J.H. is supported by NIH K99/R00 Pathway to Independence Award (5K99CA172700) and NCI Brain Cancer SPORE Career Development Award (2P50CA127001).

참고 :이 프로토콜의 모든 단계가 UT MD 앤더슨 암 센터에 의해 승인되었습니다. mTERT-ER 대립 유전자의 1 세대 <ol><li> 노크에 소개 ERT2-LBD (리간드 결합 도메인) 상류와 (인트론 2를 통해 엑손 1) mTERT 게놈 시퀀스 프레임과 훈제 연어 포함하는 벡터 대상 - 마우스 ES 세포에 훈제 연어 조각 (그림 1A) - PGK - 네오 전기와. </li><li> 문화 6~10일에 대한 네오 마이신의 ES 세포. 네오 마이신 내성 클론을 선택하고 48 웰 플레이트에서 확장합니다. 상용 키트를 사용하여 게놈 DNA를 추출하고 노크에 대립 유전자 남부 블롯을 확인합니다. </li><li> 거꾸로 현미경 C57BL에 미세 조작 키트 / 6 배반포를 95 % 이상 정상 핵형을 가진 두 개의 ES 라인을 주입한다. 대리모 (23)의 자궁에 배반포를 이식. C57BL / 6 FE에 고급 수컷 키메라 (70-90%)을 메이트남성. </li><li> 남부 오점으로 이형 mTERT-ERneo 동물의 유전자형을 확인합니다. </li><li> NeoR 카세트를 삭제 이형 mTERT-ERneo 동물과 EIIa-Cre 호텔 동물 메이트. 동질 접합체를 생성하기 위해 적어도 세 번 더 간 품종 이형 mTERT-ER 동물에 대한 C57BL / 6 동물 이형 동물 메이트. </li></ol> LSL - mTERT 대립 유전자의 2 세대 <ol><li> 노크에에 loxP를 포함하는 벡터를 대상으로 도입 - 트리플 스토퍼 - 네오 -에 loxP 조각 및 전기 (23)와 마우스 ES 세포로 (엑손 1 인트론 2, 그림 1B 사이) mTERT 게놈 시퀀스를. </li><li> 문화 6~10일에 대한 네오 마이신의 ES 세포. 네오 마이신 내성 클론을 선택하고 48 웰 플레이트에서 확장합니다. 상용 키트를 사용하여 게놈 DNA를 추출하고 남부 오 (23)에 의해 노크에 대립 유전자를 확인합니다. </li><li> 인제거꾸로 현미경 미세 조작 키트와 C57BL / 6 배반 포기에 95 % 이상 정상 핵형을 가진 CT 두 ES 라인. 대리모 (23)의 자궁에 배반포를 이식. C57BL / 6 암컷 고급 남성 키메라 (70-90%를) 메이트. </li><li> 남부 오점으로 이형 LSL - mTERT 동물의 유전자형을 확인합니다. </li><li> 적어도 3 회 C57BL / 6 동물 이형 동물 메이트, 또한 간 품종 이형 LSL - mTERT 동물 동질 접합체를 생성합니다. </li></ol> 생체 내에서 mTERT-ER 및 LSL - mTERT 마우스에서 텔로 머라 제의 3. 재 활성화 mTERT-ER의 경우 <ol><li> 주입하기 전에 모든 수술 도구를 소독. </li><li> 50 % (v / v)의 산소 / 50 % (v / v)의 일산화이 질소 가스 혼합물에 이소 플루 챔버 (유도 4 %, 2 %로 유지)으로 마취 된 마우스. 아니면 케타민 - 자일 라진 (xylazine) 혼합물에 의해 마우스 (100m 마취g / kg (체중) + 10 ㎎ / ㎏ 체중). </li><li> 깊은 마취에 도달하면, 유도 챔버로부터 마취 된 동물을 제거하고, 챔버 이소 플루 란 (2 %)에 접속 관내 그들의 머리를 유지한다. </li><li> 동물이 깊이 마취되어 있는지 확인하기 위해 쥐의 발 패드를 핀치. 마르지 눈을 방지하기 위해, 양쪽 눈에 연고를 넣어. 포비돈 요오드 용액으로 마우스의 뒷면을 닦습니다. </li><li> 뒷면의 피부 아래 정밀 투관침 (10 G)와 느린 방출 4-OHT 펠렛을 주입하고 두 어깨 사이의 중간 선에 펠릿을 끝까지 밀어 넣습니다. </li><li> 상처 클립 적용자와 절개를 밀봉하고 마취에서 회복 쥐를 모니터링 할 수 있습니다. 십일 나중에 클립을 제거합니다. 절차가 곧 완료되기 때문에 보충 열 필요가 없습니다. </li><li> 4- OHT 펠릿과 치료 기간은 연구의 목적에 따라 최적화되어야한다. </li></ol> LSL - mTERT 들어 &lt;OL&gt; <li> 타목시펜 (10 ㎎ / ㎖, 옥수수 기름에 용해) (200 UL / 25g / 일) 복강 이틀 연속 주입된다. </li></ol> 신경 줄기 세포를 체외에서 텔로 머라 제의 재 활성화 4. 분리 <ol><li> 마우스를 이산화탄소로 안락사 및 뇌를 제거한다. 제조 업체에 따라 시중에서 판매하는 신경 조직 해리 키트의 프로토콜을 따르십시오. </li><li> 와류를 수행하지 해결책 4.위한 세포 배양 배지 1 ㎖로 표지 된 해결책 4 바이알에서 동결 건조 분말을 재현 탁. 이 용액 분주 나중에 사용하기 위해 -20 ℃에서 보관해야한다. </li><li> 예열 사용 전에 15 분 동안 37 ° C에서 혼합물. </li><li> 해결 방법 1 (50 μL) 및 해결 방법 2 (1,900 μL) : 효소 믹스 1을 확인합니다. 해결 방법 3 (20 μL) 및 솔루션 4 (10 μL) : 효소 믹스 2를 확인합니다. </li><li> 최대 400 mg의 조직과 소용돌이를 위해 1950 μL 효소 믹스 하나를 준비합니다. 37 ℃에서 혼합물을 예열사용하기 전에 15 분. </li><li> 1 일 마우스의 뇌를 가지고, 후각 전구 및 소뇌를 제거하여 forebrains을 유지합니다. 4 ° C에서의 제거 및 저장하기 때문에 감기 배지 1 ㎖의 전뇌 조직을 유지합니다. 1 시간 내에서 신경 조직을 처리 할 수​​ 있는지 확인합니다. </li><li> 소화 당 400 mg의 한계를 초과하지 확인하기 위해 조직의 무게를 결정합니다. 35mm 직경 페트리 접시의 뚜껑에 뇌를 놓고 메스를 사용하여 뇌 호감. </li><li> HBSS 1 ㎖를 추가, 1 ml의 피펫 팁을 사용하여 (w / 칼슘 / 마그네슘 O) 다시 15 ML 튜브 피펫 조각. HBSS 린스 (w / 칼슘 / 마그네슘 O). 원심 분리기 실온에서 2 분 동안 300 × g에서 조심스럽게 뜨는을 대기음. </li><li> 예열 효소 믹스 1의 1,950 μL (솔루션 1, 2) 당 최대 400 mg의 조직을 추가합니다. 반전 또는 튜브를 5 분마다 흔들어 혼합, 37 ° C에서 15 분 동안 15ml의 튜브 부화. </li><li> 20 &amp; #을 추가하여 조직 샘플 30 μL 효소 믹스 2를 준비(956), 솔루션 (4)의 10 μL에 대한 해결 방법 3의 난 다음 샘플에 추가. 섞어 부드럽게 반전. 소용돌이하지 마십시오. </li><li> 기계적으로 천천히 피펫 아래로 10 배 넓은 팁, ​​화재 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직을 떼어 놓다. 공기 방울을 형성하지 마십시오. </li><li> 튜브를 3 분마다 반전, 10 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 단계 4.11을 반복하고 조직을 200 mg의보다 큰 경우 4.12 단계. </li><li> 50 ML 튜브에 배치 된 70 μm의 셀 스트레이너에 세포 현탁액을 적용합니다. 셀 스트레이너를 통해 PBS 10 ㎖를 적용합니다. 실온에서 20 분 동안 300g로 셀 스트레이너 원심 세포 현탁액을 버린다. 기음 완전히 뜨는. </li><li> 상기 애플리케이션에 필요한 용적 줄기 세포 배지로 세포를 재현 탁. </li><li> , LSL-mTERT NSCs의에서 텔로 머라 아제를 활성화 이틀 동안 100 μM 4-OHT와 세포를 치료합니다. 100 μM 4 배지에서 세포를 유지, mTERT-ER NSCs의에서 텔로 머라 아제를 활성화하려면-OHT. </li></ol> 5. 텔로미어의 FISH <ol><li> 배양 된 세포에서 중기 염색체를 준비합니다. </li><li> FFPE (포르말린 고정 파라핀 임베디드) 조직 절편, 크실렌과 deparaffinize 각 5 분 (100 %, 90 %, 70 %, 50 % 에탄올)과 5 분 동안 PBS 에탄올 시리즈 재수 들어. </li><li> 메탄올 후 수정 : 아세트산 (3 : 1) 1-2 시간 동안. 각각 5 분 (70 %, 90 %, 100 % 에탄올) 및 공기 건조를 위해 냉 에탄올 시리즈 탈수. 5 분 동안 37 ℃에서 1X PBS로 세척 하였다. </li><li> 2 분 동안 37 ° C에서 4 % 포름 알데히드 염색체 변성. 냉 에탄올 시리즈에서 각각 5 분 (70 %, 90 %, 100 % 에탄올) 및 공기 건조 탈수. </li><li> 각 슬라이드에 PNA 하이브리드 혼합물의 12-25 μl를 적용합니다. (하이브리드 믹스 : 70 % 포름 아미드, 0.06x의 SSC, 0.2 % BSA, 0.5 NG / μL의 tRNA, 0.5 NG / μL 텔로미어 (telomere) 또는 센트로 프로브) </li><li> 고무 시멘트와 커버 슬립을 밀봉합니다. 4m, 80 ℃에서 포스트 - 변성에 염색체 상태로 준비 및 조직 섹션인치 실온에서 잡종 또는 습기 챔버에 2-4 시간 동안 37 ° C. </li><li> 세척 버퍼 2 × 15 분으로 실온에서 씻으십시오. (워시 버퍼 : 70 % 포름 아미드, 0.06x의 SSC, pH를 7.2). PBST 실온에서 3 × 5 분을 씻으십시오. 현미경 검사에 대한 DAPI 또는 원적외선 형광와 카운터 얼룩 슬라이드. </li></ol>

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	<li>Bass, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+sequencing+of+colorectal+adenocarcinomas+identifies+a+recurrent+VTI1A-TCF7L2+fusion.">Genomic sequencing of colorectal adenocarcinomas identifies a recurrent VTI1A-TCF7L2 fusion.</a> Nat Genet. 43, 964-968 (2011).</li><li>Beroukhim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+somatic+copy-number+alteration+across+human+cancers.">The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers.</a> Nature. 463, 899-905 (2010).</li><li>Blasco, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+shortening+and+tumor+formation+by+mouse+cells+lacking+telomerase+RNA.">Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA.</a> Cell. 91, 25-34 (1997).</li><li>Lee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+mouse+telomerase+in+highly+proliferative+organs.">Essential role of mouse telomerase in highly proliferative organs.</a> Nature. 392, 569-574 (1998).</li><li>Rossi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiencies+in+DNA+damage+repair+limit+the+function+of+haematopoietic+stem+cells+with+age.">Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age.</a> Nature. 447, 725-729 (2007).</li><li>Wong, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+dysfunction+and+Atm+deficiency+compromises+organ+homeostasis+and+accelerates+ageing.">Telomere dysfunction and Atm deficiency compromises organ homeostasis and accelerates ageing.</a> Nature. 421, 643-648 (2003).</li><li>Rudolph, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longevity,+stress+response,+and+cancer+in+aging+telomerase-deficient+mice.">Longevity, stress response, and cancer in aging telomerase-deficient mice.</a> Cell. 96, 701-712 (1999).</li><li>Wong, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+dysfunction+impairs+DNA+repair+and+enhances+sensitivity+to+ionizing+radiation.">Telomere dysfunction impairs DNA repair and enhances sensitivity to ionizing radiation.</a> Nat Genet. 26, 85-88 (2000).</li><li>Ferron, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+shortening+and+chromosomal+instability+abrogates+proliferation+of+adult+but+not+embryonic+neural+stem+cells.">Telomere shortening and chromosomal instability abrogates proliferation of adult but not embryonic neural stem cells.</a> Development. 131, 4059-4070 (2004).</li><li>Savage, S. A., Alter, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dyskeratosis+congenita.">Dyskeratosis congenita.</a> Hematol Oncol Clin North Am. 23, 215-231 (2009).</li><li>Armanios, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndromes+of+telomere+shortening.">Syndromes of telomere shortening.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 10, 45-61 (2009).</li><li>Vulliamy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+component+of+telomerase+is+mutated+in+autosomal+dominant+dyskeratosis+congenita.">The RNA component of telomerase is mutated in autosomal dominant dyskeratosis congenita.</a> Nature. 413, 432-435 (2001).</li><li>Harley, C. B., Harley, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase,+checkpoints+and+cancer.">Telomerase, checkpoints and cancer.</a> Cancer surveys. 29, 263-284 (1997).</li><li>Karlseder, J., Broccoli, D., Dai, Y., Hardy, S., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53-+and+ATM-dependent+apoptosis+induced+by+telomeres+lacking+TRF2.">p53- and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2.</a> Science (New York, N.Y.). 283, 1321-1325 (1999).</li><li>Steensel, B., Smogorzewska, A., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRF2+protects+human+telomeres+from+end-to-end+fusions.">TRF2 protects human telomeres from end-to-end fusions.</a> Cell. 92, 401-413 (1998).</li><li>Chin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+deficiency+rescues+the+adverse+effects+of+telomere+loss+and+cooperates+with+telomere+dysfunction+to+accelerate+carcinogenesis.">p53 deficiency rescues the adverse effects of telomere loss and cooperates with telomere dysfunction to accelerate carcinogenesis.</a> Cell. 97, 527-538 (1999).</li><li>Artandi, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+dysfunction+promotes+non-reciprocal+translocations+and+epithelial+cancers+in+mice.">Telomere dysfunction promotes non-reciprocal translocations and epithelial cancers in mice.</a> Nature. 406, 641-645 (2000).</li><li>Rudolph, K. L., Millard, M., Bosenberg, M. W., DePinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+dysfunction+and+evolution+of+intestinal+carcinoma+in+mice+and+humans.">Telomere dysfunction and evolution of intestinal carcinoma in mice and humans.</a> Nat Genet. 28, 155-159 (2001).</li><li>Greenberg, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+dysfunctional+telomeres+impair+tumorigenesis+in+the+INK4a(delta2/3)+cancer-prone+mouse.">Short dysfunctional telomeres impair tumorigenesis in the INK4a(delta2/3) cancer-prone mouse.</a> Cell. 97, 515-525 (1999).</li><li>Jaskelioff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+reactivation+reverses+tissue+degeneration+in+aged+telomerase-deficient+mice.">Telomerase reactivation reverses tissue degeneration in aged telomerase-deficient mice.</a> Nature. 469, 102-106 (2011).</li><li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitelomerase+therapy+provokes+ALT+and+mitochondrial+adaptive+mechanisms+in+cancer.">Antitelomerase therapy provokes ALT and mitochondrial adaptive mechanisms in cancer.</a> Cell. 148, 651-663 (2012).</li><li>Ding, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+reactivation+following+telomere+dysfunction+yields+murine+prostate+tumors+with+bone+metastases.">Telomerase reactivation following telomere dysfunction yields murine prostate tumors with bone metastases.</a> Cell. 148, 896-907 (2012).</li><li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

여기서 우리는 두 개의 유도 쥐의 텔로 머라 제의 대립 유전자 및 방법 생체 내 및 시험관 내에서 텔로 머라 제를 재 활성화하는 방법의 생성을보고합니다. mTERT-ER 활동을 재 활성화를위한 중요한 단계는 타목시펜의 연속 농도를 유지하는 것입니다, 그래서 우리는 미국의 혁신적인 연구에 의해 제조 된 4-OHT 시간 방출 펠렛을 사용하여 선택합니다. 펠릿을 최대 60 일간 1ng의 / ml의 정상 상태 혈중 농도에 4OHT 해제 유지. 이전 연구에서, 우리는이 전략 텔로 머라 제 활성을 재 활성화하는 등 줄기 세포 고갈, G4 mTERT ER / ER에서 텔로미어 기능 장애에 의해 유발 된 여러 장기에서 조직 손상 반응 및 장기 부전의 손상과 퇴행성 표현형을 개선 할 수였다 마우스 (20). 노화 텔로 머라 제의 기능을 연구 이외에,이 두 대립 유전자가 유도 성 텔로 머라 제는 또한 암을 연구하는데 사용될 수있다. 이전의 연구했다이러한 대립 유전자의 장점은 유전체를 형성하고 T 세포의 흉선 림프종 (21)와 전립선 암 (22)의 생물학에 영향을 미치지에서 텔로미어 (telomere)의 감소와 텔로 머라 아제 활성화의 역할을 탐구한다. 이 두 연구는 보여 주었다 후반 세대 G4 현금 지급기에서 텔로미어 기능 장애 - / - mTERT ER / ER 및 G4 PB-Cre4 PTEN을 L은 / L p53을은 L / L은 LSL - mTERT L은 / L 마우스는 조기 돌연변이 이벤트의 인수에 연료를 공급하는 메커니즘을 제공합니다 종양 개시, 아직 완전히 악성 종양의 진행을 방지한다. 텔로 머라 제는 말단 소립 장애 유발 게놈 불안정성, DNA 손상 체크 포인트 만연 염색체 불안정성의 컨텍스트에서 활성화되었을 때 전립선 암 (21)의 골전이 및 thymi의 뇌 침투 새로운 생물학적 성질을 가진 악성 종양의 전체의 진행을 허용하는 억제했다C 림프종 (21). 비슷한 현상은 대장 암과 췌장암 (박사. Haoqiang 잉, 아담 Boutin 로널드 DePinho와 개인 통신)을 포함한 다른 암 종류에서 관찰되었다. TERT-ER 단백질 용이 동물 타목시펜 또는 비히클로 처리 여부에 따라 온 상태 사이 끌 수 있으므로 mTERT-ER 대립 유전자에 의해 생성 된 종양 모델은 항 - 텔로 머라 요법을 시험하는데 이용 될 수있다. 이전 연구에서 종양이 G4 현금 지급기에서 생성 - / - mTERT ER / ER 동물 4-OHT에서 발표 된; 텔로 머라 고갈에, 종양은 결국 때문에 텔로미어 기능 장애에 의한 체크 포인트 (21)의 복귀로 감소했다. 그러나 응답에 저항을 획득 한 종양의 일부는 텔로미어 (ALT)기구의 대체 길어를 활성화하여 멸종 텔로 머라합니다. 이러한 ALT + 저항하는 종양의 또 다른 특성은 t을 보였다헤이 미토콘드리아 합성과 산화 방어 PGC-1β의 마스터 레귤레이터를 포함하여 미토콘드리아 생물학 및 산화 방어에 관여하는 유전자의 비정상적인 전사가있다. 텔로 머라 아제 + 종양 세포가 21 상대적으로 그대로 유지 유지하면서 PGC-1β 또는 SOD2 (산화 방어의 또 다른 레귤레이터)의 최저 크게 ALT + 종양 세포를 제거합니다. 이 두 노크에 대립 유전자의 한 가지 제한은 텔로 머라 제 유전자의 기본 궤적에 있기 때문에 그들은 단지 내생 수준에서 텔로 머라 아제의 활성화를 감당할 수 있다는 것입니다. 대부분의 인간의 암에서는 텔로 머라 제는 실제로 훨씬 더 높은 수준에서 과발현. 텔로 머라 제의 수준을 향상시키기 위해, 우리는 하나의 변형을 고려할 수는 Rosa26 궤적으로 PGK (포스 포 키나제) 프로모터 강한 프로모터 mTERT-ER 구조체를 삽입하는 것이다. 결론적으로,이 두 소설 유도 쥐의 텔로 머라 제의 대립 유전자는 전례없는 그 가죽을 제공IC 툴은 특히 미리 취득한 텔로미어 장애 유발 게놈 불안정성의 배경하에, 노화 및 조직 항상성뿐만 아니라 종양 진행에 텔로 머라 제의 기능을 연구. mTERT-ER 대립 유전자는 다른 종양 발생하기 쉬운 마우스 모델로 건너 방지 텔로 머라 제 요법을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

텔로 머라 제는 텔로미어 유지 관리를 담당하는 효소이다. 이것은 그들의 무결성을 보호 염색체의 말단 반복 서열이다. 텔로 머라 완전 효소의 핵심 구성 요소는 역전사 효소 촉매 서브 유닛 (TERT) 및 1,2- 텔로미어 반복을 추가하기위한 주형으로 작용 RNA 서브 유닛 (TERC)이다. 일반적으로 분화 된 체세포를 억제하면서, 텔로 머라 제는 강력한 활성을 나타내고, 생식 세포, 암 세포에서 중요한 역할을 담당하고 줄기 세포. mTERC 및 mTERT 녹아웃 마우스는 줄기 세포 및 암 모두에서 텔로 머라 제의 기능을 연구 생체 내 모델 시스템에서 큰 제공한다. mTERC 및 mTERT 쥐 (G1)를 마우스 3 텔로미어의 길이 예약에 의한 명백한 표현형을 보여주지 않았다 녹아웃. 그러나, 직렬 후반 세대 (G5-G6)에 mTERC 및 mTERT 녹아웃 쥐를 intercrossing는 결과결국 진보적 인 텔로미어의 침식과 매우 증식 조직 4의 심각한 퇴보를 불러 일으켰다. 늦은 세대 (G5-G6) mTERC는 - / - 마우스 인해 고환 및 생식 세포 고갈의 세포 사멸의 높은 속도로 불임이다. G5-G6 mTERC는 - / - 마우스는 또한 조직 줄기 / 전구 세포 구획 4의 세포 사멸 및 결함이있는자가 재생 능력의 높은 속도로 골수, 장과 피부를 포함하여 높은 증식 조직에 퇴행성 표현형을 나타낸다. 후반 세대의 골수에서 조혈 줄기 세포 mTERC - / - 마우스 증식 잠재력을 전시 손실, 손상자가 재생 능력, 향상된 세포 사멸하고, 결국 기능 고갈 5,6. - / - 마우스 7,8 마찬가지로, 장 지하실에서 점진적으로 증가 세포 사멸 몸은 G1-G6 mTERC 연속 된 각 세대에서 관찰되었다. 티그 역기능 텔로미어의 악영향이 심각 늦은 세대 (G4-G5)에 손상 시험관 성인 신경 줄기 세포의 증식 및 생체 내에서 신경 모두 보낸 높은 회전율 조직에 한정되는 mTERC을하지 않는 것 - / - 생쥐 9 . 줄기 세포에서 텔로 머라 아제의 역할은 더 어떤면에서는 10, 11 노화 조기 유사한 희귀 한 인간의 유전 질환의 dyskeratosis 선천성 (DKC)의 연구 결과에 의해 지원됩니다. DKC dyskerin는, 코어 텔로 머라 제 서브 유닛과 다른 관련 단백질 12 dyskerin 인코딩 TERC, TERT 돌연변이, 및 유전자에 의해 야기된다. 평균에서, DKC 환자에서 텔로미어는 나이 대조군의 짧은 99 % 이상이다. 질병의 주요한 이환율은 조혈 줄기 세포의 결함에 의해 발생되는 유지 재생 불량성 빈혈에 기인한다. 경구 백반증, 네일 이상증, 정신 retardati 같은 질병의 다른 측면고환 위축과 폐 합병증, 모든 텔로 머라 아제 녹아웃 마우스의 후반 세대에 조직 줄기 세포 및 전구 세포 (10), 그와 가까운 계약의 결과의 기능을 손상하는 것이 좋습니다. DKC 환자는 골수이 형성 증후군 경향이 악성 점막 종양의 증가 유병률이있다. 따라서, 인간 환자에서의 텔로 머라 아제 결핍 늦게 발생 텔로 녹아웃 마우스에서 관찰되는 줄기 세포의 기능 및 종양 소인의 결함을 되풀이. 짧은 텔로미어와 높은 텔로 머라 제 활성이 암의 특징입니다. 정상 또는 전 암성 세포 분열로, DNA 이중 가닥 나누기 (DSBs) (13)에 의해 유발 된 것과 유사한 텔로미어와 휴대 체크 포인트의 활성화의 최종 침식의 낮거나없는 텔로 머라 제 활성 결과. 고전 DSBs처럼 텔로미어 기능 장애는 이러한 노화 및 / 또는 apoptosi 같은 세포 반응을 p53의를 유도하기 위해 표시와 관련 된14, 15를에요. p53의 돌연변이의 불 활성화되면, 세포 순환 및 세포 생존은 전좌 및 지역 증폭 및 삭제 16, 17을 특징으로하는 프로 발암 뮤 테이터 메커니즘을 제공 텔로미어 기능 장애와 세포에서 향상됩니다. 동시에, 텔로미어 기능 장애 (심지어 p53의 널 (null) 세포) 관련 만연 염색체 불안정성을 계속 이러한 암의 전체 악성 진행을 제한 할 것으로 보인다. 예를 들어, 후반 세대 G4-G5 mTERC - / - Ink4a / ARF 파일 - / - 마우스 인해 텔로미어 (telomere)의 감소에 Ink4a / 멍멍 널 쥐에 비해 크게 감소 림프종 발생률을 보였다. 또 다른 연구에서는 G4 ​​mTERT에서 고급 선종 성 병변은 - / - APC 최소 마우스는 크게 인해 상당한 성장 정지 및 세포 사멸 (18, 19)에 APC 분 마우스에 비해 억제되었다.텔로미어 게놈 불안정성을 부전 유도한다는 관찰은 종양 진행이 텔로 머라 제의 활성화는 암 세포 생존 및 / 또는 중화 p53에 의존적 또는 -independent 체크 포인트 메커니즘과 호환 수준으로 게놈 불안정성을 진압에 의해 부분적으로 악성 진행을 가능하게 할 수 있다고 추측 프롬프트를 억제한다. 텔로 머라 아제의 활성화를 중지 또는 줄기 세포의 노화, 역 및 텔로 머라 아제 활성화는 게놈 불안정의 배경으로 종양을 촉진 할 수 있는지 여부를 할 수 있는지 여부를 연구하기 위해, 우리는 두 개의 유도 쥐의 텔로 머라 대립 유전자를 생성합니다. 첫 번째는 4 Hydroxytamoxifen (4-OHT) -inducible TERT-에스트로겐 수용체 (mTERT-ER) 융합 노크에 대립 유전자. 4- OHT의 부재에서 mTERT-ER (지정 mTERT ER / ER)에 대한 동형 접합성 마우스는 텔로 머라 제 활성이 결핍 된 종래 mTERT m 동일 또는 유전 학적 및 세포 표현형의 유지TERC 녹아웃 모델. 4- OHT 처리시 TERT-ER 단백질 활성은 네이티브 TERT 단백질 20, 21과 비교 레벨로 복원 될 수있다. 두 번째 대립 유전자는 신규 한 유도 TERT 노크에서 인트론에 loxP-스토퍼에 loxP 카세트를 함유하는 대립 유전자 (LSL-이고 mTERT); LSL의 절제를 Cre 호텔 - 중재에, mTERT 내생 발현 조절 메커니즘 (22)에서 다시 표현된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Leica AM6000 Micromanipulation Kit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Per quote</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMI6000 B inverted microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Per quote</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>21810031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
			<td>Veterinary Anesthesia Systems</td>
			<td>911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1005796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine-xylazine mixture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K113-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-OHT powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7904-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxfien</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-OHT pellet</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>Custermized</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Trochar (10 Gauge)</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>MP-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wound clip applier</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>01-804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clip</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>01-804-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A-433S4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>22-032-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>F84-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA telomere probe</td>
			<td>Panagene</td>
			<td>F1001-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA centromere probe</td>
			<td>Panagene</td>
			<td>F3003-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X SSC</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP1325-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5636-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber cement</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>Elmer&#39;s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing murine inducible telomerase alleles in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer

텔로미어 노화 동안 조직 변성을 일으킬 노포 드라이버 게놈 무결성과 연관된 DNA 손상 체크 포인트 시그널링 및 응답의 손실이다 부전 유도. 발생률이 크게 연령 증가와 암은, 짧은 텔로미어 길이와 높은 텔로 머라 제 활성을 특징으로한다. 노화와 암의 텔로미어 기능 장애와 텔로 머라 아제 활성화의 역할을 연구하기 위해, 프로토콜은 두 쥐의 유도 텔로 머라 아제를 생성하는 방법을 보여줍니다 노크에 대립 유전자 4 Hydroxytamoxifen (4-OHT) -inducible TERT-에스트로겐 수용체 (mTERT-ER)과 훈제 연어 -Stopper - 훈제 연어 TERT (LSL-mTERT). 이 프로토콜은 텔로미어 기능 장애를 유도하고 생체 내에서 mTERT-ER 및 LSL - mTERT 생쥐에서 텔로 머라 제 활성을 활성화하는 절차에 대해 설명합니다. 대표 데이터는 텔로 머라 제 활성의 활성화가 텔로미어 기능 장애에 의해 유발 된 조직 퇴행성 표현형을 개선 할 수 있음을 보여준다. ORD에서어이 종양에 텔로 머라 아제 활성화의 영향을 결정하기 위해, 우리는 전립선을 생성 종양 모델 G4의 PB-Cre4 PTEN을 L / L p53을 L / L LSL - mTERT L / L 및 흉선 T 세포 림프종 모델 G4 현금 지급기 - / - mTERT ER / ER . 대표적인 데이터는 크게 종양을 향상시킬 수 있습니다 텔로미어 기능 장애에 의해 유발 유전자 불안정성의 배경에 그 텔로 머라 아제의 활성화를 표시합니다. 이 프로토콜은 또한 신경 줄기 세포 mTERT-ER 및 LSL - mTERT 마우스에서 (NSCs의)를 분리하고 체외에서 NSCs의에서 텔로 머라 제 활성을 활성화하는 데 사용되는 절차를 설명합니다. 대표 데이터는 텔로 머라 제의 활성화는 시험 관내에서자가 재생산 능력과 신경을 향상시킬 수 있음을 보여준다. 마지막으로, 프로토콜이 모두 마우스 FFPE에 텔로미어 FISH (제자리 교잡 형광)을 수행하기위한 절차를 설명합니다 (포르말린 고정 및 Paraf핀 임베디드) 뇌 조직 배양 세포의 중기 염색체.

전략은 쥐 mTERT-ER을 생성하고 LSL - mTERT 녹아웃에 대립 그림 1A 및 1B에 설명했다. 특히,에 loxP - 트리플 스토퍼 - 네오는 -에 loxP 단편 LSL - mTERT 대립 유전자를 생성하기 위해 엑손 1 mTERT 궤적의 엑손 2 사이에 삽입되었다. mTERT-ER 대립 유전자를 생성하려면, mTERT 유전자 프레임에서 ERT2-LBD 도메인은 우리가 보여 엑손 1의 N 말단에 삽입하는 텔로 머라 제는 일시적으로 4 4-OHT 펠렛로 처리하여 텔로미어 기능 부전 마우스에 활성화 될 때 주, 퇴행성 표현형은 여러 뇌 (그림 2A)와 같은 기관과 고환 (그림 2B)로 개선 될 수있다. 늦게 발생 G4 LSL-mTERT mTERT 및 G4에서 생체 외에서 배양 된 세포의 텔로 머라 제의 활성화에 미치는 영향을 결정하기 위해, 우리는 절연 신경줄 기세포 (NSCs의)-ER 마우스. 우리는 텔로 머라 아제가 텔로미어 기능 장애 NSCs의 재 활성화 될 때, NSCs의자가 재생산 능력이 크게 유의하게 (그림 3B) 강화되었다 (그림 3A)를 증가 및 체외 신경에 된 것으로 나타났다. 텔로미어 부전의 맥락에서 종양 발생에 텔로 머라 제 활성화에 미치는 영향을 결정하기 위해 우리가 생성 PB-Cre4 PTEN을 L / L에서의 p53 L / L의 LSL-mTERT L / L (전립선 암 모델) 및 ATM - / - mTERT ER / ER (흉선 T 세포 림프종 모델) 늦게 발생 코호트. 텔로 머라 제는 8주 (도 4B)에 대한 분사를한다 (도 4A) 또는 4-OHT 펠렛 이들 마우스에서 타목시펜 처리에 의해 활성화 된 경우, 종양은 크게 두 전립선 암 모델 (도 4a)과 흉선의 T 세포 림프종 모델에서 향상시켰다 ( <strong&gt; 그림 4B). 마지막으로, 우리는 FFPE 마우스 뇌 조직에 텔로미어 FISH을 수행하는 프로토콜 (그림 5)와 중기 염색체 (그림 5, 삽입)을보고했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig1.jpg" /> 그림 1 : (A) mTERT-ER 노크에 전략을. 벡터를 대상으로 TV,; WT, 야생형 대립 유전자; KI, 노크에 대립 유전자; LA, 왼쪽 팔; RA, 오른쪽 팔; E1, 엑손 1; E2, 엑손 2; 신, PGK의 네오 마이신 내성 유전자를 프로모터 중심; ER, 수정 에스트로겐 수용체 (ERT2) 리간드 결합 도메인; DT, dyphteria 독소 유전자. (B) LSL-mTERT 노크의 전략. 벡터를 대상으로 TV,; WT, 야생형 대립 유전자; KI, 노크에 대립 유전자; LA, 왼쪽 팔; RA, 오른쪽 팔; E1, 엑손 1; E2, 엑손 2; 신, PGK의 네오 마이신 내성 유전자를 프로모터 중심; 스토퍼, 세 반복적 전사 정지 시퀀스; DT, dyphteria 독소 유전자. <pFO 클래스 = &quot;jove_content&quot;유지 - together.within 페이지 = &quot;항상&quot;&gt; <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig2.jpg" /> 그림 2 : 대표 데이터가 텔로 머라 아제 활성화를 표시하는이 기관의 퇴행성 표현형을 완화시키는 뇌의 대표 이미지 (왼쪽). 및 고환 (오른쪽) 위약 또는 4 주 동안 4 OHT으로 처리 G0와 G4 mTERT-ER 마우스. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. 다시 인쇄 (20)의 허가. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52599/52599fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig3.jpg" /> 그림 3 :. 대표 데이터가 텔로 머라 아제 활성화를 표시하는 자기 갱신과 체외에서 신경 줄기 세포의 신경을 ​​강화 (A) 신경 줄기 세포의 대표 이미지G4의 LSL - mTERT에서 분리 S (상판) 및 G4 mTERT-ER (하판) 차량 또는 4-OHT 치료 줄기 세포 매체에서 성장. (B) 분화 배지에서 배양 G4 mTERT-ER로부터 단리 신경 줄기 세포의 시험 관내 신경 (Tuj1 +)의 대표적인 이미지는 (1 % FBS 포함) 차량 또는 4-OHT으로 처리 하였다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig4.jpg" /> 그림 4 :. 텔로 머라 아제의 활성화를 보여주는 대표적인 데이터가 게놈 불안정의 배경으로 종양을 향상 (A) / L p53을 L / L LSL - mTERT G0 PB-Cre4 PTEN을 L 해부 전립선 종양의 대표 이미지 +/-, G4 솔더 (Soler) Cre4 PTEN을 L / L p53을 L / L의 LSL - mTERT- / -, 및 G4 PB-Cre4 PTEN을 L / L p53을의 L은 / L LSL - mTERT L / L 타목시펜으로 치료. (22) 허가를 다시 인쇄 할 수 있습니다. (B) G0 기압의 해부 흉선의 T 세포 림프종의 대표적인 이미지 - / - mTERT + / ER, G4 현금 지급기 - / - mTERT ER / ER 차량으로 처리하고 G4 현금 지급기 - / - mTERT ER / ER 4- 처리 팔주에 대한 OHT. 스케일 바는 1cm를 나타냅니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig5.jpg" /> 그림 5 : FFPE 마우스 뇌 조직과 중기 (삽입)에 텔로미어와 센트로 FISH의 대표 이미지. 빨간색 녹색 텔로미어 (telomere) 염색을 나타냅니다, DNA를 나타내고, 시안은 CE를 나타냅니다ntromere 염색. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다.

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Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer.

조직의 변성 / 재생 및 암의 연구에서 설치류 유도 성 텔로 머라 대립 유전자를 활용

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that ...

utilizing-murine-inducible-telomerase-alleles-studies-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

9.9K 조회수.  UT MD Anderson Cancer Center. Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer. 

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A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

Murine 아일릿 절연 및 Subcapsular 신장 이식을위한 방법

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

연구

의학

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Murine 방광 암의 Orthotopic 모델

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1/PD-L1, a member of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important role in the negative regulation of cell-mediated immune responses through its interaction with its receptor, programmed death-1 (PD-1) 1,2. Overexpression of B7-H1 by tumor cells has been noted in a number of human cancers, including melanoma, glioblastoma, and carcinomas of the lung, breast, colon, ovary, and renal cells, and has been shown to impair anti-tumor T-cell immunity3-8.
Recently, B7-H1 expression by pancreatic adenocarcinoma tissues has been identified as a potential prognostic marker9,10. Additionally, blockade of B7-H1 in a mouse model of pancreatic cancer has been shown to produce an anti-tumor response11. These data suggest the importance of B7-H1 as a potential therapeutic target. Anti-B7-H1 blockade antibodies are therefore being tested in clinical trials for multiple human solid tumors including melanoma and cancers of lung, colon, kidney, stomach and pancreas12.
In order to eventually be able to identify the patients who will benefit from B7-H1 targeting therapies, it is critical to investigate the correlation between expression and localization of B7-H1 and patient response to treatment with B7-H1 blockade antibodies. Examining the expression of B7-H1 in human pancreatic adenocarcinoma tissues through immunohistochemistry will give a better understanding of how this co-inhibitory signaling molecule contributes to the suppression of antitumor immunity in the tumor's microenvironment. The anti-B7-H1 monoclonal antibody (clone 5H1) developed by Chen and coworkers has been shown to produce reliable staining results in cryosections of multiple types of human neoplastic tissues4,8, but staining on paraffin-embedded slides had been a challenge until recently13-18. We have developed the B7-H1 staining protocol for paraffin-embedded slides of pancreatic adenocarcinoma tissues. The B7-H1 staining protocol described here produces consistent membranous and cytoplasmic staining of B7-H1 with little background.

Immunohistochemical Staining of B7-H1 PD-L1 on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1 (PD-L1) and its binding to PD-1 provide a major tumor-induced immunosuppressive signal in the tumor&#x2019;s microenvironment. An immunohistochemical staining technique to characterize the expression and localization of B7-H1 in pancreatic adenocarcinoma is described here.

췌장 선암 조직의에서 B7-H1의 Immunohistochemical 착색 (PD-L1) 파라핀은 - 임베디드 슬라이드

B7-H1/PD-L1, a member  of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important  role in the negative regulation of cell-mediated ...

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, murine pancreatic tumor model of hepatic metastases via a hemispleen injection of syngeneic murine pancreatic tumor cells is described. This model mimics many of the clinical conditions in patients with metastatic disease to the liver. Mice consistently develop metastases in the liver allowing for investigation of the metastatic process, experimental therapy testing, and tumor immunology research.

A preclinical, murine model of hepatic metastases performed via a hemispleen injection technique.

간 전이의 전임상 쥐과 모델

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

<em&gt; 체외</em&gt; 골수에서 에스트로겐에 민감한 유방암의 휴면 모델 : 분자 메커니즘 연구 및 가설 생성을위한 도구

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant ...

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible animal models mirror common components of human disease, including the bm12 transfer model. Upon transfer of bm12 splenocytes or purified CD4 T cells, C57BL/6 mice rapidly develop large frequencies of T follicular helper cells (Tfh), germinal center (GC) B cells, and plasma cells followed by high levels of circulating anti-nuclear antibodies. Since this model utilizes mice on a pure C57BL/6 background, researchers can quickly and easily study disease progression in transgenic or knockout mouse strains in a relatively short period of time. Here we describe protocols for the induction of the model and the quantitation Tfh, GC B cells, and plasma cells by multi-color flow cytometry. Importantly, these protocols can also be used to characterize disease in most mouse models of SLE and identify Tfh, GC B cells, and plasma cells in other disease models.

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus SLE in C57BL/6 Mice

The transfer of bm12 lymphocytes into a C57BL/6 recipient is an established model of systemic lupus erythematosus. Here we describe how to initiate disease using this model and how to characterize T follicular helper cells, germinal center B cells and plasma cells by flow cytometry.

C57BL / 6 마​​우스의 전신 홍 반성 루푸스의 BM12 유도 성 모델 (SLE)

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

인간의 전립선 암의 전 임상 동소 이식 쥐 모델

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause severe problems, such as abdominal cramping, bloody diarrhea, and weight loss, in affected individuals. Unfortunately, there is no cure yet, and treatments only aim to alleviate symptoms. Current treatments include anti-inflammatory and immunosuppressive drugs that may cause severe side effects. This warrants the search for alternative treatment options, such as nutritional supplements, that do not cause side effects. Before their application in clinical studies, such compounds must be rigorously tested for effectiveness and security in animal models. A reliable experimental model is the dextran sulfate sodium (DSS) colitis model in mice, which reproduces many of the clinical signs of ulcerative colitis in humans. We recently applied this model to test the beneficial effects of a nutritional supplement containing vitamins C and E, L-arginine, and &#969;3-polyunsaturated fatty acids (PUFA). We analyzed various disease parameters and found that this supplement was able to ameliorate edema formation, tissue damage, leukocyte infiltration, oxidative stress, and the production of pro-inflammatory cytokines, leading to an overall improvement in the disease activity index. In this article, we explain in detail the correct application of nutritional supplements using the DSS colitis model in C57Bl/6 mice, as well as how disease parameters such as histology, oxidative stress, and inflammation are assessed. Analyzing the beneficial effects of different diet supplements may then eventually open new avenues for the development of alternative treatment strategies that alleviate IBD symptoms and/or that prolong the phases of remission without causing severe side effects.

Current treatments of inflammatory bowel diseases (IBD) aim at alleviating disease symptoms but may cause severe side effects. Thus, alternative strategies are being investigated in animal colitis models. Here, we explain how the beneficial effects of diet supplements on clinical IBD signs are analyzed in such a colitis model.

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority of the practical and technical details are commonly omitted in published manuscripts which, therefore, makes it challenging to reproduce the models, particularly when it involves surgical techniques. Bioluminescence technology allows for the evaluation of small amounts of cancer cells even when a tumor is not palpable. Utilizing luciferase-expressing cancer cells, we establish a breast cancer orthotopic inoculation technique with a high tumorigenesis rate. Lung metastasis is assessed utilizing an ex vivo technique. We, then, establish a mastectomy model with a low local recurrence rate to assess the metastatic tumor burden. Herein, we describe, in detail, the surgical techniques of orthotopic implantation and mastectomy for breast cancer with a high tumorigenesis rate and low local recurrence rates, respectively, to improve breast cancer model efficiency.

We introduce a murine orthotopic breast cancer model and radical mastectomy model with bioluminescence technology to quantify the tumor burden to mimic human breast cancer progression.

Murine Orthotopic 전이성 유방암 암 모델을 생성 하 고 수행 Murine 과격 한 유 방 절제술

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

파라핀 내장 된 조직에서 인간과 뮤린 호중구 세포 외 트랩의 면역 형광 라벨링

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...