이 프로토콜은 연구자들이 심장 독성 스크리닝에서 hiPSC-CM의 예측 가치를 크게 향상시키는 성인과 유사한 표현형으로 상업용 또는 사내 제작 hiPSC-CM을 성숙시킬 수 있게 해주기 때문에 중요합니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 칼슘 또는 전압 변화의 광학 매핑을 위해 고처리량 형식으로 성숙한 hiPSC-CM을 제공한다는 것입니다. 이 프로토콜은 질병 메커니즘을 조사하거나 심장 독성에 대한 약물을 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구원 인 Jeffrey Creech가 될 것입니다. 심근 세포 도금 1 시간 전에 200 마이크로 리터의 행크 균형 염 용액 (HBSS)으로 성숙 유도 세포 외 기질 (MECM) 플레이트를 두 번 세척하는 것으로 시작하십시오. 우물에 수분을 공급하십시오.
액체 질소 탱크에서 드라이 아이스로 심근 튜브를 옮기고 튜브 캡을 살짝 열어 압력을 해제합니다. 그런 다음 튜브 캡을 다시 밀봉하고 수조에서 4분 동안 해동합니다. 세포를 해동한 후 튜브를 열기 전에 튜브에 70% 에탄올을 뿌립니다.
1 밀리리터 피펫을 사용하여 세포를 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 극저온 혼합물에 1 밀리리터의 도금 매체를 첨가하고 세척액을 15 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 1 밀리리터의 도금 매체를 천천히 떨어 뜨리고 튜브를 저어줍니다.
8 밀리리터의 도금 매체가 옮겨 질 때까지 이것을 반복하십시오. 15 밀리리터 튜브를 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리하고 도금 매체 1 밀리리터에 펠릿을 재현탁합니다. 분취량을 제거하고, 도금 배지를 첨가하기 전에 혈구계로 살아있는 세포 계수를 수행하여 밀리리터당 7.5 x 10 내지 5번째 세포를 얻었다.
MECM-코팅된 96-웰 플레이트의 웰 당 100 마이크로리터의 세포 현탁액을 멀티채널 피펫을 사용하여 분주하고, 세포를 2일 동안 인큐베이션하였다. 다음으로, 배지를 200 마이크로리터의 유지 배지로 교체하고, 플레이트를 7일 동안 유지하고, 5일째에 배지를 교체한다. 7일째에 텍스트에 설명된 대로 EP 분석을 수행합니다.
세포 배양 연장을 선택할 때 격일로 배지를 교체해야 합니다. 자기 활성화 세포 분류(MACS)를 통해 hiPSC-CM을 정제하려면 세포 배양 배지를 흡인하고 1밀리리터의 HBSS로 세포를 세척한 다음 1밀리리터의 0.25% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산 또는 EDTA를 추가하여 세포를 해리하고 세포를 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 2밀리리터의 도금 매체로 세포를 재전송하고 특이화하여 트립신/EDTA를 비활성화합니다.
6개의 웰에서 70마이크로미터 스트레이너를 사용하여 50밀리리터 원추형 튜브에 세포를 수집합니다. 3 밀리리터의 도금 매체로 여과기를 세척 한 후 세포를 세십시오. 계수 후, 펠릿화하기 전에 세포 펠릿을 2밀리리터의 얼음-차가운 MACS 분리 완충액으로 원심분리하고 세척하고, 세포를 5 x 10 당 80마이크로리터의 차가운 MACS 분리 완충액으로 6번째 세포로 재전송한다.
차가운 비 심근 세포 고갈 칵테일 20 마이크로 리터를 추가하고 10 분 동안 얼음에서 배양하기 전에 현탁액을 혼합하십시오. 세포를 300 x g에서 5분 동안 4 밀리리터의 차가운 MACS 분리 완충액으로 세척한 후, 펠릿을 80 마이크로리터의 차가운 MACS 분리 완충액에 재현탁시킨다. 5 x 10 당 20 마이크로 리터의 차가운 안티 비오틴 마이크로 비드를 6 번째 세포에 넣고 10 분 동안 얼음에서 배양하기 전에 세포 현탁액을 부드럽게 혼합합니다.
샘플이 배양되는 동안 MACS 분리기에 30마이크로미터 사전 분리 필터가 장착된 포지티브 공핍 컬럼을 배치하고 라벨이 부착된 15밀리리터 수집 튜브를 컬럼 아래에 놓습니다. 다음으로, 3밀리리터의 콜드 MACS 분리 버퍼로 각 컬럼을 프라이밍합니다. 항체 처리된 세포 현탁액을 2밀리리터의 MACS 분리 완충액과 혼합하고 컬럼에 추가합니다.
각 컬럼에 2 밀리리터의 MACS 분리 완충액을 첨가하고 12 밀리리터의 유동 심근 세포 현탁액을 수집한다. 심근 세포를 원심 분리하고 상층액을 버리고 심근 세포를 1 밀리리터 도금 매체에 재현 탁시킵니다. 농도를 결정하기 위해, 정제된 심근세포 세포를 MECM 96-웰 플레이트 상에 플레이팅하기 전에 세포를 계수하고 원하는 파종 밀도로 부피를 조정한다.
심근 세포 유지 배지를 96웰 플레이트의 웰당 100마이크로리터의 전압에 민감한 염료(VSD) 또는 칼슘에 민감한 형광단(CSF)으로 흡인하고 교체합니다. 30분 배양 후 염료를 분석 배지 또는 HBSS로 교체합니다. 고처리량 광학 매핑 장치를 사용하여 기본 데이터 광학 매핑을 획득하기 전에 섭씨 37도에서 셀을 평형화합니다.
급성 노출 테스트를 위해 약물을 사용하여 세포를 처리하거나 관심 약물에 만성적으로 노출된 세포를 매핑하려면 약물을 디메틸 설폭사이드(DMSO)로 희석하고 섭씨 20도에서 원액으로 저장한 후 HBSS에서 원하는 농도로 희석합니다. 96 웰 플레이트에서 심장 독성 테스트를 위해 용량 당 최소 8 웰이있는 화합물을 4 회 추가합니다. 유효 용량을 포함하여 임상적으로 효과적인 치료 혈장 농도 아래에서 위 범위의 용량을 사용하십시오.
약물 적용 전 기본 전기생리학 측정과 유사하게 만성 연구를 위해 약물 치료 후 최소 30분 후에 전기생리학 기록을 캡처합니다. 기준선 기록 후, 용량당 최소 8웰로 GCaMP6m을 발현하는 성숙한 hiPSC-CMs 단층에 각 약물을 최소 4회 투여합니다. 30분 동안 세포에서 약물을 평형화하고 데이터 수집 전과 도중에 세포를 섭씨 37도까지 따뜻하게 합니다.
전체 플레이트의 기준선 기록에 따라 모든 웰에 500나노몰 이소프로테레놀을 추가하여 강력한 약물 반응 데이터를 가능하게 하고 단층 박동률, 수축 진폭 및 칼슘 과도 기간에 대한 이소프로테레놀의 효과를 정량화합니다. 광학 매핑 데이터를 수집하려면 전면 서랍을 열고 플레이트 히터에 플레이트를 배치합니다. 수집 소프트웨어를 열고 소프트웨어에서 파일 저장 위치를 결정한 후, 더 높은 시간 해상도를 위해 10-30초의 지속 시간과 수집 프레임 속도를 선택하고 수집 시작을 클릭합니다.
해석 소프트웨어를 열고 필터 가져오기 탭에서 단일 파일 찾아보기 또는 다중 타일을 선택하여 플레이트를 재구성합니다. 파일을 선택하고 행과 열 수를 입력한 후 자동을 선택합니다. 그런 다음 픽셀 크기 업데이트를 선택하고 픽셀당 거리를 입력한 다음 Well Wizard를 사용하여 이미지에서 웰의 위치를 확인한 후 저장 처리를 클릭하고 다음 탭으로 이동합니다.
ROI 또는 관심 영역 탭을 열고 ROI를 수동, 자동으로 그리거나 ROI를 전혀 사용하지 않도록 선택하여 전체 플레이트 분석에 고려됩니다. 웰에서 영역을 선택한 후 저장 처리 버튼을 클릭하여 다음 단계로 이동합니다. 웰 숨기기 및 필터링된 항목만 표시 상자를 선택하여 ROI를 시각화합니다.
분석 탭을 열고 각 웰 또는 ROI를 선택하여 자동 박동 감지의 정확성을 확인합니다. 개별 비트를 선택하고 키보드에서 Delete 키를 눌러 추적에서 비트를 추가하거나 제거합니다. 완료되면 저장을 클릭합니다.
그런 다음 분석 탭에서 시공간 플롯 버튼을 클릭하고 각 웰 또는 ROI에 대한 데이터를 시각화하기 위한 시공간 플롯을 결정하는 선을 추가합니다. 수평선 또는 수직선을 선택한 후 플롯 생성을 클릭합니다. 정확한 비트 감지를 확인한 후 내보내기 탭으로 이동하여 파일 형식을 선택하고 내보내기를 클릭하기 전에 비트 통계 옵션을 입력합니다.
내보낸 후 데이터 파일을 열고 선택한 통계 분석 루틴을 실행합니다. 위상차 이미징은 MECM에 도금된 hiPSC-CM이 성숙하고 마우스 ECM에 재도금된 동일한 배치의 hiPSC-CM과 구조적으로 구별되는 것으로 나타났습니다. 성숙한 세포는 막대 모양이 된 반면 미성숙 세포는 원형을 유지했습니다.
알파-액티닌 항체로 염색된 심근세포는 각 ECM 조건에서 배양된 세포의 전형적인 형태를 나타내었다. TnI 염색과 일치하게, 알파-액티닌 염색은 MECM에서 성숙한 hiPSC-CM이 막대 모양의 성숙 표현형을 촉진하고 더 큰 육종 조직을 유도했음을 나타냅니다. 미토콘드리아 함량 및 활성은 마우스 ECM과 MECM에서 배양된 세포 간에 구별되었다.
VSDs 및 광학 매핑 시스템을 사용하여 기록된 활동 전위에 대한 전기생리학적 데이터는 심방 특이적 세포가 심실 특이적 세포보다 훨씬 더 빠른 자발적 박동 속도와 더 짧은 활동 전위 지속 시간(APD80)을 갖는 것으로 나타났습니다. APD80과 같은 매개변수에 대한 전체 플레이트 히트 맵은 플레이트 내에서 주어진 매개변수의 재현성을 보여주었습니다. 성숙한 hiPSC-CM 단층의 전형적인 활동 전위는 분리되고 테스트된 성인 심근 세포의 활동 전위 형태를 나타냅니다.
전형적인 활동 전위 자발적인 리듬도 표시되었습니다. 이소프로테레놀에 대한 반응으로, 베타-1-아드레날린성 수용체의 활성화는 양성 크로노트로피, 양성 수축성 및 양성 윤활성을 유발하였다. E-4031, 돔페리돈, 반데타닙 및 소탈롤을 포함한 인간 Ether-a-go-go-go-관련 유전자 또는 hERG, 채널 차단제에 대한 HiPSC-CM 반응은 리듬을 모니터링하기 위해 GCaMP6m 칼슘 형광을 사용하여 연구되었습니다.
이 연구는 E-4031 hERG 채널 차단으로 인한 초기 탈분극의 검출을 보여주었습니다. 현탁액에 있는 세포로 빠르게 작업하고 세포를 부드럽게 피펫팅하여 전단 응력을 피하십시오. 또한 hiPS syncytia가 손상되지 않도록 조심스럽게 미디어 교체를 수행하십시오.
이 절차에 따라 세포는 연구자가 선호하는 기술로 분석하기 위해 단백질, RNA, DNA 및 지질 수집에 적합합니다. 이 기술을 통해 연구자들은 성인과 같은 심근 세포를 사용하여 질병을 조사하고 신약의 심장 독성을 테스트 할 수 있습니다.
