This work is supported by the Joseph Alexander Foundation, the ASBMB Undergraduate Research Award, 2013-2014, and a Science Award Grant, Marymount Manhattan College, 2012-2013.

Notas: Conduta todo o trabalho com células e reagentes de cultura de células em uma cabine de segurança biológica Classe II (BSC) 9. Células MMT são classificados como Nível de Biossegurança eu, como eles representam baixo risco biológico a moderada. Aplicar os procedimentos de limpeza e descontaminação adequados para o BSC entre os usos (por exemplo, luz ultravioleta, 70% de etanol limpar). 1. Cultivar células MMT <ol><li> Cultivar células em placas de 10 cm de cultura de tecidos contendo 10 ml de meio nutriente rico que consiste em Eagles Minimum Essential Médium (EMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), glutamina 2 mM e 1% antimicótica / antibiótica (10 unidades de penicilina , 100 ug de estreptomicina, 0,25 mg de anfotericina B). Cultivar as células numa atmosfera humidificada com 5% de CO 2 da câmara, a 37 ° C. As células em placas a uma densidade de 3,6 x 10 6 células / cm2 (ver contagem de células no passo 2). </li><li> Substituir metade do meio de cultura celular por meio fresco a cada 48 horas UNLess indicado de outra forma. Verificar a viabilidade celular e morfologia, através de exame com uma fase invertida luz contraste microscópio. <ol><li> Nota e caracterizar células para o tamanho, estrutura, forma, organização e número estimado sob a 100 - aumento de 200x. Neste densidade, as células devem aparecer em um plano, não aglutinadas em cima uns dos outros e em estreita proximidade. Cada célula é composta por um núcleo de espessura, esférica, com, extensões ramo-like longas e finas em expansão a partir dele que chegar a um ponto (veja a Figura 1). </li></ol></li><li> Subdivide células quando atingem uma densidade celular de 7,2 x 10 6 células / cm2. As células exibem uma taxa de duplicação de 1,8 x 10 6 células / cm 2 por 24 horas. Designar células Passage X (Px) a identificar o número de vezes que eles foram divididas. <ol><li> Na geração de 3 (isto é, depois de três passagens, P3), colheita, contagem, e a placa para as células de uma placa de cultura de tecido de 24 poços a uma densidade de 3,6 x 10 6 </sup&gt; células / cm 2. </li></ol></li><li> Veja as células a cada dia e fotomicrografias digitais recordes. Nota e descrever a morfologia das células (isto é, tamanho, forma, luz propriedades reflexivas). Determinar tempo de duplicação celular por contagem de células regularmente e relacionando o tempo decorrido para o número de células. </li></ol> 2. Contagem de Células MMT Nota: Contagem de células para determinar se as células precisam ser repicadas, para configurar para um experimento ou para determinar a viabilidade celular. Existem dois métodos aqui apresentados. <ol><li> A utilização de um hemocitómetro, uma técnica padrão de contagem de células. <ol><li> Obter um hemocitômetro brilhante-line, uma solução 0,2% de corante azul de tripano, um composto microscópio de luz, tubos de ensaio estéreis, pipetas e um contador de células manual. </li><li> Sob o BSC, utilizar uma pipeta de 10 mL para remover as células a partir de uma cultura de tecidos de 10 centímetros prato. Se as células são cultivadas numa placa de 24 poços utilizar uma pipeta de 1 ml ou 1000 micropipeta ul para remover os meios de comunicação. </li><li&gt; Desenhar meio celular para a pipeta, colocar a ponta da pipeta contra o fundo do prato e expelir os meios de deslizamento, enquanto a ponta da pipeta ao longo da placa. Repita 4-5 vezes para ajudar a desalojar as células, dissociar aglomerados e conduzir a uma contagem de células mais precisa. </li><li> Coloque a suspensão de células, resultando em um tubo de 15 ml estéril (ou 1 ml de centrífuga de micro ou outro tubo pequeno volume). Caso contrário, deixa as células em placa de cultura de tecido original / poço. </li><li> Sob o BSC, combinar 10 ul da suspensão celular com 10 ul da solução de azul de tripano (proporção 1: 1) numa micro centrífuga não-estéril ou outro tubo de pequeno volume. Nota: azul de tripano é um corante vital que não é absorvida por células viáveis ​​saudáveis. Quando as células são danificadas ou, azul tripano mortos podem entrar na célula permitindo que as células mortas, para ser contado (aka tingir método de exclusão). Por isso sob um microscópio, células mortas aparecem roxo escuro, enquanto as células viáveis ​​são um brilhante e de cor clara. </li><li> Incubarà TA durante 5 min. </li><li> Coloque a tampa de deslizamento no hemocitômetro. Aplicar 10 ul da mistura de tripano azul suspensão de células para dentro da ranhura. Ver o hemocitï¿½etro a 100 - 200X ampliação. Uma grade dos quatro cantos é aparente (ver Figura 2). </li><li> Contar o número de células viáveis ​​(não coradas) versus o número total de células em cada superfície reticulada. Calcular a média dos quatro grelhas e multiplicar por 1 x 10 4 para obter células / ml. <ol><li> Extrapolar o número total de células por placa (ou células / cm2). Use este número para determinar tanto o volume correcto da suspensão de células a ser usada para semear uma nova placa de cultura de tecidos a uma densidade desejada de 3,6 x 10 6 células / cm 2 ou a determinar o número total de células viáveis ​​na placa ou no poço. Nota: Para informações adicionais sobre o uso de um hemocitômetro, consulte 10. </li></ol></li></ol></li><li> Use software e uma câmera digital para contar células viáveis. <ol><li> Obter um digital de câmara, que acompanha o seu software, uma solução de 0,4% de corante azul de tripano, um composto microscópio de luz, tubos de ensaio estéreis, pipetas e um computador. Nota: Uma câmera digital Moticam 2000 com acompanhamento Motic Software é empregado aqui. Qualquer câmera e software comparável deve ser suficiente. Certifique-se de que o software da câmera digital foi calibrado com antecedência (de acordo com o protocolo do fabricante). </li><li> Sob o BSC, use uma pipeta de 1 ml ou 1.000 ul micropipeta para remover a mídia a partir das células MMT que crescem em um 24 bem prato de cultura de tecidos. Lave as células aderentes, aplicando suavemente uma pequena quantidade (aproximadamente 500 ul) de suplementado-un (isto é, sem quaisquer suplementos de EMEM) meio fresco para a placa, em seguida, removê-lo. Aplicar 10 ul de 0,2% de azul de tripano (preparada por diluição 1: 1, com un-EMEM suplementado) directamente para o poço. </li><li> Incubar a placa a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Veja a placa sob o microscópio em 100 - 200X ampliação wom uma câmera digital ligada. Placa pode ser lavado com mídia não suplementadas se coloração com 2% de azul de tripano está muito escura. </li><li> Abra o software no computador de um nd verificar se o software está calibrado para o objectivo usado através do separador de definições. Uma imagem do FOV deve aparecer. </li><li> Selecione a grade da guia Medida. Uma grade de quadrados com cerca de 0,005 centímetros de largura aparece. Selecione Grade Informações para confirmar a área de cada quadrado. </li><li> Escolha uma área específica da grelha para contar as células (ou seja, 5 quadrados x 9 quadrados). Selecione Retângulo na guia Medida. Clique no canto de um quadrado e arrastar o cursor para abranger as praças de escolha. Nota: Um tom de verde vai cobrir as praças de escolha e uma caixa branca aparece no canto que fornece a largura, altura, área e perímetro da seção do grid escolhido (veja a Figura 3). </li><li> Contar o número de VIABle células dentro da área determinada. Faça o mesmo para dois outros locais no mesmo poço ou placa, movendo a placa sob o microscópio. </li><li> Certifique-se de que a área de medição é a mesma e a ampliação não mudou. Calcula-se a média do número de células viáveis ​​no âmbito da área. Utilizando a área do poço (para uma placa de 24 poços, um poço tem uma área de 2 cm 2, para um prato de 100 mm, a área é 78,6 centímetros 2), extrapolar o número de células viáveis ​​a partir da zona delimitada na grade para o número total de células no interior do poço (células / cm2). </li></ol></li></ol> 3. tratar células MMT com agentes anti-proliferativa <ol><li> Prepare soluções dos agentes seleccionados anti-proliferativas terapêuticos (tamoxifeno, curcumina e metformina) e droga opcional, aspirina sob o BSC. <ol><li> Dissolver curcumina e tamoxifeno em 100% de etanol para gerar uma concentração estoque de 27 mM. Dissolver metformina e aspirina em unsupplemented EMEM para gerar uma concentração de estoque de 500 mM e 15 mM, respectivamente. </li></ol></li><li> Estabelecer uma resposta à dose. <ol><li> Tratar as células MMT com os três agentes anti-proliferativos terapêuticos (tamoxifeno, curcumina e metformina) e opcional droga (aspirina) em várias concentrações durante 96 horas para gerar uma curva de resposta à dose. Inicialmente, todos os fármacos em administrar uma gama de concentrações com base em relatórios publicados 1,11-16 e, em seguida, em concentrações maiores ou menores do que os publicados. Nota: Uma resposta à dose determina a concentração mínima de uma droga necessária para produzir os resultados desejados. Aqui, o resultado desejado é uma diminuição na proliferação celular em comparação com o controlo. <ol><li> Para tamoxifeno e curcumina, usar concentrações (e correspondentes volumes) de 0,054 mm (1 ul), 0,108 mM (2 mL), 0,162 mM de (3 mL) e 0,216 mm (4 ul). </li><li> Para metformina, usar concentrações (e correspondentes volumes de 2 mM) (2 ul), 4 mM (4 ul), 6 mM (6 ul), 8 mM (8 uL) e 10 mM (10 ul). </li><li> Para a aspirina, usar concentrações (e correspondentes volumes) de 0,030 mm (1 ul), 0,060 mM (2 mL), 0,099 mM (3,3 mL), 0,150 mM (5 mL), e 0,216 mM (6,7 mL). </li></ol></li><li> Dividir células MMT da placa de 10 cm para uma placa de 24 poços a uma concentração de 3,6 x 10 6 células / cm2. Determine a concentração celular inicial por ambos os métodos de contagem de células-(etapa 2). Chame esta nova placa de 24 poços de células &quot;Dia Dividir&quot;. </li><li> 24 horas após o plaqueamento de células, as células MMT tratar com cada um dos agentes terapêuticos anti-proliferativos, o tamoxifeno, a curcumina, a metformina e a aspirina, nas concentrações descritas no Passo 3.2.1. Referem a isso como &quot;Dia 0&quot;. <ol><li> Como cada poço pode conter um máximo de 500 mL de mídia, use micropipetas com pontas de micropipeta estéril e uma nova dica cada vez que um novo poço é tratado para evitar cross contaminação. Usar dois poços como controlos: células cultivadas na ausência de qualquer tratamento medicamentoso (controlo negativo) e células cultivadas na presença de etanol a 100% (controlo de solvente). </li></ol></li><li> Cultivar células e re-administrar drogas nas concentrações descritas quando as células são alimentadas a cada dois dias (ver Passo 1.2), durante 96 horas (até o dia 4) nos dias 1 -. 4 de tratamento, observação das células ao microscópio e contagem usando o método descrito no Passo 2.2 (ver Figura 4). </li><li> Repita a experiência pelo menos três vezes. </li><li> Determinar a concentração óptima de cada droga representando graficamente a relação entre a viabilidade celular e a dosagem da droga ao longo do comprimento da experiência (ver Figura 5). </li></ol></li><li> Estabelecer um curso de tempo. <ol><li> Tratar as células MMT com os três agentes terapêuticos anti-proliferativos (tamoxifeno, curcumina e metformina) a uma concentração fixa de diferentes intervalos de tempo. Utilizar a identif concentração óptimaIED através das experiências de resposta à dose (ver Passo 3.2). <ol><li> Use as seguintes concentrações: tamoxifeno mM 0,216, 0,216 curcumina mM e 10 mM de metformina. Nota: Um curso de tempo determina a quantidade de tempo necessária para um medicamento para produzir o seu melhor resultado desejado. Aqui, o resultado desejado é uma diminuição na proliferação celular em comparação com o controlo. </li></ol></li><li> Dividir células MMT da placa de 10 cm para uma placa de 24 poços a uma concentração de 3,6 x 10 6 células / cm2. Determine a concentração celular inicial por ambos os métodos de contagem de células-(etapa 2). Chame esta nova placa de 24 poços de células &quot;Dia Dividir&quot;. </li><li> 24 horas após o plaqueamento de células, as células MMT tratar com cada um dos agentes terapêuticos anti-proliferativos, o tamoxifeno, a curcumina, a metformina e a aspirina, nas concentrações óptimas identificadas na etapa 3.2. Referem a isso como &quot;Dia 0&quot;. <ol><li> Como cada poço pode conter um máximo de 500 mL de mídia, nóse micropipetas com pontas de micropipeta estéril e uma nova dica cada vez que um novo poço é tratado para evitar a contaminação cruzada. </li><li> Usar dois poços como controlos: células cultivadas na ausência de qualquer tratamento medicamentoso (controlo negativo) e células cultivadas na presença de etanol a 100% (controlo de solvente). </li></ol></li></ol></li><li> Cultivar células e re-administrar medicamentos, na concentração escolhida quando as células são alimentadas a cada dois dias (ver Passo 1.2), durante 96 horas (até o dia 4). Nos Dias 1-4 do tratamento, observação das células ao microscópio e contar usando o método descrito no Passo 2.2 (ver Figura 4). </li><li> Repita a experiência pelo menos três vezes. </li><li> Determine o tempo de exposição óptimo das células MMT para cada droga representando graficamente a relação entre a viabilidade celular e duração (tempo) de tratamento de droga na concentração seleccionada (ver Figura 6). </li></ol> 4. O módulo de laboratório Nota: A seguinte é uma 5-diacronograma laboratório para laboratório módulo. A Figura 7 é um diagrama de fluxo do que o calendário implicaria dentro dos 5 dias. Para esta actividade deve ser completado em cinco dias ou um curso de tempo, ou uma curva de resposta à dose é gerado. Não há tempo suficiente para gerar ambas as curvas. A experiência de resposta à dose é descrito abaixo. A experiência ao longo do tempo pode ser facilmente intercambiáveis <ol><li> Dividir a classe em grupos: um grupo ter estabelecer uma resposta à dose e o outro um campo de tempo escolhendo uma concentração no meio de as concentrações de resposta à dose propostos. <ol><li> Manter culturas suficientes e estoques de drogas em concentrações adequadas. Salvo disposição em contrário, realizar todo o trabalho sob o BSC. </li></ol></li><li> Dia 1 <ol><li> Os estudantes devem fazer mídia e cultivar células (como no passo 1). </li><li> Como estudantes obter um stock de células MMT em uma placa de 10 cm dirigir os estudantes para preparar meios de cultura de células e dar um tutorial no uso do hemocytomeTer, microscopia digital e software de microscopia câmara digital (como no passo 2). </li><li> Calibrar o software para os objectivos utilizados no microscópio (por exemplo, 4X, 10X, 20X) agora usando o protocolo do fabricante. </li></ol></li><li> Dia 2 <ol><li> Já estudantes confirmar o número total de células e a viabilidade das células (tal como no passo 2). </li><li> Já estudantes contar as células na placa de 100 mm, utilizando tanto o software de microscopia e os métodos hemocitómetro, para confirmar se obtêm resultados semelhantes. </li><li> Alunos para obter uma placa 24 e de divisão de células assim a placa de 100 mm, para as placas de 24 poços à densidade de revestimento a partir de células desejado (como na etapa 1). Este é considerado o Dia Split. Coloque a placa de 24 poços numa incubadora de cultura de células durante 24 horas. </li></ol></li><li> Dia 3 <ol><li> Cultivar células MMT durante 24 horas sobre uma placa de 24 poços. Peça aos alunos observar células ao microscópio e contagem usando software microscopia (como no passo 2). </li><li> Dê o aluno / tesou amostras de stocks de medicamentos de tratamento do câncer. Peça-lhes para preparar e diluir a solução estoque inicial (como no passo 3). Adicionar as diversas concentrações das drogas às suas células para estabelecer uma curva de resposta à dose. Isto é chamado Dia 0. </li><li> Incubar as células (passo 1.2), com os medicamentos para o máximo de 48 horas. </li></ol></li><li> Dia 4 <ol><li> Peça aos alunos observar células tratadas após 24 horas. Este é o Dia 1. </li><li> Conte cada software microscopia bem usando. Fotografias da ficha de modo a que cada poço de contagem pode ser realizada fora do laboratório (como no passo 2). </li><li> Incubar as células (passo 1.2), com as drogas durante mais 24 horas. Nota: Instrutor fornece tutoriais e comentários de análise de dados e apresentação gráfica adicionais. Os alunos aprendem a criar figuras, gráficos e análise estatística para o dia seguinte de coleta de dados. </li></ol></li><li> Dia 5 <ol><li> Peça aos alunos que trataram células após 48 horas, do dia 2. </li><li> Conte cadabem usando microscopia de software. Fotografias da ficha de modo a que cada poço de contagem pode ser realizada fora do laboratório (como no passo 2). </li><li> Colheita e recolher células para contagem de hemocitómetro pelo método tradicional como um meio de verificar a capacidade do estudante para utilizar eficazmente o método de software microscopia (como no passo 2). Nota: Recolha de dados e tirar conclusões ou revisar hipóteses, em conformidade. </li></ol></li></ol>

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Os autores não receberam qualquer apoio financeiro ou comparável de Motic.

Um módulo de laboratório é apresentado que tem como objetivo ensinar uma variedade de tópicos em biologia celular através das avançadas técnicas de cultura de células animais. O módulo realiza esta análise dos efeitos de uma série de produtos químicos anti-proliferativos sobre a replicação de células que modelo de cancro da mama humano. O ensaio primário se baseia na técnica fundamental da contagem de células e introduz uma nova maneira de contar as células utilizando software de microscopia. As activ...

Muitas vezes, nos cursos de graduação de biologia geral, os temas da regulação do ciclo celular e câncer são aflorados, mas não explorados em detalhe porque a amplitude do conteúdo nestes cursos deixa pouco tempo para a profundidade. Além disso, alunos de graduação de biologia não são normalmente expostos a técnicas avançadas associadas com a cultura de células animais. Para ajudar os alunos a desenvolver uma compreensão mais profunda destes conceitos, ao aplicar e analisar o que aprenderam, uma atividade de laboratório foi desenvolvido como uma modificação do Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) estendeu atividade laboratorial 1. O módulo de laboratório utiliza, uma estratégia experimental passo a passo que inclui a crescer e caracterizar um modelo celular de cancro, desenvolvimento e execução de métodos de contagem de células, é claro, que estabelece o tempo óptimo e dosagens para o tratamento de células com agentes anti-proliferativos, e identificação de vias de sinalização celular aberrante . O experimento também permite aberta-ended inquérito. A maioria das técnicas necessárias para esta actividade pode ser realizado num laboratório-ensinando biologia típico. A actividade inicia-se com os alunos que caracterizam a taxa de crescimento e morfologia da linha celular de tumor mamário de ratinho (MMT), um modelo de cancro da mama humano 2. O câncer de mama foi escolhido como o câncer de modelo por causa de sua prevalência na população, sua familiaridade aos estudantes em idade universitária, e os dados difundidos disponíveis. A linha de células MMT foi especificamente seleccionada porque é facilmente obtido, bem caracterizado, tem um curto tempo de duplicação e é fácil de cultivar. Além disso, as células MMT são o que é consistente com a maioria dos cancros da mama dependente de estrogénio do sexo feminino. Depois, os estudantes identificar vias de sinalização celular aberrante nas células MMT por tratamento das células com drogas de quimioterapia cujo mecanismo de acção é bem established.The concentração dos fármacos e duração dos tratamentos são variados permitindo que os alunospara avaliar o efeito destas variáveis ​​na taxa de divisão celular. O ensaio de chave para esta actividade é a determinação da viabilidade das células, o que requer simplesmente a contagem das células, utilizando um dos dois métodos. Cada método depende das habilidades de microscopia fortes. Estudantes determinar a viabilidade celular, utilizando um padrão, método hemocitï¿½etro e um método microfotografia romance e propor. Baseado em seus resultados, eles podem propor e testar modificações para a atividade. Os alunos, então, representar seus dados e interpretar os resultados para refinar a sua hipótese e elaborar novas estratégias experimentais. Esta atividade de laboratório é adequado para caloiro ou nível de estudante de segundo ano estudantes que se formam nas ciências biológicas. Ele é condensado em um módulo de laboratório de uma semana, que pode ser completada em um primeiro ano, biologia geral ou no segundo ano, curso de biologia celular / molecular. Habilidades necessárias para a boa execução da atividade incluem aritmética básica e álgebra, a familiaridade com uma variedade de chabilidades laboratoriais de minério (por exemplo, pipetagem, a tomada de solução, uma técnica estéril), análise de dados, microscopia de luz e tempo de gestão de base, juntamente com o conhecimento instrutor de cultura de células e software de planilha. Reagentes requeridos incluem um modelo de linha de células de animais para o cancro (por exemplo, células de mamário de ratinho de tumor, MMT 2), agentes quimioterapêuticos (por exemplo, tamoxifeno, a curcumina, a metformina, e aspirina), tripano meios de cultura azul e células (por exemplo, Meio Essencial Mínimo de Eagle ; EMEM) com suplementos apropriados (por exemplo, cavalos doador e soro fetal bovino). Instrumentos necessários incluem um microscópio invertido luz com apego câmera digital, computador, 100 mm e 24 placas de cultura de tecidos, incubadora de CO2 (ou equivalente), cabine de segurança biológica (BSC; Classe II), hemocitômetro, e software de microscopia digital. Existem bons exemplos de atividades de laboratório específicos que dependem de cultura de células animais para TEACestudantes de graduação h sobre conceitos em biologia celular 3. No entanto, muitos requerem fontes ou técnicas que não são facilmente acessíveis (por exemplo, isótopos radioativos, tecido animal vivo, equipamentos avançados de imagem 1,4,5), descrever os protocolos que são bastante avançada (por exemplo, adequado para um curso de nível 6 400), ou exigem multi-semana ou semestrais longas projetos 6,7. A atividade de laboratório descrito aqui é simples e pode ser realizado em uma única semana com equipamento de laboratório comum. Em resumo, este módulo de laboratório efetivamente introduz ou reforça os conceitos de ciclo celular, vias de sinalização celular e câncer, enquanto o ensino de habilidades básicas e avançadas de laboratório, análise de dados experimentais, o método de cultura de células animais e do processo científico. O módulo de laboratório é simples e economicamente acessível e fornece a flexibilidade ea oportunidade para o inquérito aberto. A atividade incentiva a criatividade dos estudantesfornecendo uma estratégia modelo experimental que actua como uma guia, mas não uma receita. Mais importante ainda, os satisfaz todos os domínios de actividade de aprendizagem de flores Taxonomia 8, pois requer lembrando, compreensão, aplicação, análise, avaliação e criação de envolver os alunos em um processo que os puxa para fora do livro didático e para o mundo da pesquisa científica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>ESCO Labculture Reliant</td>
			<td></td>
			<td>Class II Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterjactor CO2 Incubator</td>
			<td>CEDCO</td>
			<td>Model 1510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-line Hemocytometer</td>
			<td>American Optical</td>
			<td></td>
			<td>with two separate grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motic Images Plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mac OSX Verison 2.0 or higher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipetman</td>
			<td>Rainin instrument co. inc</td>
			<td></td>
			<td>P-20D, P-200D, P-1000D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK30/CK40 Culture Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>4 objective inverted light microscope with camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL Pipet tips</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>40200C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 uL Pipet tips</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AVR4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Seriological Pipets</td>
			<td>TPP</td>
			<td>TP94010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>CoStar- Tissue Culture Cluster</td>
			<td align="right">3524</td>
			<td>24 wells, 16 mm well diameter, Radiation sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td>100 mL, cell culture tested non-haz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-line Hemacytometer replacement coverslip, non-haz</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z375357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Mammary Tumor(MMT) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meformin Hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHR1084</td>
			<td>500 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>white or white-yellow powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curmumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1386</td>
			<td>yellow-orange powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2093</td>
			<td>meets USP testing specifications</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using mouse mammary tumor cells to teach core biology concepts: a simple lab module

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in preparation for biomedical, graduate and professional programs or careers in science. To address this, a simple laboratory module was devised to teach the concepts of cell division, cellular communication and cancer through the application of animal cell culture techniques. Here the mouse mammary tumor (MMT) cell line is used to model for breast cancer. Students learn to grow and characterize these animal cells in culture and test the effects of traditional and non-traditional chemotherapy agents on cell proliferation. Specifically, students determine the optimal cell concentration for plating and growing cells, learn how to prepare and dilute drug solutions, identify the best dosage and treatment time course of the antiproliferative agents, and ascertain the rate of cell death in response to various treatments. The module employs both a standard cell counting technique using a hemocytometer and a novel cell counting method using microscopy software. The experimental procedure lends to open-ended inquiry as students can modify critical steps of the protocol, including testing homeopathic agents and over-the-counter drugs. In short, this lab module requires students to use the scientific process to apply their knowledge of the cell cycle, cellular signaling pathways, cancer and modes of treatment, all while developing an array of laboratory skills including cell culture and analysis of experimental data not routinely taught in the undergraduate classroom.

Crescer células MMT e comparando métodos de contagem. Células de tumor mamário foram cultivadas com sucesso e caracterizado (Figura 1) e um método de contagem de células novo desenvolvido usando Motic Software, um programa digital de software associado a câmara por um microscópio. Este novo método de contagem de células foi comparada com um método de contagem tradicional utilizando um hemocitómetro (Figura 2) e mostrou-se igualmente efic...

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Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Biology Concepts | Biology | Video

Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Core Biology Concepts: A Simple Lab Module

A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.

Usando o rato do mamárias Células Tumorais para ensinar Biologia Conceitos Básicos: A Módulo Lab Simples

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in ...

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12.8K visualizações.  Marymount Manhattan College. A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.

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Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method relies on the highly specific interaction between peptide loaded MHC and the corresponding T-cell receptor.  While the affinity of a single MHC/peptide molecule is low, cross-linking MHC/peptide complexes with streptavidin increases the avidity of the interaction, enabling their use as staining reagents.  Because of the relatively low frequencies of CD4+ T cells (~1 in 300,000 for a single specificity) this assay utilizes an in vitro amplification step to increase its threshold of detection.  Mononuclear cells are purified from peripheral blood by Ficoll underlay.  CD4+ cells are then separated by negative selection using biotinylated antibody cocktail and anti-biotin labeled magnetic beads.  Using adherent cells from the CD4- cell fraction as antigen presenting cells, CD4+ T cells are expanded in media by adding an antigenic peptide and IL-2.  The expanded cells are stained with the corresponding class II tetramer by incubating at 37 C for one hour and subsequently stained using surface antibodies such as anti-CD4, anti-CD3, and anti-CD25.  After labeling, the cells can be directly analyzed by flow cytometry.  The tetramer positive cells typically form a distinct population among the expanded CD4+ cells.  Tetramer positive cells are usually CD25+ and often CD4 high.  Because the level of background tetramer staining can vary, positive staining results should always be compared to the staining of the same cells with an irrelevant tetramer.  Multiple variations of this basic assay are possible.  Tetramer positive cells may be sorted for further phenotypic analysis, inclusion in ELISPOT or proliferation assays, or other secondary assays.  Several groups have also demonstrated co-staining using tetramers and either anti-cytokine or anti-FoxP3 antibodies.  

This procedure demonstrates the purification and in vitro expansion of antigen specific CD4+ T cells from whole peripheral blood and their visualization using MHC class II tetramers. Tetramers permit the direct visualization of T cells with a single antigen specificity and defined MHC class II restriction.

Visualizando CD4 + antígeno específico Células T usando MHC Classe II tetrâmeros

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

Biologia

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Rato células epiteliais mamárias forma Mammospheres durante a diferenciação lactogênica

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

Procedimento de transplante do epitélio mamário

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Purificação de Citometria de Fluxo de células de camundongo meiótica

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.

Isolamento de células imunes de tumores primários

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

Injeção Intraductal para localizada Drug Delivery ao Rato glândula mamária

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

In vivo Reprogramação de células adultas somáticas a pluripotência por superexpressão de Fatores de Yamanaka

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotoxina microinjeção no peixe-zebra ao modelo de lesão renal aguda

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and biomedical sciences. This easy to follow protocol was developed for first year undergraduate pharmacy students and provides an entry-level introduction to enzyme reactions and analytical procedures for enzyme analysis. The enzyme of choice is lactase, as this represents an example of a commercially available enzyme relevant to human disease/pharmaceutical practice. Lactase is extracted from dietary supplement tablets, and assessed using a colorimetric assay based upon hydrolysis of an artificial substrate for lactase (ortho-nitrophenol-beta-D-galactopyranoside, ONPG). Release of ortho-nitrophenol following the hydrolytic cleavage of ONPG by lactase is measured by a change in absorbance at 420 nm, and the effect of the temperature on the enzymatic reaction is evaluated by carrying out the reaction on ice, at room temperature and at 37 &#176;C. More advanced analysis can be implemented using this protocol by assessing the enzyme activity under different conditions and using different reagents.

The enzymatic activity of lactase is essential for the catabolic processing of the disaccharide lactose. Here, the activity of lactase found in dietary supplements is assayed using a colorimetric assay. This provides students with an experimental platform for understanding the activity of lactase and enzyme kinetics.

Medindo a atividade enzimática de Lactase no laboratório de ensino

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...