This work is supported by the Joseph Alexander Foundation, the ASBMB Undergraduate Research Award, 2013-2014, and a Science Award Grant, Marymount Manhattan College, 2012-2013.

Hinweise: Conduct alle Arbeiten mit Zellen und Zellkultur-Reagenzien in der Klasse II Biosicherheitswerkbank (BSC) 9. MMT Zellen als Biosafety Level I klassifiziert, da sie geringe bis mäßige biologische Risiko darstellen. Wenden Sie korrekte Reinigung und Dekontamination Verfahren im Rahmen der BSC zwischen Nutzungen (zB UV-Licht, 70% Ethanol abwischen). 1. Wachsen MMT Zellen <ol><li> Wachsen Zellen in 10 cm-Gewebekulturschalen mit 10 ml nährstoffreichen Medium, Eagles Minimum Essential Medium (EMEM) aus mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM Glutamin und 1% antimykotische / Antibiotika (Penicillin 10 Einheiten , 100 ug Streptomycin, 0,25 ug Amphotericin B). Kultivieren Zellen in einer befeuchteten 5% CO 2 Kammer bei 37 ° C. Platten Zellen in einer Dichte von 3,6 x 10 6 Zellen / cm 2 (siehe die Zellzählung im Schritt 2). </li><li> Ersetzen Sie die Hälfte der Zellkulturmedien durch frisches Medium alle 48 Stunden unless anders angegeben. Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen und Morphologie durch Untersuchung mit einem invertierten Phasenkontrastlichtmikroskop. <ol><li> Hinweis und zu charakterisieren Zellen für Größe, Struktur, Form, Organisation und geschätzte Zahl unter 100 - 200-facher Vergrößerung. Bei dieser Dichte sollten die Zellen in einer Ebene angezeigt werden, nicht übereinander und in großer Nähe verklumpt. Jede Zelle besteht aus einem dichten, kugelförmigen Kern mit dünnen, langen, zweigartigen Erweiterungen Erweiterung aus, die es zu einem Punkt zu kommen (siehe Abbildung 1). </li></ol></li><li> Zellen zu unterteilen, wenn sie eine Zelldichte von 7,2 x 10 6 Zellen / cm 2 zu erreichen. Zellen weisen eine Verdopplungsrate von 1,8 x 10 6 Zellen / cm 2 pro 24 Std. Bezeichnen Zellen Passage X (Px), die Anzahl der Zeiten, die sie aufgeteilt worden zu bezeichnen. <ol><li> An Generation 3 (dh nach drei Durchgängen, P3), der Ernte, zu zählen, und die Platte, die Zellen auf eine 24-Well-Gewebekulturplatte mit einer Dichte von 3,6 x 10 6 </sup&gt; Zellen / cm 2. </li></ol></li><li> Ansicht Zellen jeden Tag und Rekord digitale Mikrofotografien. Hinweis und beschreiben Zellmorphologie (dh Größe, Form, Licht reflektierenden Eigenschaften). Bestimmen Sie Zellverdopplungszeit durch Zählen Zellen regelmäßig und über die verstrichene Zeit auf die Zellzahl. </li></ol> 2. Zählen MMT Cells Hinweis: Zählen von Zellen zu bestimmen, ob Zellen müssen subkultiviert werden, um für ein Experiment einzurichten oder um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Es gibt zwei Möglichkeiten vorgestellt. <ol><li> Verwendung einer Zählkammer, ein Standardverfahren, um Zellen zu zählen. <ol><li> Besorgen Sie sich eine hell-line Hämozytometer, eine 0,2% ige Lösung von Trypanblau, einer Verbindung Lichtmikroskop, sterile Reagenzgläser, Pipetten und einem manuellen Zellzähler. </li><li> Unter dem BSC, verwenden Sie ein 10 ml-Pipette, um Zellen aus einer 10 cm Gewebekulturschale zu entfernen. Wenn die Zellen auf einer Platte mit 24 Vertiefungen gezüchtet Verwendung einer 1 ml Pipette oder 1.000 &amp; mgr; l-Mikropipette, um das Medium zu entfernen. </li><li&gt; Zeichnen Zellmedien in die Pipette, legen Sie die Spitze der Pipette gegen den Boden der Schale und vertreiben die Medien während Sie die Pipettenspitze über die Platte. Wiederholen Sie 4-5 mal, um zu verdrängen Zellen, distanzieren Klumpen und führen zu einer genaueren Zellzahl. </li><li> Legen Sie die resultierende Zellsuspension in ein 15 ml sterilen Röhrchen (oder 1 ml Mikrozentrifugen oder andere kleine Volumen Rohr). Ansonsten lassen Sie die Zellen in der ursprünglichen Gewebekulturplatte / well. </li><li> Unter dem BSC kombinieren 10 ul der Zellsuspension mit 10 ul der Trypanblau-Lösung (Verhältnis 1: 1) in einem nicht-sterilen Mikrozentrifugen oder andere kleine Volumen Röhre. Hinweis: Trypanblau ist ein Vitalfarbstoff, der nicht von gesunden lebenden Zellen aufgenommen wird. Wenn Zellen beschädigt oder tot, Trypanblau kann die Zelle so toten Zellen zu zählen, geben Sie (aka Farbausschlussverfahren). Daher unter dem Mikroskop, tote Zellen erscheinen dunkelviolett, während lebensfähige Zellen sind eine helle und hell in der Farbe. </li><li> Bebrütenbei RT für 5 min. </li><li> Legen Sie das Deckglas auf der Zählkammer. Auftragen von 10 ul des Trypanblau-Zellsuspensionsmischung in die Nut. Sehen Sie sich die Zählkammer bei 100 - 200-facher Vergrößerung. Ein Vier-Ecken-Gitter ist offensichtlich (siehe Abbildung 2). </li><li> Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen (ungefärbten) gegenüber Gesamtzellen in jeder Rasterfläche. Der Mittelwert der vier Gitter und multiplizieren mit 1 x 10 4 bis Zellen / ml zu erhalten. <ol><li> Zu extrapolieren, die Gesamtzahl der Zellen pro Schale (oder Zellen / cm 2). Verwenden Sie diese Nummer, um entweder zu bestimmen, das richtige Volumen der Zellsuspension zu verwenden, um eine neue Gewebekulturplatte mit der gewünschten Dichte von 3,6 x 10 6 Zellen / cm 2 Samen oder bestimmen Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen auf der Platte oder in den Brunnen. Hinweis: Weitere Leitlinien für die Verwendung von einem Hämocytometer, siehe 10. </li></ol></li></ol></li><li> Verwenden Software und eine Digitalkamera an lebensfähigen Zellen zu zählen. <ol><li> Besorgen Sie sich eine digital-Kamera, die dazugehörige Software, eine 0,4% ige Lösung von Trypanblau, einer Verbindung Lichtmikroskop, sterile Reagenzgläser, Pipetten und einem Computer. Hinweis: Ein Moticam 2.000 Digitalkamera mit begleitenden Software Motic ist hier beschäftigt. Alle vergleichbaren Kamera und Software sollte ausreichend sein. Sicherzustellen, dass der Digitalkamera-Software wurde vorab (nach dem Protokoll des Herstellers) kalibriert. </li><li> Unter dem BSC, verwenden Sie ein 1 ml-Pipette oder 1000 ul-Mikropipette, um die Medien von den MMT Zellen wachsen in einem 24-Well-Gewebekulturschale zu entfernen. Waschen Sie die anhaftenden Zellen durch leichtes Anlegen einer geringen Menge (etwa 500 ul) der un-ergänzt (dh EMEM ohne Ergänzungen) frisches Medium auf die Platte dann entfernen. Direkt an den gut: Übernehmen 10 ul 0,2% Trypanblau (1 mit un-EMEM ergänzt durch Verdünnen von 1 gemacht). </li><li> Die Platte bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Sehen Sie sich die Platte unter dem Mikroskop bei 100 - 200-facher Vergrößerung with eine Digitalkamera angeschlossen. Platte kann mit nicht ergänzten Medium gewaschen werden, wenn Färbung mit 2% Trypanblau ist zu dunkel. </li><li> Öffnen Sie die Software auf dem Computer ein nd überprüfen, ob die Software mit dem Ziel, über die Registerkarte Einstellungen verwendet, kalibriert. Ein Bild von dem FOV sollte angezeigt werden. </li><li> Wählen Sie das Gitter auf der Registerkarte Measure. Ein Raster aus Quadraten etwa 0,005 cm in der Breite wird angezeigt. Wählen Sie Grid Info, um die Fläche jedes Quadrat zu bestätigen. </li><li> Wählen Sie einen bestimmten Bereich des Netzes, um Zellen zu zählen (dh 5 x 9 Quadrate Quadrate). Wählen Sie Rechteck auf der Registerkarte Measure. Klicken Sie auf die Ecke eines Quadrats und ziehen Sie den Cursor, um die Quadrate der Wahl umfassen. Hinweis: Ein Schatten des Grüns wird die Quadrate der Auswahl und einem weißen Feld wird in der Ecke, die Breite, Höhe, Fläche bietet erscheinen und Umfang der Abschnitt des gewählten Gitterabdeckung (siehe Abbildung 3). </li><li> Die Anzahl der VIABle Zellen innerhalb der ermittelten Fläche. Machen Sie dasselbe für zwei weitere Standorte in der gleichen gut oder Platte durch Bewegen der Platte unter dem Mikroskop. </li><li> Achten Sie darauf, dass der gemessene Bereich ist der gleiche und die Vergrößerung nicht geändert hat. Berechnung der durchschnittlichen Zahl der lebensfähigen Zellen innerhalb der Region. Verwendung der Fläche der Bohrung (für eine 24-Well-Platte besitzt eine Vertiefung eine Fläche von 2 cm 2, für eine 100-mm-Schale die Fläche 78,6 cm 2) zu extrapolieren, die Anzahl lebensfähiger Zellen, die aus dem Bereich, in dem Gitterrahmen abgegrenzt die Gesamtzahl von Zellen innerhalb des Bohrlochs (Zellen / cm 2). </li></ol></li></ol> 3. Gönnen MMT Zellen, die mit anti-proliferative Agents <ol><li> Werden die Lösungen der ausgewählten antiproliferative therapeutische Mittel (Tamoxifen, Curcumin und Metformin) und optional Medikament, Aspirin unter der BSC. <ol><li> Aufzulösen Curcumin und Tamoxifen in 100% Ethanol, um eine Stammkonzentration von 27 mM zu erzeugen. Löse Metformin und Aspirin in unsupplemented EMEM, um eine Stammkonzentration von 500 mM und 15 mM zu erzeugen sind. </li></ol></li><li> Stellen Sie eine Dose Response. <ol><li> Gönnen MMT Zellen mit den drei antiproliferative therapeutische Mittel (Tamoxifen, Curcumin und Metformin) und optional Medikament (Aspirin) bei verschiedenen Konzentrationen für 96 Stunden, um eine Dosis-Wirkungskurve zu erzeugen. Zunächst verwalten alle Medikamente zu einem Bereich von Konzentrationen auf der Grundlage veröffentlichter Berichte 1,11-16 und dann in Konzentrationen größer oder kleiner als die veröffentlicht. Anmerkung: Eine Dosis-Antwort bestimmt die minimale Konzentration eines Arzneimittels notwendig, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen. Hier kann die gewünschte Ergebnis ist eine Verringerung der Zellproliferation im Vergleich zu der Kontrolle. <ol><li> Für Tamoxifen und Curcumin, benutzen Konzentrationen (und entsprechenden Volumina) von 0,054 mm (1 &amp; mgr; l), 0.108 mm (2 ul), 0,162 mm (3 ul) und 0,216 mm (4 ul). </li><li> Für Metformin, verwenden Konzentrationen (und entsprechenden Volumina) von 2 mm (2 &amp; mgr;), 4 mm (4 &amp; mgr; l), 6 mM (6 ul), 8 mM (8 ul) und 10 mM (10 &amp; mgr; l). </li><li> Aspirin, Anwendungskonzentrationen (und die entsprechenden Volumina) von 0,030 mm (1 ul), 0,060 mm (2 ul), 0,099 mM (3,3 ul), 0,150 mm (5 &amp; mgr; l) und 0,216 mM (6,7 ul). </li></ol></li><li> Aufgeteilt MMT Zellen von der 10-cm-Schale auf eine Platte mit 24 Vertiefungen bei einer Konzentration von 3,6 x 10 6 Zellen / cm 2. Bestimmen anfänglichen Zellkonzentration von beiden Zell Zählverfahren (Schritt 2). Rufen Sie diese neue 24-Well-Platte von Zellen &quot;Day Split&quot;. </li><li> 24 h nach der Zell Plattieren, behandeln die MMT-Zellen mit jeder der antiproliferative therapeutische Mittel, Tamoxifen, Curcumin, Metformin und Aspirin, bei dem in Schritt 3.2.1 beschriebenen Konzentrationen. Bezeichnen dies als &quot;Tag 0&quot;. <ol><li> Wie jede Vertiefung kann maximal 500 ul Medien, Nutzung Mikropipetten mit sterilen Mikropipettenspitzen und eine neue Spitze jedes Mal eine neue gut behandelt wird, um zu vermeiden, halten Sie cross Kontamination. Mit zwei Vertiefungen als Kontrolle: Zellen in der Abwesenheit einer Medikamentenbehandlung (Negativkontrolle) und Zellen in Gegenwart von 100% Ethanol (Lösungsmittel Kontrolle) gezüchtet gezüchtet. </li></ol></li><li> Wachsen Zellen und neu zu verwalten Drogen an den beschriebenen Konzentrationen, wenn die Zellen jeden zweiten Tag gefüttert (siehe Schritt 1.2) für 96 Stunden (bis zum Tag 4) an den Tagen 1 -. 4 der Behandlung, beachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop und zählen mit das Verfahren in Schritt 2.2 (siehe Figur 4). </li><li> Wiederhole den Versuch mindestens drei Mal. </li><li> Bestimmen optimale Wirkstoffkonzentration, durch die grafische Darstellung der Beziehung zwischen Zelllebensfähigkeit und Medikamentendosierung über die Länge des Experiments (siehe Abbildung 5). </li></ol></li><li> Stellen Sie den Zeitverlauf. <ol><li> Behandeln MMT Zellen mit den drei antiproliferative therapeutische Mittel (Tamoxifen, Curcumin und Metformin) bei einer festen Konzentration für verschiedene Zeitabstände. Verwenden Sie die optimale Konzentration identifdurch die Dose Response Experimente ied (siehe Schritt 3.2). <ol><li> Verwenden Sie die folgenden Konzentrationen: 0,216 mM Tamoxifen, 0,216 mM Curcumin und 10 mM Metformin. Hinweis: Ein Zeitverlauf bestimmt die Menge an Zeit, die für ein Arzneimittel, ihre optimale gewünschte Ergebnis zu erzeugen. Hier ist das gewünschte Ergebnis eine Verringerung der Zellproliferation im Vergleich zu der Kontrolle. </li></ol></li><li> Aufgeteilt MMT Zellen von der 10-cm-Schale auf eine Platte mit 24 Vertiefungen bei einer Konzentration von 3,6 x 10 6 Zellen / cm 2. Bestimmen anfänglichen Zellkonzentration von beiden Zell Zählverfahren (Schritt 2). Rufen Sie diese neue 24-Well-Platte von Zellen &quot;Day Split&quot;. </li><li> 24 h nach der Zell Plattieren, behandeln die MMT-Zellen mit jeder der antiproliferative therapeutische Mittel, Tamoxifen, Curcumin, Metformin und Aspirin an den optimalen Konzentrationen in Schritt 3.2 identifiziert. Bezeichnen dies als &quot;Tag 0&quot;. <ol><li> Da jeder kann auch ein Maximum von 500 ul Medium zu halten, unse-Mikropipetten mit sterilen Mikropipettenspitzen und eine neue Spitze jedes Mal eine neue gut behandelt wird, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. </li><li> Mit zwei Vertiefungen als Kontrolle: Zellen in der Abwesenheit einer Medikamentenbehandlung (Negativkontrolle) und Zellen in Gegenwart von 100% Ethanol (Lösungsmittel Kontrolle) gezüchtet gezüchtet. </li></ol></li></ol></li><li> Wachsen Zellen und neu zu verwalten Drogen in der gewählten Konzentration, wenn die Zellen jeden zweiten Tag gefüttert (siehe Schritt 1.2) für 96 Stunden (bis zum Tag 4). An den Tagen 1 - 4 von Behandlung, beachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop zu zählen und mit der Methode in Schritt 2.2 (siehe Abbildung 4). </li><li> Wiederhole den Versuch mindestens drei Mal. </li><li> Bestimmen, optimalen Belichtungszeit von MMT Zellen miteinander Arzneimittels durch die grafische Darstellung der Beziehung zwischen der Lebensfähigkeit der Zellen und die Länge (Zeit) der medikamentösen Behandlung in der gewählten Konzentration (siehe Abbildung 6). </li></ol> 4. Die Lab-Modul Hinweis: Das Folgende ist eine 5-Tage-lab Zeitplan für Labor-Modul. 7 ist ein Flußdiagramm, was der Zeitplan würden innerhalb der 5 Tage bringen. Für diese Tätigkeit in fünf Tagen abgeschlossen sein entweder ein Zeitverlauf oder eine Dosis-Wirkungskurve erzeugt wird. Es ist nicht ausreichend Zeit, um die beiden Kurven zu erzeugen. Eine Dosis-Antwort-Experiment wird nachstehend beschrieben. Ein Zeitverlauf Experiment kann leicht ausgetauscht werden <ol><li> Teilen Sie die Klasse in Gruppen: haben eine Gruppe stellen Sie eine Dosis-Wirkung und die andere eine zeitliche Verlauf der Wahl einer Konzentration in der Mitte der vorgeschlagenen Dosis-Wirkungs-Konzentrationen. <ol><li> Achten Sie auf ausreichende Kulturen und Pharma-Aktien in geeigneten Konzentrationen. Wenn nicht anders angegeben, führen alle Arbeiten im Rahmen des BSC. </li></ol></li><li> Tag 1 <ol><li> Direkter Schüler Medien machen und wachsen Zellen (wie in Schritt 1). </li><li> Als Studenten erhalten einen Bestand von MMT Zellen auf einer 10 cm Platte, leiten die Schüler zu Zellkulturmedien vorbereiten und ein Tutorial in der Verwendung des hemocytometer, digitale Mikroskopie und die Digitalkamera Mikroskopie-Software (wie in Schritt 2). </li><li> Kalibrieren der Software auf die auf dem Mikroskop verwendet Ziele (zB, 4X, 10X, 20X) nun mit dem Protokoll des Herstellers. </li></ol></li><li> Tag 2 <ol><li> Lassen Sie die Schüler bestätigen, Gesamtzellzahl und Zelllebensfähigkeit (wie in Schritt 2). </li><li> Lassen Sie die Schüler zählen Zellen auf der 100 mm-Schale unter Verwendung sowohl der Mikroskopie-Software und die Zählkammer Methoden, um zu bestätigen, ähnliche Ergebnisse erzielt werden. </li><li> Direkter Schüler eine Platte mit 24 Vertiefungen und Split-Zellen aus der 100-mm-Schale, um den 24-Well-Platten auf die gewünschte Ausgangszelle Beschichtungs-Dichte (wie in Schritt 1) ​​zu erhalten. Dies wird als Tag Split. Legen Sie die Platte mit 24 Vertiefungen in einem Zellkulturbrutschrank für 24 Stunden. </li></ol></li><li> Tag 3 <ol><li> Wachsen MMT Zellen für 24 Stunden auf einer 24-Well-Platte. Lassen Sie die Schüler Zellen unter dem Mikroskop beobachten und zählen mit Mikroskopie-Software (wie in Schritt 2). </li><li> Geben Sie dem Schüler / tebin Proben der Krebsbehandlung Drogenbestände. Haben sie vorbereiten und verdünnen das ursprüngliche Stammlösung (wie in Schritt 3). Hinzufügen der verschiedenen Konzentrationen der Wirkstoffe, ihre Zellen, um eine Standardkurve herzustellen. Dies wird als Tag 0. </li><li> Inkubiere Zellen (Schritt 1.2) mit den Medikamenten für maximal 48 Stunden. </li></ol></li><li> Tag 4 <ol><li> Lassen Sie die Schüler behandelten Zellen beobachten, nach 24 Stunden. Dies ist Tag 1. </li><li> Zählen Sie jeden gut mit Mikroskopie-Software. Record Fotografien jedes gut, so dass das Zählen kann außerhalb des Labors (wie in Schritt 2) durchgeführt werden. </li><li> Inkubieren Zellen (Schritt 1.2) mit den Medikamenten für weitere 24 Stunden. Hinweis: Instructor bietet zusätzliche Tutorials und Bewertungen der Datenanalyse und grafische Darstellung. Die Studierenden lernen, Zahlen, Grundstücke, und die statistische Analyse für den nächsten Tag der Datensammlung zu erstellen. </li></ol></li><li> Tag 5 <ol><li> Lassen Sie die Schüler behandelten Zellen nach 48 Stunden, Tag 2. </li><li> Zählen Sie jeweilsauch mit Hilfe der Mikroskopie-Software. Record Fotografien jedes gut, so dass das Zählen kann außerhalb des Labors (wie in Schritt 2) durchgeführt werden. </li><li> Ernte und sammeln Zellen zum Zählen von der traditionellen Hämozytometer Verfahren als Mittel zur Überprüfung der Student Fähigkeit, effektiv zu nutzen die Mikroskopie-Software-Methode (wie in Schritt 2). Hinweis: Sammeln von Daten und Schlussfolgerungen zu ziehen oder zu revidieren, Hypothesen, entsprechend. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren erhielten keine finanzielle oder vergleichbare Unterstützung von Motic.

Ein Labormodul vorgestellt, um eine Vielzahl von Themen in der Zellbiologie durch die fortgeschrittene Techniken der Tierzellkulturen lehren sollen. Das Modul erreicht dies durch die Analyse der Wirkung einer Reihe von anti-proliferative Chemikalien auf die Vermehrung von Zellen, die menschliche Brustkrebsmodell. Der primäre Assay beruht auf der grundlegenden Technik der Zellzählung und stellt einen neuen Weg, um Zellen mittels Mikroskopie-Software zählen. Die Aktivitäten, die das Modul kann mit Instrumenten und Ger...

Oft in Bachelor allgemeine Biologie Kurse werden die Themen der Regulation des Zellzyklus und Krebs berührt, aber nicht im Detail untersucht, da die Breite der Inhalte in diesen Kursen lässt wenig Zeit für die Tiefe. Außerdem Bachelor Biologie-Studenten sind normalerweise nicht zu den fortgeschrittenen Techniken mit tierischen Zellkultur ausgesetzt. Die Schüler entwickeln ein tieferes Verständnis dieser Konzepte, während der Anwendung und zu analysieren, was sie gelernt haben, wurde ein Labor-Aktivität als eine Modifikation des Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) erweitert Labortätigkeit 1 entwickelt. Das Labor-Modul verwendet eine stufenweise, experimentelle Strategie, die wachsen und Charakterisierung einer Krebszellmodell die Entwicklung und Durchführung der Zellzählung Methoden zur Einführung optimalen zeitlichen Verlauf und die Dosierungen für die Behandlung von Zellen, die mit anti-proliferative Mittel, und Identifizieren aberrante Zelle-Signalwege umfasst . Das Experiment ermöglicht auch offen-ended Anfrage. Die meisten Techniken für diese Tätigkeit erforderlich ist, kann in einem typischen Biologie-Unterricht Labor durchgeführt werden. Die Aktivität beginnt mit Studenten Charakterisierung der Morphologie und Wachstumsrate des Maus-Mamma-Tumor (MMT) Zelllinie, ein Modell für die menschliche Brustkrebs-2. Brustkrebs wurde als Modell Krebs wegen seiner Verbreitung in der Bevölkerung, seine Bekanntheit bei den College-Alter Studenten, und den weit verbreiteten Daten ausgewählt. Die MMT-Zelllinie wurde speziell ausgewählt, weil es leicht erhältlich, gut charakterisierte, hat eine kurze Verdopplungszeit und ist einfach zu züchten. Außerdem MMT Zellen sind östrogenabhängigen die im Einklang mit den meisten weiblichen Brustkrebs ist. Studenten dann identifizieren aberrante Zelle-Signalwege in den MMT-Zellen durch Behandlung der Zellen mit Chemotherapeutika, deren Wirkungsmechanismus auch established.The Konzentration von Arzneimitteln und der Länge der Behandlung variiert werden, damit die Schülerum die Wirkung dieser Variablen auf die Geschwindigkeit der Zellteilung zu bewerten. Der Schlüssel-Assay für diese Aktivität ist die Bestimmung der Lebensfähigkeit der Zellen, die einfach erfordert Zellzählung unter Verwendung eines von zwei Verfahren. Jede Methode ist abhängig von starken Mikroskopie Fähigkeiten. Die Schüler bestimmen, die Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwendung eines Standard Hämozytometer Verfahren und eine neue Photomikroskopie Verfahren und vorzuschlagen. Auf der Grundlage ihrer Erkenntnisse, sie schlagen und testen Sie Änderungen an der Aktivität. Studenten dann ihre Daten darstellen und die Ergebnisse zu interpretieren, um ihre Hypothese zu verfeinern und entwickeln neue experimentelle Strategien. Dieses Labor-Aktivität ist für Erstsemester oder College-Student-Ebene Studenten im Hauptstudium der Biologie geeignet. Es ist in einem einwöchigen Labormodul, das in einem ersten Jahres abgeschlossen werden kann, allgemeine Biologie oder zweiten Jahr zellulären / molekularen Biologie natürlich kondensiert. Fähigkeiten für die ordnungsgemäße Beendigung der Tätigkeit erforderlich sind grundlegende Arithmetik und Algebra, Vertrautheit mit einer Reihe von core Labor Fähigkeiten (zB Pipettieren, Lösung Herstellung, steriler Technik), Datenanalyse, Grundlichtmikroskopie und Zeitmanagement, zusammen mit Instructor Wissen der Zellkultur und Tabellenkalkulationssoftware. Erforderliche Reagenzien gehören Tierzellinie Modell für Krebs (zB Maus-Brusttumorzellen, MMT 2), Chemotherapeutika (zB Tamoxifen, Curcumin, Metformin und Aspirin), Trypanblau und Zellkulturmedien (zB Eagles Minimum Essential Medium ; EMEM) mit entsprechenden Ergänzungen (zB Geber Pferd und fötales Rinderserum). Benötigte Instrumente umfassen einen invertierten Lichtmikroskop mit Digitalkamera Anlage, Computer, 100 mm und 24 Gewebekulturplatten, CO 2 Inkubator (oder gleichwertig), Biosicherheitswerkbank (BSC; Klasse II), Hämozytometer und digitale Mikroskopie-Software. Es gibt gute Beispiele für spezifische Laboraktivitäten, die auf tierische Zellkultur verlassen, um TEACh Studenten über Konzepte in der Zellbiologie 3. Allerdings erfordern viele Lieferungen oder Techniken, die nicht leicht zugänglich sind (zB radioaktive Isotope, Live tierischem Gewebe, moderne bildgebende Geräte 1,4,5), beschreiben Protokolle, die recht weit fortgeschritten (zB für eine 400-Level-Kurs 6) sind, oder erfordern mehrwöchigen oder Semester lang Projekte 6,7. Die hier beschriebene Labortätigkeit ist einfach und kann in einer einzigen Woche mit gemeinsamen Laborausrüstung durchgeführt werden. Zusammenfassend diese Labormodul effektiv führt oder stärkt die Konzepte der Zellzyklus, zelluläre Signalwege und Krebs beim Unterrichten grundlegende und erweiterte Laborkenntnisse, experimentellen Datenanalyse, die Methode der Tierzellkultur und den wissenschaftlichen Prozess. Das Labor-Modul ist einfach und wirtschaftlich erreichbar und bietet Flexibilität und Gelegenheit für offene Anfrage. Die Aktivität fördert Studenten Kreativitätdurch die Bereitstellung einer Vorlage experimentelle Strategie, die als Leitfaden, aber nicht ein Rezept wirkt. Am wichtigsten ist, die Aktivität erfüllt alle Lerndomänen von Blooms Taxonomie 8, wie es erfordert Erinnerung, Verständnis, Anwendung, Analyse, Bewertung und die Schaffung von durch die Gewinnung Studenten in einem Prozess, der sie aus dem Lehrbuch und in die Welt der wissenschaftlichen Forschung zieht.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood</td>
			<td>ESCO Labculture Reliant</td>
			<td></td>
			<td>Class II Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waterjactor CO2 Incubator</td>
			<td>CEDCO</td>
			<td>Model 1510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-line Hemocytometer</td>
			<td>American Optical</td>
			<td></td>
			<td>with two separate grids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motic Images Plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mac OSX Verison 2.0 or higher</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipetman</td>
			<td>Rainin instrument co. inc</td>
			<td></td>
			<td>P-20D, P-200D, P-1000D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK30/CK40 Culture Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>4 objective inverted light microscope with camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 uL Pipet tips</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>40200C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 uL Pipet tips</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AVR4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Seriological Pipets</td>
			<td>TPP</td>
			<td>TP94010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>CoStar- Tissue Culture Cluster</td>
			<td align="right">3524</td>
			<td>24 wells, 16 mm well diameter, Radiation sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td>100 mL, cell culture tested non-haz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright-line Hemacytometer replacement coverslip, non-haz</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z375357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Mammary Tumor(MMT) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2003</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0926</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meformin Hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHR1084</td>
			<td>500 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td>white or white-yellow powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curmumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1386</td>
			<td>yellow-orange powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspirin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2093</td>
			<td>meets USP testing specifications</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using mouse mammary tumor cells to teach core biology concepts: a simple lab module

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in preparation for biomedical, graduate and professional programs or careers in science. To address this, a simple laboratory module was devised to teach the concepts of cell division, cellular communication and cancer through the application of animal cell culture techniques. Here the mouse mammary tumor (MMT) cell line is used to model for breast cancer. Students learn to grow and characterize these animal cells in culture and test the effects of traditional and non-traditional chemotherapy agents on cell proliferation. Specifically, students determine the optimal cell concentration for plating and growing cells, learn how to prepare and dilute drug solutions, identify the best dosage and treatment time course of the antiproliferative agents, and ascertain the rate of cell death in response to various treatments. The module employs both a standard cell counting technique using a hemocytometer and a novel cell counting method using microscopy software. The experimental procedure lends to open-ended inquiry as students can modify critical steps of the protocol, including testing homeopathic agents and over-the-counter drugs. In short, this lab module requires students to use the scientific process to apply their knowledge of the cell cycle, cellular signaling pathways, cancer and modes of treatment, all while developing an array of laboratory skills including cell culture and analysis of experimental data not routinely taught in the undergraduate classroom.

Wachsende MMT Zellen und Vergleichen Zählverfahren. Mäusebrusttumorzellen wurden erfolgreich gezüchtet und charakterisiert (Figur 1) und ein neues Verfahren der Zellzählung unter Verwendung Motic Software, eine Digitalkamera-assoziierten Softwareprogramm für ein Mikroskop entwickelt. Diese neue Zell Zählverfahren wurde zu einem traditionellen Zählverfahren unter Verwendung eines Hämocytometers (Abbildung 2) verglichen, und es zeigte ebenso g...

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Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Biology Concepts | Biology | Video

Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Core Biology Concepts: A Simple Lab Module

A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.

Verwenden von Maus-Brusttumorzellen Kern Biology Concepts Lehren: A Simple Lab Module

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in ...

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SCIENTISTS IN ACTION

12.8K Aufrufe.  Marymount Manhattan College. A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.

Serie: Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Core Biology Concepts: A Simple Lab Module

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method relies on the highly specific interaction between peptide loaded MHC and the corresponding T-cell receptor.  While the affinity of a single MHC/peptide molecule is low, cross-linking MHC/peptide complexes with streptavidin increases the avidity of the interaction, enabling their use as staining reagents.  Because of the relatively low frequencies of CD4+ T cells (~1 in 300,000 for a single specificity) this assay utilizes an in vitro amplification step to increase its threshold of detection.  Mononuclear cells are purified from peripheral blood by Ficoll underlay.  CD4+ cells are then separated by negative selection using biotinylated antibody cocktail and anti-biotin labeled magnetic beads.  Using adherent cells from the CD4- cell fraction as antigen presenting cells, CD4+ T cells are expanded in media by adding an antigenic peptide and IL-2.  The expanded cells are stained with the corresponding class II tetramer by incubating at 37 C for one hour and subsequently stained using surface antibodies such as anti-CD4, anti-CD3, and anti-CD25.  After labeling, the cells can be directly analyzed by flow cytometry.  The tetramer positive cells typically form a distinct population among the expanded CD4+ cells.  Tetramer positive cells are usually CD25+ and often CD4 high.  Because the level of background tetramer staining can vary, positive staining results should always be compared to the staining of the same cells with an irrelevant tetramer.  Multiple variations of this basic assay are possible.  Tetramer positive cells may be sorted for further phenotypic analysis, inclusion in ELISPOT or proliferation assays, or other secondary assays.  Several groups have also demonstrated co-staining using tetramers and either anti-cytokine or anti-FoxP3 antibodies.  

This procedure demonstrates the purification and in vitro expansion of antigen specific CD4+ T cells from whole peripheral blood and their visualization using MHC class II tetramers. Tetramers permit the direct visualization of T cells with a single antigen specificity and defined MHC class II restriction.

Visualizing Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen mit MHC Klasse II Tetramere

Major histocompatibility complex (MHC) class II tetramers allow the direct visualization of antigen specific CD4+ T cells by flow cytometry.  This method ...

Forschung

Biologie

Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

Maus Brustepithelzellen Form Mammospheres Während lactogenic Differenzierung

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

Brustepithelzellen Transplantation

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.

Isolierung von Immunzellen aus Primärtumoren

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

Intraduktale Injection für Lokalisierte Drug Delivery auf die Maus Milchdrüse

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and biomedical sciences. This easy to follow protocol was developed for first year undergraduate pharmacy students and provides an entry-level introduction to enzyme reactions and analytical procedures for enzyme analysis. The enzyme of choice is lactase, as this represents an example of a commercially available enzyme relevant to human disease/pharmaceutical practice. Lactase is extracted from dietary supplement tablets, and assessed using a colorimetric assay based upon hydrolysis of an artificial substrate for lactase (ortho-nitrophenol-beta-D-galactopyranoside, ONPG). Release of ortho-nitrophenol following the hydrolytic cleavage of ONPG by lactase is measured by a change in absorbance at 420 nm, and the effect of the temperature on the enzymatic reaction is evaluated by carrying out the reaction on ice, at room temperature and at 37 &#176;C. More advanced analysis can be implemented using this protocol by assessing the enzyme activity under different conditions and using different reagents.

The enzymatic activity of lactase is essential for the catabolic processing of the disaccharide lactose. Here, the activity of lactase found in dietary supplements is assayed using a colorimetric assay. This provides students with an experimental platform for understanding the activity of lactase and enzyme kinetics.

Messung der Laktase enzymatische Aktivität in das Lehrlabor

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...