본 프로토콜, 체외 침입 분석은, 단백질이 풍부한 매트릭스를 통해 이동하고 다공성 막을 통과하는 세포 라인 능력을 정량적으로 측정하는 유용한 도구이며, 암세포 침입의 초기 단계와 유사한 과정이다. 이러한 세포주는 유전자를 과도하게 표현하거나 유전자가 세포 이동 또는 세포 침입에 중요한 역할을 하는지 결정하기 위해 유전자의 발현을 감소시키기 위해 유전적으로 변경될 수 있다. 많은 공격적인 암은 증가한 이주 및 침략을 포함하여 세포 행동에 있는 극적인 변경을 관련시킵니다.
그래서 이 체외 침입 분석은 우리가 이 과정에 관련있는 유전자 및 그밖 요인을 더 잘 이해하는 것을 허용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하기 위하여는, 실험의 1일 동안 70%에서 90%의 컨런트가 될 때까지 37°C에서 T25 플라스크에서 부착마우스 유방 종양 세포를 5%의 이산화탄소와 100% 습도로 성장시다. 보관에서 보이든 챔버 인서트를 검색하고 20 분 동안 실온으로 따뜻하게 세포 배양 후드로 옮기.
세 번의 인서트를 사용하여 각 실험에 대해 각 셀라인에 대해 통계적으로 유효한 데이터를 생성합니다. 그런 다음 전동된 세럼이 없는 DMEM 매체의 500마이크로리터를 삽입에 추가하여 다공성 멤브레인과 젤이 양쪽에 수분을 공급합니다. 37도에서 이산화탄소 5%, 습도 100%로 최소 2시간 동안 배양합니다.
그 후, 성장 매체를 제거하고 HBSS의 5밀리리터로 세포를 헹구어 세포를 준비한다. HBSS를 제거하고 0.25%의 트립신 EDTA 솔루션1밀리리터를 추가합니다. 섭씨 37도에서 1~5분 동안 또는 세포가 둥글게 나타나거나 분리의 징후를 보일 때까지 배양합니다.
그런 다음 플라스크를 부드럽게 눌러 모든 셀을 분리합니다. 10%의 FBS로 DMEM의 5밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. 그리고 세포 현탁액을 멸균 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 이송한다.
세포를 원심 분리하고 세포를 부드럽게 펠릿하는 5 분 동안 1000 배 g. 미디어를 제거하고 세럼이없는 DMEM의 5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 총 세개의 세차재에 대해 원심분리 및 다시 일시 중단 프로세스를 두 번 추가로 반복합니다.
그 후, 혈청이 없는 DMEM의 마지막 5밀리리터에서 세포를 철저히 다시 중단하고 세포의 덩어리가 없는지 확인합니다. 혈종계를 사용하여 셀 농도를 결정하여 실행 가능한 세포만 계산합니다. 그리고 혈청없는 DMEM의 5 밀리리터에서 밀리리터 당 50, 000 세포로 세포 현탁액을 희석시.
다음으로 인큐베이터에서 인서트가 있는 접시를 제거하고 삽입물에서 미디어를 부드럽게 흡인합니다. 인서트를 들어 올리고 우물에서 미디어를 흡인시합니다. 신속하게 작업하면 화학 요법을 하부 챔버에 추가하십시오.
인서트를 우물에 넣고 24개의 웰 디쉬의 경우 셀 서스펜션 500마이크로리터를 삽입에 넣습니다. 멤브레인의 양쪽에 기포가 없는지 확인하십시오. 22 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 반환합니다.
22시간 후, 고정을 위해 1%의 파라포름알데히드와 1개의 X PBS의 솔루션을 준비합니다. 깨끗한 24 개의 잘 세포 배양 접시에 고정의 밀리리터를 개별 우물에 추가하여 각 삽입에 대해 잘 합니다. 그런 다음, 10%에탄올로 PBS용액으로 0.1%의 크리스탈 바이올렛의 염색 용액을 준비한다.
이 염색 용액1밀리리터를 각 인서트로 깨끗하게 잘 할 수 있습니다. 집게를 사용하여 각 삽입을 한 번에 하나씩 제거합니다. 멸균 면봉을 각 인서트 내부에 놓고 멤브레인의 상부를 면봉하여 마이그레이션되지 않은 세포를 제거합니다.
두 번째 면봉으로 이 과정을 반복하십시오. 다음으로, 삽입 의 내부에서 남은 매체를 제거하고 분리 된 세포를 씻어 PBS의 750 마이크로 리터를 추가합니다. PBS를 제거하고 신선한 PBS로 세척을 반복합니다.
그런 다음 멤브레인의 밑면에 이동된 세포를 고정하기 위해 고정을 포함하는 우물에 삽입을 배치합니다. 모든 인서트에 대해 이 프로세스를 반복하고 인서트가 실온에서 15분 동안 수정하도록 합니다. 그런 다음 각 삽입을 우물에서 한 번에 하나씩 제거하고 PBS 750 마이크로리터로 세척합니다.
인서트를 염색 용액을 잘 넣고 15분 동안 그대로 두어 마이그레이션된 모든 셀과 고정된 셀을 얼룩지게 합니다. 그런 다음 인서트를 제거하고 삽입물에서 흐르는 물이 맑을 때까지 증류수를 포함하는 비커에 담급드세요. 여분의 물방울을 제거하고 삽입물을 필터 용지 에 옆으로 놓습니다.
인서트가 공기를 건조하게 합니다. 각 삽입에 대해 깨끗한 유리 현미경 슬라이드에 라벨을 부착하고 각 슬라이드의 중앙에 작은 현미경 침지 오일을 배치하여 이미징을위한 멤브레인을 준비합니다. 메스를 사용하여 플라스틱 인서트 내부의 멤브레인 둘레를 잘라 멤브레인을 분리합니다.
집게를 사용하여 멤브레인을 제거하고 라벨이 부착된 슬라이드의 오일 드롭 위에 놓습니다. 복합 현미경을 사용하여 세포를 5배, 10배 또는 20배 배율로 봅니다. 정량화의 경우 여러 개의 겹치지 않는 이미지를 10배 배율로 가져 가라.
모든 샘플에 대해 영역당 침입 셀 또는 셀의 총 수를 결정합니다. 각 실험에 대해 세 개의 복제 인서트와 함께 분석에서 각 조건을 수행하고 통계적으로 유용한 결과를 위해 여러 번 반복합니다. 이 연구에서는, 단백질 매트릭스를 통한 체외 침입은 아연 핑거 단백질, Zc3h8의 변경된 발현을 가진 마우스 유방 종양 세포의 종양 발생 세포 거동에서 공격적인 표현형을 평가하는 데 사용된다.
Zc3h8 발현의 상부는 종양 세포주 또는 플라스미드로부터 발기인 중재발현에 의해 볼 수 있으며, 세포 증식, 빠른 이동, 3D 환경에서의 성장 및 체외 침입 분석 내의 증가된 침범의 결과로 생긴다. 반대로, shRNA 구조에 의한 발현감소는 덜 공격적인 확산, 이주 및 침입을 초래합니다. Zc3h8 표현의 shRNA 넉다운시 세포 침공이 감소하지만, 그 침략은 표현이 구출될 때 구출됩니다.
체외 침입 분석 기술은 세포 행동을 연구하는 신속하고 저렴하며 유연하며 비교적 쉬운 접근 방식이기 때문에 매우 유용합니다. 배양에서 자란 세포는 유전적으로 조작하기 쉽습니다. 그(것)들은 또한 특정 돌연변이를 위해 시험될 수 있습니다.
체외 침입 시스템은 또한 세포 이동 및 침략에 그들의 효력을 위해 마이크로 RNA 같이 작은 분자 억제제 뿐만 아니라 생물학 에이전트의 분석을 허용합니다. 이 분석은 또한 매트릭스, 모공 크기 및 화학 요법의 단백질 함량의 변경을 허용하는 유연성의 큰 양을 포함한다.
