This work is supported by the Joseph Alexander Foundation, the ASBMB Undergraduate Research Award, 2013-2014, and a Science Award Grant, Marymount Manhattan College, 2012-2013.

주 : 행동 클래스 II 바이오 안전성 캐비닛에서 세포와 세포 배양 시약 모든 작업 (BSC) 9. 그들은 생물학적 위험을 완화하기 위해 낮은 자세로 MMT 세포, 바이오 안전성 레벨 I로 분류됩니다. 사용 (예를 들어, 자외선은 70 % 에탄올 닦아) 사이의 BSC에 적절한 세척 및 오염 제거 절차를 적용합니다. 1. MMT 세포를 성장 <ol><li> 영양이 풍부한 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 이글스 최소 필수 중간 (EMEM)로 구성 미디어, 2 mM의 글루타민, 및 1 % 안티 곰팡이 항생제 / 10 ㎖를 함유 10cm 조직 배양 접시에 세포 (10 단위 페니실린 성장 100 μg의 스트렙토 마이신, 0.25 μg의 암포 테리 신 B). 37 ℃, 가습 된 5 % CO 2 챔버에서 세포를 배양. 3.6 × 106 세포 / ㎠의 밀도로 세포를 플레이트 (2 단계에서 세포를 카운팅 참조). </li><li> 매 48 시간이 UNL 신선한 매체와 함께 세포 배양 배지의 절반을 바꾸기ESS는 달리 표시. 역 위상 대비 가벼운 현미경으로 검사에 의해 세포 생존 및 형태를 확인합니다. <ol><li> 참고 100에서 크기, 구조, 모양, 조직 및 추정 번호 세포의 특성 - 200X 확대. 이 농도에서 세포가 하나의 평면에 표시, 서로 꼭대기와 근접 뭉쳐하지. 각 셀이 점에 와서 그것으로부터 확장 가늘고 긴, 분기 형 확장자 두꺼운 구형 코어로 구성된다 (도 1 참조). </li></ol></li><li> 그들은 7.2 × 106 세포 / ㎠의 셀 밀도에 도달하면 세포 세분. 세포를 1.8 × 106 세포 / ㎠ 당 24 시간의 두배 속도를 나타낸다. 그들은 분리 된 횟수를 표시하기 위해 셀들 항로 X (PX)를 지정한다. <ol><li> 3 세대에서 (즉, 세 구절, P3 후), 수확, 계산, 3.6 × 10 (6)의 밀도로 24 잘 조직 배양 접시에 세포를 판 </s&gt; 세포 / ㎠까지. </li></ol></li><li> 보기 세포 매일 기록 디지털 현미경 사진. 참고 및 세포 형태 (즉, 크기, 모양, 빛 반사 특성)를 설명합니다. 정기적으로 세포를 계산하고 세포 수에 경과 시간과 관련하여 세포 배가 시간을 결정합니다. </li></ol> 2. MMT 세포를 계산 참고 : 세포를 계대 배양 할 필요가 있는지 확인하기 위해 세포를 계산, 실험 설정 또는 세포 생존을 결정합니다. 여기에 제시된 두 가지 방법이 있습니다. <ol><li> 혈구의 사용은, 표준 기술은 세포를 계산합니다. <ol><li> 밝은 줄 혈구, 트리 판 블루 염료, 복합 광학 현미경, 멸균 시험관, 피펫과 수동 셀 카운터의 0.2 % 용액을 얻었다. </li><li> BSC에서 10cm 조직 배양 접시에서 세포를 제거하기 위해 10 ML의 피펫을 사용합니다. 세포를 24 웰 플레이트에서 재배하는 경우 용지를 제거하기 위해 1 ML의 피펫 또는 1,000 μL 마이크로 피펫을 사용합니다. </li><li&gt; 피펫으로 세포 미디어를 그리기 접시의 바닥에 대한 피펫의 팁을 배치하고 판에서 피펫 팁을 슬라이딩하면서 미디어를 추방. 셀을 제거하는 데 도움 대단히 짧은 시간을 해리와보다 정확한 세포 수로 이어질 5 회 - 4를 반복합니다. </li><li> 15 ml의 멸균 튜브 (또는 1 ml의 마이크로 원심 분리기 또는 다른 작은 볼륨 관)에서 생성 된 세포 현탁액을 놓습니다. 그렇지 않으면, 원래의 조직 배양 접시에 세포를 남겨 / 웰. </li><li> 비 - 무균 마이크로 원심 분리기 또는 다른 작은 부피 튜브 (1 비율 1) BSC 하에서 트립 판 블루 용액 10 μL와 세포 현탁액 10 μL을 결합한다. 참고 : 트리 판 블루 건강 가능한 세포에 의해 흡수되지 않는 중요한 얼룩입니다. 세포가 손상되거나 죽은, 트리 판 블루가 죽은 세포가 계산 될 수 있도록 셀을 입력 할 수 있습니다 (일명 배제 방법을 염색). 가능한 세포는 색에서 밝은 빛을하는 동안 따라서 현미경, 죽은 세포는 어두운 보라색이 나타납니다. </li><li> 품다5 분 동안 실온에서. </li><li> 혈구에 커버 슬립을 놓습니다. 홈에 트리 판 블루 세포 현탁액 혼합물의 10 μl를 적용합니다. 200X 확대 - (100)에서 혈구를 볼 수 있습니다. 네 모서리의 격자 명백한 (도 2 참조). </li><li> 각각의 그리드 화 지역의 총 세포 대 (흠) 가능한 세포의 수를 계산합니다. 네 그리드 평균 세포 / ml를 얻을 수 1 × 104을 곱한다. <ol><li> 접시 당 셀 (또는 셀 / ㎠)의 총 수 외삽. 3.6 × 106 세포 / ㎠의 원하는 농도로 새로운 조직 배양 판을 시드 또는 플레이트 나 웰의 생존 세포의 총 수를 결정하기 위해 사용하는 세포 현탁액의 정확한 용적을 결정하거나,이 번호를 사용한다. 참고 : 혈구의 사용에 대한 추가 지침은, 10를 참조하십시오. </li></ol></li></ol></li><li> 가능한 세포를 계산하는 소프트웨어와 디지털 카메라를 사용합니다. <ol><li> 디를 얻습니다gital 카메라, 그것의 동반 소프트웨어, 트리 판 블루 염료, 복합 광학 현미경, 멸균 시험관, 피펫과 컴퓨터의 0.4 % 용액. 참고 : 여기에 사용된다 Motic 소프트웨어를 동반 Moticam 2000 디지털 카메라. 모든 비교 카메라와 소프트웨어는 충분합니다. 디지털 카메라 소프트웨어 (제조 업체의 프로토콜에 따라) 사전에 교정되었는지 확인하십시오. </li><li> BSC에서 24 잘 조직 배양 접시에서 성장하는 MMT 세포에서 용지를 제거하기 위해 1 mL를 피펫 또는 1,000 μL 마이크로 피펫을 사용합니다. 부드럽게 한 다음 접시에 소량 않은 보충 (즉, EMEM 어떤 보충없이) 신선한 미디어 (약 500 μL)를 적용을 제거하여 부착 세포를 씻으십시오. 우물에 직접 : 0.2 % 트리 판 블루의 10 μl를 적용 (UN-보충 EMEM으로 1 희석하여 만든). </li><li> 5 분 동안 실온에서 접시를 품어. </li><li> 200X 확대 W - 100의 현미경 판보기i 번째 디지털 카메라가 부착. 2 % 트리 판 블루로 염색하는 것은 너무 어두우면 판을 비추 미디어로 세척 할 수있다. </li><li> 컴퓨터에 소프트웨어를 열고 차 소프트웨어가 설정 탭을 통해 사용 목적에 보정되어 있는지 확인합니다. 시야의 이미지가 나타납니다. </li><li> 측정 탭에서 그리드를 선택합니다. 사각형의 격자는 약 폭 0.005 cm가 나타납니다. 각 사각형의 영역을 확인하는 그리드 정보를 선택합니다. </li><li> 세포를 계산 그리드의 특정 영역을 선택합니다 (즉, 5 제곱 X 9 사각형). 측정 탭에서 사각형을 선택합니다. 사각형의 모서리를 클릭하고 선택의 제곱을 포함하도록 커서를 끕니다. 참고 : 녹색의 그늘 선택과 폭, 높이, 면적을 제공하는 코너에 나타납니다 흰색 상자 및 선택 그리드의 부분의 둘레의 사각형을 다룰 것입니다 (그림 3 참조). </li><li> viab의 수를 계산결정된 지역에서 제작 세포. 현미경으로 접시를 이동하여 동일한 잘 또는 판에 두 개의 다른 위치에 대해 동일한 작업을 수행합니다. </li><li> 측정 영역은 동일하며 배율이 변경되지 않았 음을 확인합니다. 지역 내 생존 세포 수의 평균을 계산한다. 웰의 면적 이용을 그리드에 묘사 영역으로부터 생존 세포의 수를 추정 (24 웰 플레이트를 하나의 웰은 100 mm만큼 면적이 78.6 cm 인 접시 2cm (2)의 면적을 갖는다) 웰 (세포 / cm 2) 내 셀들의 총 수. </li></ol></li></ol> 3. 항 증식 에이전트와 MMT 세포 치료 <ol><li> 선택한 항 증식 치료제 (타목시펜, 커큐민과 메트포르민)와 BSC에서 선택 약물, 아스피린의 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 27 mm의 재고 농도를 생성하기 위해 100 % 에탄올에 커큐민과 타목시펜을 녹인다. unsupplement에서 메트포르민과 아스피린을 녹여ED EMEM은 각각 500 mM의 15 mm의 재고 농도를 생성합니다. </li></ol></li><li> 용량 반응을 설정합니다. <ol><li> 96 시간은 투여 량 반응 곡선을 생성하기위한 다양한 농도에서 세 개의 항 - 증식 치료제 (타목시펜, 커큐민 및 메트포르민) 및 선택적 약물 (아스피린)과 MMT 세포 치료. 처음 게시 된 보고서 1,11-16 기반으로 농도의 범위에서 다음 발표보다 농도가 크거나 작은 모든 약물을 관리 할 수 있습니다. 주 : 투여 량 반응은 원하는 결과를 생성하기 위해 필요한 약물의 최소 농도를 결정한다. 여기서 원하는 결과는 제어에 비해 세포 증식의 감소이다. <ol><li> 타목시펜과 커큐민의 경우, 0.054 mM의 (1 μL), 0.108 mM의 (2 μL), 0.162 mM의 (3 μL)과 0.216 mM의 (4 μL)의 농도 (및 해당 볼륨)를 사용합니다. </li><li> 메트포민, 2 mM의 농도 (및 해당 볼륨) (2 μl를 사용), 4 mM의 (4 μL), 6 mM의 (6 μL), 8 mM의 (8 μL) 및 10 mM의 (10 μL). </li><li> 아스피린의 경우, 0.030 mM의 (1 μL), 0.060 mM의 (2 μL), 0.099 mM의 (3.3 μL), 0.150 mM의 (5 μL), 및 0.216 mM의 (6.7 μL)의 농도 (및 해당 볼륨)를 사용합니다. </li></ol></li><li> 3.6 × 106 세포 / ㎠의 농도로 24 웰 플레이트 상에 10cm 접시에서 MMT 세포 분열. 두 세포 계수 방법 (2 단계)에 의해 초기 세포 농도를 결정한다. 세포의 새로운 24 웰 플레이트 &quot;일 분할&quot;를 호출합니다. </li><li> 24 시간 후 세포 도금 단계 3.2.1에 기재된 농도에서, 항 - 증식 치료제, 타목시펜, 커큐민, 메트포르민 및 아스피린 각각과 MMT 세포 치료. &quot;일 0&quot;으로이 참조하십시오. <ol><li> 각 웰 (500) 미디어의 μL, 사용 가능한 Micropipette 멸균 마이크로 피펫 팁 새로운 팁 새로운 우물 CR을 방지하기 위해 처리 할 때마다 최대 보유 수 있듯이OSS 오염. 존재 100 % 에탄올 (용매 대조군)에서 재배 어떠한 약물 치료 (대조군) 세포의 부재하에 성장 된 세포 두 컨트롤 등의 웰을 사용한다. </li></ol></li><li> 세포 성장 및 세포는 격일 넣으면 기재된 농도로 약물을 다시 투여 96 시간 동안 (단계 1.2 참조) (까지를 4 일) 일 1 일 -. 치료 4, 현미경으로 세포를 관찰하여 카운트 단계 2.2의 방법은 (도 4 참조). </li><li> 실험을 적어도 세 번 반복합니다. </li><li> 실험의 길이에 걸쳐 세포 생존 및 약물 투여 량 사이의 관계를 그래프 화하여 각 약물의 최적 농도를 결정 (도 5 참조). </li></ol></li><li> 시간 코스를 설정합니다. <ol><li> 시간 기간을 변화시키는 고정 농도 세 항 - 증식 치료제 (타목시펜, 커큐민과 메트포민)와 MMT 세포 치료. 최적의 농도 IDENTIF를 사용하여용량 반응 실험을 통해 IED (단계 3.2 참조). <ol><li> 0.216 mM의 타목시펜, 0.216 밀리미터 커큐민 10 밀리미터 메트포르민 : 다음과 같은 농도를 사용합니다. 주 : 약물이 원하는 최적의 결과를 생성하기 위해 타임 코스에 필요한 시간의 양을 결정한다. 여기에서, 원하는 결과는 컨트롤과 비교하여 세포 증식의 감소이다. </li></ol></li><li> 3.6 × 106 세포 / ㎠의 농도로 24 웰 플레이트 상에 10cm 접시에서 MMT 세포 분열. 두 세포 계수 방법 (2 단계)에 의해 초기 세포 농도를 결정한다. 세포의 새로운 24 웰 플레이트 &quot;일 분할&quot;를 호출합니다. </li><li> 24 시간 후 세포 도금, 단계 3.2에서 식별 된 최적 농도에서, 항 - 증식 치료제, 타목시펜, 커큐민, 메트포르민 및 아스피린 각각과 MMT 세포 치료. &quot;일 0&quot;으로이 참조하십시오. <ol><li> 각뿐만 아니라, 우리가 미디어의 500 μL의 최대를 보유 할 수 있습니다멸균 마이크로 피펫 팁과 새로운 팁 새로운 잘가 교차 오염을 방지하기 위해 처리 될 때마다와 전자 마이크로 피펫. </li><li> 존재 100 % 에탄올 (용매 대조군)에서 재배 어떠한 약물 치료 (대조군) 세포의 부재하에 성장 된 세포 두 컨트롤 등의 웰을 사용한다. </li></ol></li></ol></li><li> 세포 성장과 세포가 매일 공급 될 때 선택된 농도로 약물을 다시 관리 (4 일까지) 96 시간 동안 (단계 1.2 참조). 일 1 일 - 처리 4, 현미경으로 세포를 관찰하고 단계 2.2 (도 4 참조) 방법을 사용하여 계산. </li><li> 실험을 적어도 세 번 반복합니다. </li><li> 선택된 농도에서 세포 생존 및 약물 치료의 길이 (시간)의 관계를 그래프 화하여 각 약물 MMT 세포의 최적의 노출 시간을 결정 (도 6 참조). </li></ol> 4. 실험실 모듈 주 : 다음 5 일이며랩 모듈을 포함한다.도 7에 대한 랩 일정 스케줄이 오일 내에 수반 것의 흐름도이다. 이 작업은 5 일 완료되기 위해서는 시간 경과 또는 투여 량 반응 곡선 중 하나가 생성된다. 양방의 커브를 생성 할 수있는 충분한 시간이 아니다. 용량 반응 실험에 대하여 설명한다. 시간 경과 실험을 용이하게 교환 될 수있다 <ol><li> 그룹으로 분할 급 : 한 군은 투여 량 반응 및 제안 된 투여 량 반응 농도의 중간 농도를 선택하는 다른 시간 코스를 설정할 수있다. <ol><li> 적절한 농도에서 충분한 문화와 약물 주식을 유지한다. 다른 설명이없는 한, BSC에서 모든 작업을 수행합니다. </li></ol></li><li> 1 일 <ol><li> 직접 학생들은 미디어를 확인하고 (1 단계에서와 같이) 세포를 성장합니다. </li><li> 학생들은 10cm의 접시에 MMT 세포의 주식을 취득으로, ​​학생들이 세포 배양 배지를 준비하는 지시하고 hemocytome의 사용에 튜토리얼을 제공터, 디지털 현미경 (단계 2에서와 같이) 디지털 카메라 현미경 소프트웨어. </li><li> 지금 제조자의 프로토콜을 사용하여 현미경에서 사용 목적 (예를 들면, 4X, 10X, 20X)에 대한 소프트웨어를 보정. </li></ol></li><li> 2 일 <ol><li> 학생들이 (2 단계로) 총 세포 수 및 세포 생존 능력을 확인하게한다. </li><li> 학생들은 유사한 결과가 얻어진다 확인하기 위하여 현미경 소프트웨어 및 혈구 방법을 모두 사용하여 100mm 접시에 세포를 계산하게한다. </li><li> 다이렉트 학생 (단계 1에서와 같이) 원하는 시작 셀 도금 밀도 24 웰 플레이트에 100mm 접시에서 24 웰 플레이트 및 분할 세포를 얻었다. 이것은 일 분할 간주됩니다. 24 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에서 24 웰 플레이트를 놓습니다. </li></ol></li><li> 3 일 <ol><li> 24 웰 플레이트에 24 시간 동안 MMT 세포를 성장. 학생들은 현미경으로 세포를 관찰하고 (단계 2에서와 같이) 현미경 소프트웨어를 사용하여 계산하게한다. </li><li> 학생 / 테를 줘암 치료 약물 주식의 샘플입니다. 그들이 준비하고 (3 단계)을 원래의 원액을 희석 있습니다. 투여 량 반응 곡선을 확립 그들의 세포에 약물의 다양한 농도를 추가한다. 이 날은 0이라고합니다. </li><li> 48 시간의 최대의 의약품과 세포 (단계 1.2)을 품어. </li></ol></li><li> 4 일 <ol><li> 학생들은 24 시간 이후 처리 된 세포를 관찰하게한다. 이는 1 일입니다. </li><li> 각 웰 사용하여 현미경 소프트웨어를 계산합니다. 각 레코드의 사진 잘되도록 카운팅 (단계 2에서와 같이) 외부 랩 수행 될 수있다. </li><li> 또 다른 24 시간 동안 약물과 세포 (단계 1.2)을 품어. 참고 : 강사 추가 자습서 및 데이터 분석 및 그래픽 표현의 리뷰를 제공합니다. 학생들은 데이터 수집의 다음 날을위한 그림, 그래프, 통계 분석을 만들 수 배웁니다. </li></ol></li><li> 5 일 <ol><li> 48 시간, 2 일 후 세포를 학생들 처리했다. </li><li> 각각의 카운트잘 현미경 소프트웨어를 사용하여. 각 레코드의 사진 잘되도록 카운팅 (단계 2에서와 같이) 외부 랩 수행 될 수있다. </li><li> 수확하고 (단계 2에서와 같이)을 효과적으로 현미경 소프트웨어 방식을 사용하는 학생의 능력을 확인하는 수단으로서 혈구 전통적인 방법에 의해 카운트하는 세포를 모은다. 참고 : 따라서, 데이터를 수집하고 결론을 도출하거나 가설을 조정한다. </li></ol></li></ol>

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S., Mirkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+current+and+emerging+SERMs.">An overview of current and emerging SERMs.</a> J Steroid Biochem Mol Biol. 143C, 207-222 (2014).</li><li>Kaplan, R. M., Satterfield, J. M., Kington, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+better+physician--the+case+for+the+new+MCAT.">Building a better physician--the case for the new MCAT.</a> N Engl J Med. 366 (14), 1265-1268 (2012).</li></ol>

저자는 Motic로부터 금융 또는 유사한 지원을받지.

실험실 모듈은 동물 세포 배양의 고급 기술을 통해 세포 생물학의 다양한 주제를 가르 칠 목적으로 그 표시됩니다. 모듈은 인간 유방암 모델 세포 복제에 대한 항 증식 화학 물질의 수의 효과를 분석함으로써이를 달성한다. 주요 분석은 세포 계수의 기본 기술에 의존하고 현미경 소프트웨어를 사용하여 세포를 계산하는 새로운 방법을 소개합니다. 모듈을 더 포함하는 활동은 악기와 가장 생물학 ...

종종 학부 일반 생물학 과정에서, 세포주기 조절과 암의 주제에 감동하고 있지만이 과정에서 콘텐츠의 폭이 깊이 약간의 시간이 나뭇잎 때문에 자세히 살펴 없습니다. 또한, 학부 생물학 학생들은 일반적으로 동물 세포 배양과 관련된 고급 기술에 노출되지 않습니다. 적용하고 그들이 배운 것을 분석하면서 학생들이 이러한 개념의 깊은 이해를 개발하기 위해, 실험실 활동은 실험실 활동 1을 확장 연구의 월터 리드 육군 연구소 (WRAIR)의 변형으로 개발되었다. 랩 모듈은 비정상적인 세포 신호 전달 경로를 성장 및 암세포 모델을 특성화 개발 및 셀 카운팅 방법을 실행하는, 항 증식 제와 세포를 치료하기위한 최적의 시간 과정 및 투여 량을 설정하고, 식별하는 단계를 포함 단계적 실험 전략을 사용 . 실험은 오픈 가능-ended 질문. 이 작업에 필요한 대부분의 기술은 전형적인 교시 생물학 실험실에서 수행 될 수있다. 활성은 마우스 유방 종양 (MMT) 세포주의 성장 속도 및 형태, 인간 유방암 2 모델을 특성화 학생들 시작한다. 유방암은 때문에 인구의 유병률, 대학 세 학생들의 친숙하고 사용할 수있는 광범위한 데이터 모델 암으로 선택되었다. MMT 세포주는 특별히 잘 특징으로 쉽게 얻을 수 있기 때문에, 선택된 짧은 배가 시간을 갖는 성장이 용이 하였다. 또한, MMT 세포가 에스트로겐 의존성 가장 여성의 유방암과 일치하는이다. 학생들은 그 행동의 메커니즘을 잘 학생들을 가능하게 변화하고있는 약물과 치료의 길이의 established.The 농도 화학 요법 약물로 세포를 처리하여 MMT 세포에서 비정상적인 세포 신호 전달 경로를 식별세포 분열의 속도에 이러한 변수의 효과를 알아보고자 하였다. 이 활동에 대한 키 분석은 단순히 두 가지 방법 중 하나를 사용하여, 세포 계수를 필요 세포 생존의 판정이다. 각 방법은 강력한 현미경 기술에 따라 달라집니다. 학생들은 표준 혈구 방법 및 신규 photomicroscopy 방법을 사용하여 세포 생존을 결정하고 제안한다. 자신의 연구 결과를 바탕으로, 그들은 제안 할 수 및 활동에 수정을 테스트합니다. 학생들은 그들의 데이터를 표현하고 그 가설을 수정하고 새로운 실험 전략을 고안하는 결과를 해석한다. 이 연구소의 활동은 생물 과학 전공 신입생 또는 학년 수준의 학생에 적합합니다. 그것은, 첫 해에 일반 생물학 또는 두 번째 해, 분자 / 세포 생물학 과정을 완료 할 수있는 한 주간의 실험 모듈로 응축된다. 활동의 적절한 완료에 필요한 기술은 C의 배열과 기본 산술 및 대수, 익숙 포함광석 실험실 기술 (예를 들면, 피펫, 솔루션 제작, 멸균 기술) 세포 배양 및 스프레드 시트 소프트웨어의 강사에 대한 지식과 함께, 데이터 분석, 기본 광학 현미경 및 시간 관리,. 필요한 시약 (예, 마우스 유방 종양 세포, MMT 2), 화학 요법 제를 암 동물 세포주 모델을 포함한다 (예를 들어, 타목시펜, 커큐민, 메트포르민, 아스피린), 트립 판 블루 및 세포 배양 배지 (예, 이글 최소 필수 중간 ; 적절한 보조제 (예를 들면, 도너 말 및 소 태아 혈청)와 EMEM). (; 클래스 II BSC), 혈구, 디지털 현미경 소프트웨어를 필요 인스트루먼트는 역 광 디지털 카메라 부착, 컴퓨터, 100mm 24 잘 조직 배양 플레이트, CO 2 배양기 (또는 동급), 바이오 안전성 캐비닛 현미경을 포함한다. TEAC하는 동물 세포 배양에 의존하는 특정 실험실 활동의 좋은 사례가있다세포 생물학 3의 개념에 대한 H 학부 학생. 그러나 많은 사람들이 (예, 방사성 동위 원소, 라이브 동물 조직, 첨단 영상 장비 1,4,5가), (400 레벨 코스 6에 적합, 예를 들어) 상당히 진보 프로토콜을 설명 쉽게 접근 할 수없는 공급 또는 기술을 필요로하거나, 멀티 주 학기 긴 프로젝트 6, 7을 필요로한다. 여기에 설명 된 실험 활동 간단하고 일반적인 실험실 장비 단일 주에 수행 될 수있다. 요약하면,이 실험 모듈 효과적으로 도입 또는 기본 및 고급 실험실 기술, 실험 데이터 분석, 동물 세포 배양 방법 및 과학적 프로세스를 가르치는 동안 세포주기, 세포 신호 전달 경로와 암의 개념을 강화한다. 실험실 모듈은 간단하고 경제적으로 액세스 할 수 있으며 개방형 질문에 대한 유연성과 기회를 모두 제공합니다. 활동은 학생들의 창의력을 장려조리법 가이드로하지만 역할을하는 템플릿 실험 전략을 제공함으로써. 그것은 기억 필요로 가장 중요한 활동 만족 개화 분류 8의 모든 학습 영역은, 이해, 적용, 분석은 평가하고 교과서에서 과학 연구의 세계로 끌어 과정에서 학생들의 결합에 의해 생성.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>ESCO Labculture Reliant</td>
			<td></td>
			<td>Class II Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterjactor CO2 Incubator</td>
			<td>CEDCO</td>
			<td>Model 1510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-line Hemocytometer</td>
			<td>American Optical</td>
			<td></td>
			<td>with two separate grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motic Images Plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mac OSX Verison 2.0 or higher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipetman</td>
			<td>Rainin instrument co. inc</td>
			<td></td>
			<td>P-20D, P-200D, P-1000D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK30/CK40 Culture Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>4 objective inverted light microscope with camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL Pipet tips</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>40200C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 uL Pipet tips</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AVR4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Seriological Pipets</td>
			<td>TPP</td>
			<td>TP94010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>CoStar- Tissue Culture Cluster</td>
			<td align="right">3524</td>
			<td>24 wells, 16 mm well diameter, Radiation sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td>100 mL, cell culture tested non-haz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-line Hemacytometer replacement coverslip, non-haz</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z375357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Mammary Tumor(MMT) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meformin Hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHR1084</td>
			<td>500 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>white or white-yellow powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curmumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1386</td>
			<td>yellow-orange powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2093</td>
			<td>meets USP testing specifications</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using mouse mammary tumor cells to teach core biology concepts: a simple lab module

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in preparation for biomedical, graduate and professional programs or careers in science. To address this, a simple laboratory module was devised to teach the concepts of cell division, cellular communication and cancer through the application of animal cell culture techniques. Here the mouse mammary tumor (MMT) cell line is used to model for breast cancer. Students learn to grow and characterize these animal cells in culture and test the effects of traditional and non-traditional chemotherapy agents on cell proliferation. Specifically, students determine the optimal cell concentration for plating and growing cells, learn how to prepare and dilute drug solutions, identify the best dosage and treatment time course of the antiproliferative agents, and ascertain the rate of cell death in response to various treatments. The module employs both a standard cell counting technique using a hemocytometer and a novel cell counting method using microscopy software. The experimental procedure lends to open-ended inquiry as students can modify critical steps of the protocol, including testing homeopathic agents and over-the-counter drugs. In short, this lab module requires students to use the scientific process to apply their knowledge of the cell cycle, cellular signaling pathways, cancer and modes of treatment, all while developing an array of laboratory skills including cell culture and analysis of experimental data not routinely taught in the undergraduate classroom.

MMT 세포 성장 및 계수를 비교하는 방법. 마우스 유방 종양 세포가 성공적으로 (도 1)과 Motic 소프트웨어, 현미경 용 디지털 카메라 관련된 소프트웨어 프로그램을 사용하여 개발 된 신규 한 셀 카운팅 방법을 특징으로 성장 하였다. 이 새로운 셀 카운팅 방법은 혈구 (도 2)을 이용하는 전통적인 계산 방법에 비교하고, 세포 수 (표 1)을</strong...

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Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Biology Concepts | Biology | Video

Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Core Biology Concepts: A Simple Lab Module

A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.

핵심 생물학 개념을 가르치는 마우스 유방 종양 세포를 사용 : 간단한 랩 모듈

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in ...

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12.8K 조회수.  Marymount Manhattan College. A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.

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Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method relies on the highly specific interaction between peptide loaded MHC and the corresponding T-cell receptor.  While the affinity of a single MHC/peptide molecule is low, cross-linking MHC/peptide complexes with streptavidin increases the avidity of the interaction, enabling their use as staining reagents.  Because of the relatively low frequencies of CD4+ T cells (~1 in 300,000 for a single specificity) this assay utilizes an in vitro amplification step to increase its threshold of detection.  Mononuclear cells are purified from peripheral blood by Ficoll underlay.  CD4+ cells are then separated by negative selection using biotinylated antibody cocktail and anti-biotin labeled magnetic beads.  Using adherent cells from the CD4- cell fraction as antigen presenting cells, CD4+ T cells are expanded in media by adding an antigenic peptide and IL-2.  The expanded cells are stained with the corresponding class II tetramer by incubating at 37 C for one hour and subsequently stained using surface antibodies such as anti-CD4, anti-CD3, and anti-CD25.  After labeling, the cells can be directly analyzed by flow cytometry.  The tetramer positive cells typically form a distinct population among the expanded CD4+ cells.  Tetramer positive cells are usually CD25+ and often CD4 high.  Because the level of background tetramer staining can vary, positive staining results should always be compared to the staining of the same cells with an irrelevant tetramer.  Multiple variations of this basic assay are possible.  Tetramer positive cells may be sorted for further phenotypic analysis, inclusion in ELISPOT or proliferation assays, or other secondary assays.  Several groups have also demonstrated co-staining using tetramers and either anti-cytokine or anti-FoxP3 antibodies.  

This procedure demonstrates the purification and in vitro expansion of antigen specific CD4+ T cells from whole peripheral blood and their visualization using MHC class II tetramers. Tetramers permit the direct visualization of T cells with a single antigen specificity and defined MHC class II restriction.

머릿속 항원 특정 CD4 + MHC 클래스 II Tetramers를 사용하여 T 세포

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

연구

생물학

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

마우스 내유 상피 세포는 Lactogenic 차별 동안 Mammospheres를 형성

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

내유 상피 이식 절차

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.

일차 종양에서 면역 세포의 분리

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

마우스 유선 화 된 약물 전달을위한 췌관 주입

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

야마나카 인자의 과발현에 의해 능성에 성인 체세포 세포의 생체 내 재 프로그램

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebrafish의에서 콩팥 세포 독소 미세 주입은 급성 신장 손상을 모델링하기

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and biomedical sciences. This easy to follow protocol was developed for first year undergraduate pharmacy students and provides an entry-level introduction to enzyme reactions and analytical procedures for enzyme analysis. The enzyme of choice is lactase, as this represents an example of a commercially available enzyme relevant to human disease/pharmaceutical practice. Lactase is extracted from dietary supplement tablets, and assessed using a colorimetric assay based upon hydrolysis of an artificial substrate for lactase (ortho-nitrophenol-beta-D-galactopyranoside, ONPG). Release of ortho-nitrophenol following the hydrolytic cleavage of ONPG by lactase is measured by a change in absorbance at 420 nm, and the effect of the temperature on the enzymatic reaction is evaluated by carrying out the reaction on ice, at room temperature and at 37 &#176;C. More advanced analysis can be implemented using this protocol by assessing the enzyme activity under different conditions and using different reagents.

The enzymatic activity of lactase is essential for the catabolic processing of the disaccharide lactose. Here, the activity of lactase found in dietary supplements is assayed using a colorimetric assay. This provides students with an experimental platform for understanding the activity of lactase and enzyme kinetics.

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...