper demonstrates a closed skull preparation that allows cerebral blood flow to be assessed without penetrating the skull or installing a chamber or cerebral window. To evaluate autoregulatory mechanisms, a model of controlled blood pressure reduction via graded hemorrhage can be utilized while simultaneously employing LDF. This enables the real time tracking of the relative changes in the blood flow in response to reductions in arterial blood pressure produced by the withdrawal of circulating blood volume. This paradigm is a valuable approach to study cerebral blood flow autoregulation during reductions in arterial blood pressure and, with minor modifications in the protocol, is also valuable as an experimental model of hemorrhagic shock. In addition to evaluating autoregulatory responses, LDF can be used to monitor the cortical blood flow when investigating metabolic, myogenic, endothelial, humoral, or neural mechanisms that regulate cerebral blood flow and the impact of various experimental interventions and pathological conditions on cerebral blood flow.

This article demonstrates the use of laser Doppler flowmetry to evaluate the ability of the cerebral circulation to autoregulate its blood flow during reductions in arterial blood pressure.

레이저 도플러 흐름 측정을 사용하여 쥐에 대뇌 혈액 흐름 자동 조절의 평가

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. Plasma drug levels are the current gold standard assessment, but require phlebotomy and a cold chain, and capture only very recent adherence. Our method uses hair, a matrix that is easily collected and reflective of long-term adherence, to test for 11 anti-TB medications. Previous work by our group shows that antiretroviral drug levels in hair are associated with HIV outcomes. Our method for DR-TB drugs uses 2 mg of hair (3 cm proximal to the root), which is pulverized and extracted in methanol. Samples are analyzed with a single LC-MS/MS method, quantifying 11 drugs in a 16 min run. Lower limits of quantification (LLOQs) for the 11 drugs range from 0.01 ng/mg to 1 ng/mg. Drug presence is confirmed by comparing ratios of two mass spectrometry transitions. Samples are quantified using the area ratio of the drug to the deuterated, 15N-, or 13C-labeled drug isotopologue. We used a calibration curve ranging from 0.001-100 ng/mg. Application of the method to a convenience sample of hair samples collected from DR-TB patients on directly observed therapy (DOT) indicated drug levels in hair within the linear dynamic range of nine of the eleven drugs (isoniazid, pyrazinamide, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimine, bedaquiline, pretomanid). No patient was on prothionamide, and the measured levels for ethionamide were close to its LLOQ (with further work instead examining the suitability of ethionamide&#8217;s metabolite for monitoring exposure). In summary, we describe the development of a multi-analyte panel for DR-TB drugs in hair as a technique for therapeutic drug monitoring during drug-resistant TB treatment.

Current methods of analyzing patients&#8217; adherence to complex drug resistant-tuberculosis (DR-TB) regimens can be inaccurate and resource-intensive. Our method analyzes hair, an easily collected and stored matrix, for concentrations of 11 DR-TB medications. Using LC-MS/MS, we can determine sub-nanogram drug levels that can be utilized to better understand drug adherence.

작은 모발 샘플에서 11가지 약물 내성 결핵 약물 정량화를 위한 LC-MS/MS 패널 검증

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. ...

Human Fetal Blood Flow Quantification with Magnetic Resonance Imaging and Motion Compensation

Magnetic resonance imaging (MRI) is an important tool for the clinical assessment of cardiovascular morphology and heart function. It is also the recognized standard-of-care for blood flow quantification based on phase contrast MRI. While such measurement of blood flow has been possible in adults for decades, methods to extend this capability to fetal blood flow have only recently been developed.
Fetal blood flow quantification in major vessels is important for monitoring fetal pathologies such as congenital heart disease (CHD) and fetal growth restriction (FGR). CHD causes alterations in the cardiac structure and vasculature that change the course of blood in the fetus. In FGR, the path of blood flow is altered through the dilation of shunts such that the oxygenated blood supply to the brain is increased. Blood flow quantification enables assessment of the severity of the fetal pathology, which in turn allows for suitable&#160;in utero&#160;patient management and planning for postnatal care.
The primary challenges of applying phase contrast MRI to the human fetus include small blood vessel size, high fetal heart rate, potential MRI data corruption due to maternal respiration, unpredictable fetal movements, and lack of conventional cardiac gating methods to synchronize data acquisition. Here, we describe recent technical developments from our lab that have enabled the quantification of fetal blood flow using phase contrast MRI, including advances in accelerated imaging, motion compensation, and cardiac gating.

Here we present a protocol for measuring fetal blood flow rapidly with MRI and retrospectively performing motion correction and cardiac gating.