This work was supported by the following funding sources: R01-AR063649, AG-020591, F31-AR035931.

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	<li>Mendias, C. L., Kayupov, E., Bradley, J. R., Brooks, S. V., Claflin, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+specific+force+and+power+production+of+muscle+fibers+from+myostatin-deficient+mice+are+associated+with+a+suppression+of+protein+degradation.">Decreased specific force and power production of muscle fibers from myostatin-deficient mice are associated with a suppression of protein degradation.</a> J Appl Physiol. 111 (1), 185-191 (2011).</li><li>Gumucio, J. P., Davis, M. E., Bradley, J. R., Stafford, P. L., Schiffman, C. J., Lynch, E. B., Claflin, D. R., Bedi, A., Mendias, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotator+cuff+tear+reduces+muscle+fiber+specific+force+production+and+induces+macrophage+accumulation+and+autophagy.">Rotator cuff tear reduces muscle fiber specific force production and induces macrophage accumulation and autophagy.</a> J Orthop Res. 30 (12), 1963-1970 (2012).</li><li>Mendias, C. L., Roche, S. M., Harning, J. A., Davis, M. E., Lynch, E. B., Sibilsky Enselman, E. r., Jacobson, J. A., Claflin, D. R., Calve, S., Bedi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+muscle+fiber+force+production+and+disrupted+myofibril+architecture+in+patients+with+chronic+rotator+cuff+tears.">Reduced muscle fiber force production and disrupted myofibril architecture in patients with chronic rotator cuff tears.</a> J Shoulder Elbow Surg. 1 (4), 111-119 (2015).</li><li>Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarcomere+length-tension+relations+of+frog+skinned+muscle+fibres+during+calcium+activation+at+short+lengths.">Sarcomere length-tension relations of frog skinned muscle fibres during calcium activation at short lengths.</a> J Physiol. 292, 177-192 (1979).</li><li>Chase, P. B., Kushmerick, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+pH+on+contraction+of+rabbit+fast+and+slow+skeletal+muscle+fibers.">Effects of pH on contraction of rabbit fast and slow skeletal muscle fibers.</a> Biophys J. 53, 935-946 (1988).</li><li>Moisescu, D. G., Thieleczek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+strontium+concentration+changes+within+skinned+muscle+preparations+following+a+change+in+the+external+bathing+solution.">Calcium and strontium concentration changes within skinned muscle preparations following a change in the external bathing solution.</a> J Physiol. 275, 241-262 (1978).</li><li>Walker, S. M., Schrodt, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I+Segment+lengths+and+thin+filament+periods+in+skeletal+muscle+fibers+of+the+Rhesus+monkey+and+the+human.">I Segment lengths and thin filament periods in skeletal muscle fibers of the Rhesus monkey and the human.</a> Anat Rec. 178, 63-81 (1974).</li><li>Gollapudi, S. K., Lin, D. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+high+and+low-velocity+resistance+training+on+the+contractile+properties+of+skeletal+muscle+fibers+from+young+and+older+humans.">Effects of high and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans.</a> J Appl Physiol. 111, 1021-1030 (2011).</li><li>Lynch, G. S., Faulkner, J. A., Brooks, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+deficits+and+breakage+rates+after+single+lengthening+contractions+of+single+fast+fibers+from+unconditioned+and+conditioned+muscles+of+young+and+old+rats.">Force deficits and breakage rates after single lengthening contractions of single fast fibers from unconditioned and conditioned muscles of young and old rats.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295, C249-C256 (2008).</li><li>Frontera, W. R., Rodriguez Zayas, A., Rodriguez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+of+human+muscle:+understanding+sarcopenia+at+the+single+muscle+cell+level.">Aging of human muscle: understanding sarcopenia at the single muscle cell level.</a> Phys Med Rehabil Clin N Am. 23, 201-207 (2012).</li><li>Malisoux, L., Francaux, M., Theisen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+do+single-fiber+studies+tell+us+about+exercise+training.">What do single-fiber studies tell us about exercise training.</a> Med Sci Sports Exerc. 39 (7), 1051-1060 (2007).</li><li>Widrick, J. L., Stelzer, J. E., Shoepe, T. C., Garner, D. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+velocity+of+unloaded+shortening+and+its+relation+to+sarcomere+length+and+isometric+force+in+vertebrate+muscle+fibres.">The velocity of unloaded shortening and its relation to sarcomere length and isometric force in vertebrate muscle fibres.</a> J Physiol. 291, 143-159 (1979).</li><li>Brenner, B., Eisenberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+force+generation+in+muscle:+Correlation+with+actomyosin+ATPase+activity+in+solution.">Rate of force generation in muscle: Correlation with actomyosin ATPase activity in solution.</a> PNAS. 83, 3542-3546 (1986).</li><li>Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+calcium+on+the+maximum+velocity+of+shortening+in+skinned+skeletal+muscle+fibres+of+the+rabbit.">The effect of calcium on the maximum velocity of shortening in skinned skeletal muscle fibres of the rabbit.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 3, 295-311 (1982).</li><li>Pate, E., Wilson, G. J., Bhimani, M., Cooke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+dependence+of+the+inhibitory+effects+of+orthovanadate+on+shortening+velocity+in+fast+skeletal+muscle.">Temperature dependence of the inhibitory effects of orthovanadate on shortening velocity in fast skeletal muscle.</a> Biophys J. 66, 1554-1562 (1994).</li><li>Ashley, C. C., Moisescu, D. 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Dependence on magnesium adenosine triphosphate concentration.</a> J Gen Physiol. 63, 722-739 (1974).</li><li>Fabiato, A., Fabiato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculator+programs+for+computing+the+composition+of+the+solutions+containing+multiple+metals+and+ligands+used+for+experiments+in+skinned+skeletal+muscle+cells.">Calculator programs for computing the composition of the solutions containing multiple metals and ligands used for experiments in skinned skeletal muscle cells.</a> Journal de Physiologie (Paris). 75, 463-505 (1979).</li><li>Chase, P. B., Kushmerick, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+physiological+ADP+concentrations+on+contraction+of+single+skinned+fibers+from+rabbit+fast+and+slow+muscles).">Effect of physiological ADP concentrations on contraction of single skinned fibers from rabbit fast and slow muscles).</a> Am J Physiol. 268, C480-C489 (1995).</li><li>Godt, R. E., Maughan, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swelling+of+skinned+muscle+fibers+of+the+frog.">Swelling of skinned muscle fibers of the frog.</a> Biophysical Journal. 19, 103-116 (1977).</li><li>Kawai, M., Wray, J. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+sarcomere+length+on+the+force-pCa+relation+in+fast+and+slow-twitch+skinned+muscle+fibres+from+the+rat.">Effects of sarcomere length on the force-pCa relation in fast and slow-twitch skinned muscle fibres from the rat.</a> J Physiol. 333, 637-653 (1982).</li></ol>

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투과성이 하나의 골격근 섬유의 수축 특성의 평가는 광범위한 맥락에서 근육 기능을 조사하기 위해 사용된다. 예를 들면 노화 (12)의 효과를 평가 한 연구, 10,13,14 운동, 우주 비행 15, 부상 2,3,16, 약물 치료 17, 18, ​​질병 (19)과 섬유의 구조와 기능에 유전자 조작 (20, 21)를 포함한다. 때문에 직접 자신의 고유 구성에 근원 섬유의 수축 성능을 평가하는 능력,이 기술은 존재하는 잠재적 교란 효과의 근원 섬유 기능의 부재에 대한 이해를 형성하기에서 매력적인 플랫폼을 제공 할 때 신경 근육 신호 전송 및 여기에 의한 칼슘 방출 연구 대상 시스템에 포함되어 있습니다. 또한, 단 섬유의 기능 시험은 이러한 것과 수축성 단백질 식별 결과를 보완하기 위해 사용될 수있다면역 조직 화학 또는 겔 전기 + 웨스턴 블롯 (22)를 통해 얻을. 골격근의 주요 기능 중 하나는 힘을 발생하는 것이다. 따라서 SF 오, 수축 시스템의 본질적인 힘 생성 능력의 측정, 근육 생리학에 중대한 관심사이다. SF 오의 신뢰성 평가는 섬유 CSA와 F 오 양의 정확한 측정이 필요합니다. 섬유이기 때문에 CSA를 추정 할 때, 일반적으로, 그 길이를 따라 단면적도 단면 원형 없으며, 유니폼, 큰주의를 기울여야합니다. 이를 위하여, 측정은 90 °로 분리 된 두 가지 관점에서, 각 위치에서, 섬유의 길이를 따라 여러 위치에서 실시하고있다. F 오 신뢰성 대책 칼슘 농도 t와 활성 용액을 이용하는, 두껍고 얇은 필라멘트의 오버랩을 최대화하기 근절 길이를 조정하는, 수동적 인 힘 차지 등 여러 세부 사항에주의를 필요최대 활성화 모자 결과, 원하는 실험 온도를 유지하고, 실험 하루 전에 섬유의 최적 보관 조건 (온도 및 시간)을 유지. 여기에 설명 된 단계는 최대 메트릭 힘을 평가하기위한 절차를 설명하는 반면, 골격근 섬유의 다른 중요한 기능적인 특성을 평가하기 위해 종종 바람직하다. 이것은 섬유의 기계적 조작을 추가로 포함하는 실험 프로토콜을 확장함으로써 달성 될 수있다. 예를 들어, 섬유는 상이한 부하에 대해 일련의 단축되는 속도의 측정 력 파워와 속도 파워 10,23,24 관계를 산출 할 수있는 힘의 속도 관계의 판정을 허용한다. 또한, 언로드 된 쇼트닝의 ​​속도는 슬랙 유도 단축 단계 및 measuri 일련인가 이루어져 &quot;슬랙 테스트&quot;(25)을 이용하여 결정될 수있다섬유에 의해 요구되는 시간은 ng를 슬랙을 제거한다. 자주보고 또 다른 운동 매개 변수는 K TR, 일시적으로 모두 분리 기계 섭동 다음 힘 재개발에 대한 속도 상수 (26) crossbridges입니다. 마지막으로, 칼슘 농도 및 활성 구동력 발생 ( &quot;힘 PCA 관계&quot;) 사이의 관계는 관심 18 종종이고 임계치 아래에서 수축을 활성화하기위한 레인 징 칼슘 농도 용액의 일련의 광 노출에 의해 결정될 수있다 그 충분한에 시스템은 최대 활성화 따라서 최대 힘 (F O를) 유도합니다. 언급 된 장비의 대부분이 단일 섬유 수축력을 평가하기위한 필요하지만, 다른 장비가 절대적으로 필요하지 않습니다. 길이 제어부는, 예를 들어, 섬유의 신속한 또는 정확한 연장 또는 단축이 필요한 실험 프로토콜에 필수적인하지만 (힘 레코드의 제로 힘 수준이 여전히 몇 가지 방법으로 확인해야하지만) 최대 아이소 메트릭 힘을 평가하는 절대적으로 필요하지 않습니다. 실험 챔버 내에 섬유를 배치 할 때, 단면 영역을 평가하는 동안 유용한 측으로부터 섬유의 관찰을 허용 프리즘은, 반드시 필요하지 않다. 또한, 다른 대안은 챔버 또는 급속 충전을 가능하게 단일 챔버의 수동식 시스템 고안 및 솔루션 비우는 포함한 사용될 수있는 다양한 실험 용액에 섬유를 노출하기위한 수단을 포함한다. 예컨대 15 ° C로서 서브 생리 실험 온도는 일반적으로 기계적 1,2,3,5,8,12,17,27 측정의 재현성을 향상시키기 위해 사용하는 동안 마지막으로, 다른 온도 23 유효 데이터를 생성 할 수있다 솔루션의 특성에 대한 온도 (칼슘 농도, 산도 등)의 영향으로 28 한 고려된다. </P&gt; 시험 용액의 조성물은 여기에 기재된 광 투과성이 기술의 가장 중요한 측면들이다. 용액 조성물에 관한 고려가 복잡하고이 문서의 범위를 벗어납니다. 프로토콜 섹션의 5 단계에서 설명하는 솔루션은 일정한 이온 강도, 양이온 성분 및 삼투압 6,29을 유지하면서 솔루션을 활성화로 미리 활성화로부터 전송시 투과성이 섬유의 빠른 활성화에 중점을두고 설계되었습니다. 용액 조성물에 다른 방법은 다른 연구 그룹에서 주목할만한 성공을 사용하고 일반적으로 공개 바인딩 상수 및 계산 도구 27,30,31 활용되어왔다. 다양한 활성화 용액에 칼슘 이온의 농도는 힘 - PCA 평가로서 준 최대 활성화와 관련된 연구에 중요하다. 이러한 것과 같은 섬유가 완전히 활성화되는 실험 들어 설명D 여기서, 활성 용액 중의 칼슘 농도는 통상적으로 그것의 정확한 지식은 덜 중요하게, 최대 힘을​​ 달성하기 위해 필요한 마진에 의해 편안하게 초과한다. 크레아틴 인산의 첨가는 달리 수축 활성과 연관 될 것이다 intramyofibrillar ATP와 ADP의 변동을 버퍼링 중요하다. 크레아틴 키나제가 ADP에 크레아틴 인산으로부터 포스페이트 전달을 촉진 할 필요가있다. 고온에서 작동 또는 빨리 섬유 (32)에 고속 단축 측정 포함한 높은 ATP 회전율, 결과 실험 조건 하에서, 크레아틴 키나제는 섬유에 결합 된 유지 내인성 크레아틴 키나아제를 보충 용액에 첨가되어야한다. 덜 까다로운 실험 조건 들어, ATP 재생 시스템 (27)은 덜 중요하다. 투과성이 단일 섬유 기술의 한계는 다음과 같습니다. 이러한 테스트에 의해 생성 된 데이터를 정의실험 장치에 부착 된 특정 근원 섬유 단위의 수축 특성. 따라서,이 세그먼트는 차례로, 근육 내의 섬유의 총 수의 작은 부분을 나타내는, 수득되는 다핵 섬유 전체의 단지 작은 부분을 캡처한다. 수사관들은 이렇게 조심스럽게 실험에서 도출 결론을 지원하는 데 필요한 샘플링을 고려해야한다. 또한, 섬유의 기능에 대한 운동 교육 개입의 영향을 평가하는 것은 평가 섬유가 실제로 훈련 기간 동안 모집 있다고 가정합니다. 프로토콜은 섬유의 천연 세포 내 환경을 모방하려고하지만, sarcolemma의 투과성으로 공정은 비특이적이고, 반드시 수용성 세포 성분 자유롭게 입욕 용액 내로 확산 할 수있다. 막 투과성의 또 다른 결과는 섬유 볼륨 (33)의 팽창에 의해 입증 삼투압 균형의 변화이다.섬유 팽윤 myofilament 시스템 34,35 감소 된 칼슘 민감성 결과 액틴과 미오신 필라멘트 사이의 거리를 증가 시키지만, 큰, 삼투 적으로 활성 인 화합물 (34)의 도입에 의해 역전 될 수있다. 고려하는 최종 제한 실험 장치에 섬유를 부착하는 데 사용되는 기술의 결과이다. 이것은 불변 기능적 결손 참석과, 부착 지점에서와 근처 필라멘트 시스템 내의 공간적 관계 왜곡 요구한다. 구체적으로는, 상기 광섬유와 연결 지점에 인접하는 영역의 기능적 손상되고 이에 의해 측정 시스템에 인공적 시리즈 탄성 기여한다. 요약하면, 우리는 시험관 내에서 화학적으로 투과성이 골격근 섬유의 힘 발생 능력을 평가하는 방법을 설명 하였다. 이 기사의 초점은 최대 아이소 메트릭 힘 generatin의 평가되었지만인간 골격근 섬유의 g 용량은, 실험 방법은 변성 및 종, 또는 다른 포유 동물의 범위에 걸쳐 운동 파라미터와의 관계를 결정하는 데 다양한 확장 될 수있다.

골격근의 주요 기능은 힘을 발생하는 것이다. 근력은 운동 신경 활동 전위, 신경근 전달, 근육 섬유 활동 전위, 세포 내 칼슘의 방출, 및 규정 및 수축성 단백질의 시스템의 활성화를 포함 이벤트 복잡한 시퀀스를 통해 생체 내에서 유도된다. 구동력 발생이 시퀀스의 최종 결과이기 때문에, 힘의 결핍은 개별 단계 중 하나 이상의 오류로 인해 발생할 수있다. 투과성이 섬유 제조의 중요한 속성은 근원 섬유 장치는 나머지와 관련된 유일한 규제 및 수축 기능을, 생체 내에서 구동력 발생에 필요한 단계의 대부분을 제거한다는 것이다. 조사는 칼슘과 에너지 (ATP)를 활성화의 전달에 대한 제어를 가정하고 그 나라의 공동의 고립 된 규제 및 수축 구조의 평가를 할 수있는 단순화 된 시스템과 보상nfiguration. 생체 내에서 관찰 근육 기능의 변화를 평가할 때 투과성이 골격근 섬유를 사용하여 힘 측정 따라서 가치가있다. 예를 들어, 우리는 미오 스타틴 결핍 마우스 (1)로부터 섬유의 힘 발생 능력을 특성화하는 만성 회전근 2,3- 다음 나타내 영구 근육 약화의 원인을 평가하기 위해이 기술을 사용했다. 현대 광 투과성이 방법론은 초기 연구 영향력 4,5- 추적 연구 그룹 번호로 현재 사용된다. 기술은 문헌에 기재되어있다하더라도, 그들은 아직 비디오 포맷으로 제시되어 있지 않다. 이 문서의 목적은 화학적으로 투과성이 골격근 샘플들로부터 단일 섬유의 최대 힘 발생 능력을 측정하기 위해 업데이트, 유효하고 신뢰성있는 방법을 설명하는 것이다. 이, 본 명세서에서 개별 섬유 세그먼트 (달성하기 ̶0; 섬유 &quot;)은 섬유의 사전 - 투과성이 번들로부터 추출하고 편안한 함유 용액 실험 챔버 내에 배치되어, 정의 기능 그중 10 &lt;㎚이다 칼슘 농도이다. 섬유이어서 강제 변환기에 일단과 길이 컨트롤러 타단에 부착되어있다. 최적 근절 길이로 유지 섬유, 그것은 최대 활성화하여 최대 메트릭 수축력을 유도하기에 충분한 칼슘 농도를 갖는 활성 용액에 전송된다. 포스 데이터 획득 및 저장 퍼스널 컴퓨터를 사용하여 분석한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Polystyrene culture test tube with cap</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-956-3D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL screw cap micocentrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>02-681-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL microcentrifuge caps with o-ring</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>02-681-358</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge cryobox</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>5055-5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Mettler-Toledo</td>
			<td>FE20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08-757-11YZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonsterile-suture 10-0 monofilament</td>
			<td>Ashaway Line Twine</td>
			<td>S30002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps - Dumont #5</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micrometer drives</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>3936M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>BAT-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath circulator&#160;</td>
			<td>Neslab Instruments</td>
			<td>RTE-111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Aplha Omega Instruments</td>
			<td>Series 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Varied</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber system</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>802D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Length-controller</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>312C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Force-transducer</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>403A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-proprionate</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>P0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imadizole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#8226;6H20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brij 58</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA (acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E0396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2H2ATP&#8226;0.56H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (acid)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>529699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDTA (acid)</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>D2019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH (1N)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>35113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCL (1N)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>318949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2CrP&#8226;4H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 10 standard</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SB115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 7 standard</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SB107</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of maximum isometric force generated by permeabilized skeletal muscle fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle function at the level of the single muscle cell. Single muscle fiber studies are useful in both basic science and clinical studies. For basic studies, single muscle fiber contractility measurements allow investigation of fundamental mechanisms of force production, and analysis of muscle function in the context of genetic manipulations. Clinically, single muscle fiber studies provide useful insight into the impact of injury and disease on muscle function, and may be used to guide the understanding of muscular pathologies. In this video article we outline the steps required to prepare and isolate an individual skeletal muscle fiber segment, attach it to force-measuring apparatus, activate it to produce maximum isometric force, and estimate its cross-sectional area for the purpose of normalizing the force produced.

건강, 화학적으로 투과성이 단일 섬유 모양의 유니폼을 표시하고 높은 배율에서 볼 때 일관성있는 줄무늬의 간격이 있어야합니다. 집게를 조작 할 때 유연 또는 명백한 구조적 손상이 섬유는 폐기해야합니다. 단계 15 동안 촬영 고배율 디지털 이미지는 섬유의 중간 부분을 따라 5 쌍의 직경 측정을 위해 분석된다. 섬유 CSA는 타원형 단면을 가정하고도 7a에 도시 된 바와 같이 5 개인 CSA 측정 값을 평균 추정된다. 그림 7b는 또한 하나의보기에 섬유 치수가 다른 뷰 (즉, 교차에 쌍으로 크기에 비해 상당히 다를 수 있습니다 방법을 설명하는 역할을한다 절) 일반적으로, 라운드, 아니다. 인간 느리고 빠른 섬유 대표 힘 트레이스는 각각도 8a 및도 8b에 나타낸다. Voltag강제 변환기의 E 출력 테스트 동안 획득 및 데이터 획득 및 분석 소프트웨어 (LabVIEW를) 이용 (MN)를 강제로 변환된다. (9) 도면은 감산함으로써 계산된다 최대 활성 힘 (F에서 O)을 평가하기 위해 사용되는 방식을 도시 최적의 근절 길이의 섬유를 유지하기 위해 필요한 힘 편안한 상태에있는 동안 (수동 힘, F, P), 최대 섬유 활성화 중에 개발 된 큰 아이소 메트릭 힘 (총 힘, F T)에서. 제로의 힘에 대응 힘 변환기의 출력 이후이며, 일반적으로 상이한 입욕 챔버들 각각에 대해 서로 다른, 우리는 잠시에 제로 - 힘 레벨을 캡처 미리 활성화 및 솔루션을 활성화 모두 섬유를 늦추지 실험 기록. 섬유 CSA에 의해 최대 활동력 정상화 특정 포스 (SF 오)의 더 많은 정보 값을 생성하는 데 사용됩니다. 이 고려 섬유의 CSA 걸리기 때문에, SF 오 </sUB는&gt;함으로써 이종 섬유 사이의 크기의 비교를 허용하는 기능, 섬유의 수축에있어서의 내재적 힘 발생 능력의 척도를 제공한다. 이것은, 그러나, CSA 측정들이 다른 세포 내 구조가 차지하는 비율 대 수축에 의해 점유 된 필라멘트 섬유의 비율을 구별 할 수없는 것을 주목해야한다. 일반적인 건강의 특성, 마우스 및 Gumucio 등을위한 Claflin 등. 2011 인간 10, Mendias 등. 2011 1 성인 섬유. 쥐 2012 년 2 표 3에 자세히 설명되어 있습니다. 사용하여 생성 된 표 3에 제시되는 모든 데이터 이 문서에서 설명하는 기술. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="text-align:center"><tbody><tr><td rowspan="3" style="border:0px #fff solid"></td><td colspan="4"> 사람의 (광근 lateralis) </stronG&gt; </td><td> 쥐 (EDL) </td><td nowrap="nowrap"> 쥐 (하근) </td></tr><tr><td colspan="2"> 남성 </td><td colspan="2"> 여자 </td><td> 남성 </td><td> 남성 </td></tr><tr><td> 유형 1 </td><td> 유형 2A </td><td> 유형 1 </td><td> 유형 2A </td><td> (입력하지 않음) </td><td> (입력하지 않음) </td></tr><tr><td> CSA (μm의 2) </td><td> 4880-6900 </td><td> 5270-8380 </td><td> 3870-5470 </td><td> 4010-5610 </td><td> 1850-3080 </td><td> 5290-8010 </td></tr><tr><td> F 오 (MN) </td><td> 0.79-1.17 </td><td> 1.02-1.54 </td><td> 0.64-0.97 </td><td> 0.71-1.07 </td><td> 0.14-0.25 </td><td> 0.55-0.97 </td></tr><tr><td> SF 오 (kPa의) </td><td> 142-182 </td><td> 165-210 </td><td> 156-193 </td><td> 172-214 </td><td> 67-94 </td><td> 102-131 </td></tr><tr><td> N </td><td> 129 </td><td> (160) </td><td> 149 </td><td> (207) </td><td> (37) </td><td> (94) </td></tr></tbody></table> 인간의 광근에서 건강한 성인 섬유의 표 3. 일반적인 특성 10 lateralis, 마우스 신근 심지 longus 1 쥐 하근은 2 근육. 최적의 근절 길이는 모두 마우스에 대한 인간의 섬유 7,8 2.7 μm의 2.5 μm의 (36에서 설정 한 37)와 쥐의 섬유 (38). 실험 패 F 범위 (25 일, 75 번째 분위)는 1.39-1.73 mm, 1.17-1.53 ​​MM 각각 인간, 마우스 및 쥐에 대한 1.32-1.59 mm이다. 도시 된 범위는 25 번째와 75 번째 분위수를 나타내며 N 테스트 섬유의 수이다. 테스트 기간 동안 경험 한 가장 일반적인 문제는 힘 응 답 결과 봉합 루프 슬립을 포함도 10a에 도시 된 것과 같은 &quot;캐치&quot;, 그리고 갑자기 방향 또는 (휴식)에 반환하는 힘으로 응답하는 섬유의 일부 또는 전체 두께 눈물 E 제로 섬유는 여전히 해결책을 활성화에 몰입하는 동안 (그림 10B). 슬립, 눈물 또는 브레이크가 실험 기간 동안 발생하는 경우, 섬유는 폐기되어야하고, 섬유 실패 레코드를 유지하는 것이 또한 유익 할 수있다 (11) 비록 데이터는 제외. 발생할 수있는 또 다른 부정적 결과는 동안 미리 활성화 액 (도 10C)에서 섬유의 조기 활성화이다. 사전 활성화 용액에 활성화 부분 (즉, 칼슘 농도의 증가에 잘 의도 미리 활성화) 상당한 교차 오염을 잘 보여준다. 이때, 모든 화장실 흡입되어야하고, 탈 이온수로 잘 헹구고. 챔버 사이에 분할 표면을 건조도 recommen입니다이 분야에서 습기 나 결로 등 DED는 화장실 사이의 솔루션의 심지가 발생할 수 있습니다. 결정은 포함하거나 데이터가 궁극적으로 실험 초점에 따라 달라집니다 및 연구를 설계 할 때 따라서 고려되어야한다 제외합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig1.jpg" /> 그림 1 : 봉합 루프 (10-0 모노 필라멘트 나일론 봉합사). <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig2.jpg" /> 그림 2 :. 번들 해부 집게가 왼쪽 손에은 미세 절제 가위는 오른쪽에 있습니다. 레드 라인은 섬유의 길이 방향 축이 손목과 가위의 유리한 방향을 나타냅니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig3.jpg" /> 그림 3 : </stron표지 요소와 g는&gt; (A) 검사 장치. () 투명 바닥과 실험 챔버. (b) 길이 제어기. (C) 포스 트랜스 듀서. (d) 광원. (E) 디지털 디스플레이와 길이 컨트롤러 XYZ 마이크로 미터 거리에 있습니다. 디지털 디스플레이 (F) 스테이지 마이크로 미터 거리에 있습니다. (G) 포스 트랜스 듀서 XYZ 마이크로 미터 거리에 있습니다. 교정 레이저 회절 대상 스크린 (H) 플랫폼. (I) 제진 테이블. (나) 실험 챔버의 근접 촬영보기. 길이 제어기로부터 연장 (j) 스테인리스 부착면. 강제 변환기로부터 연장 (K) 스테인리스 부착면. (L) 사이드 뷰 프리즘. 열전 냉각 모듈 (M) 주택. 보고 챔버 테에 대한 (N) 열전대mperature. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig4.jpg" /> 그림 4 : 실험 챔버로 해부 접시에서 섬유를 전송하는 데 사용 100 μL 피펫 팁을 수정. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig5.jpg" /> 도 5 :. 실험 장치에 단 섬유를 실장 (A)를 제조 봉합 루프는 스테인레스 스틸의 표면에 부착 나사. (B) 섬유는 실험 챔버로 옮겼다. (C) 섬유가 제거 과량 봉합 봉합 루프들의 제 한쌍 스테인리스 부착 표면에 고정. (D) 제 봉합 루프의 맨 위에 나사 제자리에 묶어 봉합 루프의 두 번째 쌍. <img alt="그림 6"SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 52695 / 52695fig6.jpg&quot;/&gt; 도 6 : 근절 길이 보정 대상 화면에 레이저 간섭 패턴의 돌출부에 의해 평가된다 (a) 레이저 광원.. (b)의 거울. (c) 목표 화면. (D) 레이저 간섭 패턴. <img alt="도 7a" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7A.jpg" /><img alt="그림 7B" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig7B.jpg" /> 그림 7 : 최적의 근절 길이의 섬유 단면적 (A) 결정 (2.7 μm의 = 인간). 타원형 단면 가정, CSA 다섯 섬유의 중앙부를 따라 위치와 다섯 개의 개별 측정의 평균의 각 섬유 CSA로보고 계산됩니다. 도 2a는 평면도 직경을 나타내고있다<html> 타원의 한 ​​축은,도 2b는 측면도 입자경을 나타내는 타원의 다른 축이다. (B) 모두 상단 및 측면도에서 찍은 다섯 대응하는 직경 측정의 각 섬유를 나타내는 대표적인 이미지. <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig8.jpg" /> 그림 8 : 건강한 인간 광근의 대표 힘의 흔적은 근육 섬유를 lateralis (1) 섬유 (CSA : 5710 μm의 2, F 오 : 0.89 Mn 및 SF 오 : 156 kPa의)를 입력합니다.. (: 9510 μm의 2, F 오 : 1.66 Mn 및 SF 오 : 174 kPa의 CSA) (B) (2A) 섬유를 입력합니다. 섬유 미오신 중쇄 타입 전기 영동 분리 및은 - 염색 기술 (22)의 사용을 통해 결정되었다. OAD / 52695 / 52695fig9.jpg &quot;/&gt; 그림 9 : 최대 활성 힘 (F 오)의 계산 사전 활성화 용액에 시작 길이 컨트롤러의 여유 유도 운동하는 동안 섬유 힘 응답 () 확장보기.. F P는 휴지 섬유와 2.7 ㎛의 근절 길이를 유지하는 데 필요한 힘이다. (b)는 길이 컨트롤러 여유 유도 운동의 확장 된보기. F P - 그 F 오 = F (T)를 참고. <img alt="그림 10" src="/files/ftp_upload/52695/52695fig10.jpg" /> 그림 10 : 힘의 상승하는 동안 힘 추적에 &quot;캐치&quot;에 의해 입증 (A) 봉합 루프 슬립. 확인 루프 섬유를 활성화하기 전에 안전으로 확인합니다. 활성화시 (B) 섬유 휴식. 봉합 루프 장소 중에 가난한 섬유 무결성 또는 공격적인 섬유 몸싸움으로 할 수 있음, 표준. 때문에 칼슘과 사전 활성화 챔버의 오염 (C) 조기 부분 섬유 활성화 2+.

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Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

화학적으로 피부 또는 투과성이 골격근 섬유의 수축 특성의 분석은 하나의 근육 세포의 수준에서 근육 기능을 평가함으로써 강력한 수단을 제공한다. 이 문서에서 우리는 준비하는 유효하고 신뢰할 수있는 기술 개요 및 테스트는 시험 관내에서 골격 근육 섬유를 투과성이.

투과성이 골격 근육 섬유에 의해 생성 된 최대 아이소 포스의 측정

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

25.1K 조회수.  University of Michigan Medical School.  화학적으로 피부 또는 투과성이 골격근 섬유의 수축 특성의 분석은 하나의 근육 세포의 수준에서 근육 기능을 평가함으로써 강력한 수단을 제공한다. 이 문서에서 우리는 준비하는 유효하고 신뢰할 수있는 기술 개요 및 테스트는 시험 관내에서 골격 근육 섬유를 투과성이. 

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Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium. We have developed tissue surface tensiometry (TST) specifically to measure the surface free energy of interaction between cells. The biophysical concepts underlying TST have been previously described in detail1,2. The method is based on the observation that mutually cohesive cells, if maintained in shaking culture, will spontaneously assemble into clusters. Over time, these clusters will round up to form spheres. This rounding-up behavior mimics the behavior characteristic of liquid systems. Intercellular binding energy is measured by compressing spherical aggregates between parallel plates in a custom-designed tissue surface tensiometer. The same mathematical equation used to measure the surface tension of a liquid droplet is used to measure surface tension of 3D tissue-like spherical aggregates. The cellular equivalent of liquid surface tension is intercellular binding energy, or more generally, tissue cohesivity. Previous studies from our laboratory have shown that tissue surface tension (1) predicts how two groups of embryonic cells will interact with one another1-5, (2) can strongly influence the ability of tissues to interact with biomaterials6, (3) can be altered not only through direct manipulation of cadherin-based intercellular cohesion7, but also by manipulation of key ECM molecules such as FN8-11 and 4) correlates with invasive potential of lung cancer12, fibrosarcoma13, brain tumor14 and prostate tumor cell lines15. In this article we will describe the apparatus, detail the steps required to generate spheroids, to load the spheroids into the tensiometer chamber, to initiate aggregate compression, and to analyze and validate the tissue surface tension measurements generated.

We describe a method of measuring binding energy, expressible as tissue surface tension, between cells within 3D tissue-like aggregates. Differences in tissue surface tension have been demonstrated to correlate with invasiveness of lung, muscle, and brain tumors, and are fundamental determinants of establishing spatial relationships between different cell types.

조직 표면 Tensiometry에 의해 집계 응집력의 측정

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

연구

생체공학

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

원자 힘 현미경에 의해 영상에 대한 세균 고정

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to study pressure ulcers, for regenerative medicine and as a meat alternative 1. The first reported 3D muscle constructs have been made many years ago and pioneers in the field are Vandenburgh and colleagues 2,3. Advances made in muscle tissue engineering are not only the result from the vast gain in knowledge of biochemical factors, stem cells and progenitor cells, but are in particular based on insights gained by researchers that physical factors play essential roles in the control of cell behavior and tissue development. State-of-the-art engineered muscle constructs currently consist of cell-populated hydrogel constructs. In our lab these generally consist of murine myoblast progenitor cells, isolated from murine hind limb muscles or a murine myoblast cell line C2C12, mixed with a mixture of collagen/Matrigel and plated between two anchoring points, mimicking the muscle ligaments. Other cells may be considered as well, e.g. alternative cell lines such as L6 rat myoblasts 4, neonatal muscle derived progenitor cells 5, cells derived from adult muscle tissues from other species such as human 6 or even induced pluripotent stem cells (iPS cells) 7. Cell contractility causes alignment of the cells along the long axis of the construct 8,9 and differentiation of the muscle progenitor cells after approximately one week of culture. Moreover, the application of electrical stimulation can enhance the process of differentiation to some extent 8. Because of its limited size (8 x 2 x 0.5 mm) the complete tissue can be analyzed using confocal microscopy to monitor e.g. viability, differentiation and cell alignment. Depending on the specific application the requirements for the engineered muscle tissue will vary; e.g. use for regenerative medicine requires the up scaling of tissue size and vascularization, while to serve as a meat alternative translation to other species is necessary.

Engineered muscle tissue has great potential in regenerative medicine, as disease model and also as an alternative source for meat. Here we describe the engineering of a muscle construct, in this case from mouse myoblast progenitor cells, and the stimulation by electrical pulses.

전기 자극의 손쥐 Myoblast의 전구 세포 및 응용에서 공학 골격근 조직도

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

항생제 내성 황색 포도상 구균 박테리아의 검출을위한 바이오 센서

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is presented. The polymerization from the membrane surface is induced by plasma treatment of the membrane, followed by reacting the membrane surface with a methanolic solution of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA). Special attention is given to the process parameters for the plasma treatment prior to the polymerization on the surface. For example, the influence of the plasma-treatment on different types of membranes (e.g.&#160;polyester, polycarbonate, polyvinylidene fluoride) is studied. Furthermore, the time-dependent stability of the surface-grafted membranes is shown by contact angle measurements. When grafting poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) in this way, the surface can be further modified by esterification of the alcohol moiety of the polymer with a carboxylic acid function of the desired substance. These reactions can therefore be used for the functionalization of the membrane surface. For example, the surface tension of the membrane can be changed or a desired functionality as the presented light-responsiveness can be inserted. This is demonstrated by reacting PHEMA with a carboxylic acid functionalized spirobenzopyran unit which leads to a light-responsive membrane. The choice of solvent plays a major role in the postmodification step and is discussed in more detail in this paper. The permeability measurements of such functionalized membranes are performed using a Franz cell with an external light source. By changing the wavelength of the light from the visible to the UV-range, a change of permeability of aqueous caffeine solutions is observed.

A plasma-induced polymerization procedure is described for the surface-initiated polymerization on polymer membranes. Further postmodification of the grafted polymer with photochromic substances is presented with a protocol of conducting permeability measurements of light-responsive membranes.

결합 표면의 접목 및 Postmodification 과정에 의한 빛의 응답 멤브레인의 제조

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

켈빈 프로브 힘 현미경을 사용하여 박테리아의 표면 전위 측정

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of exosomes to determine if they carry disease discriminatory biomarkers. For performing exosomal analysis, it is necessary to develop a method for extracting and analyzing exosomes from target biofluids without damaging the internal content.
Electric field-induced release and measurement (EFIRM) is a method for specifically extracting exosomes from biofluids, unloading their cargo, and testing their internal RNA/protein content. Using an anti-human CD63 specific antibody magnetic microparticle, exosomes are first precipitated from biofluids. Following extraction, low-voltage electric cyclic square waves (CSW) are applied to disrupt the vesicular membrane and cause cargo unloading. The content of the exosome is hybridized to DNA primers or antibodies immobilized on an electrode surface for quantification of molecular content.
The EFIRM method is advantageous for extraction of exosomes and unloading cargo for analysis without lysis buffer. This method is capable of performing specific detection of both RNA and protein biomarker targets in the exosome. EFIRM extracts exosomes specifically based on their surface markers as opposed to size-based techniques.
Transmission electron microscopy (TEM) and assay demonstrate the functionality of the method for exosome capture and analysis. The EFIRM method was applied to exosomal analysis of 9 mice injected with human lung cancer H640 cells (a cell line transfected to express the exosome marker human CD63-GFP) in order to test their exosome profile against 11 mice receiving saline controls. Elevated levels of exosomal biomarkers (reference gene GAPDH and protein surface marker human CD63-GFP) were found for the H640 injected mice in both serum and saliva samples. Furthermore, saliva and serum samples were demonstrated to have linearity (R = 0.79). These results are suggestive for the viability of salivary exosome biomarkers for detection of distal diseases.

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement EFIRM

Exosomes are microvesicular structures found within biofluids that potentially carry important disease discriminatory biomarkers. Here, a novel method is used to specifically extract exosomes and rapidly test the exosomal cargo for both RNA/protein targets following the disruption of exosomes using non-uniform electric cyclic square waves.

전기장에 의한 해제 및 측정 (EFIRM)에 의해 Exosomal 바이오 마커의 검출

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

의 응용 프로그램<em&gt; 생체</em&gt; 조직 평가를위한 쥐 앞정 전방의 기능 테스트는 골격근 수리 엔지니어링

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

살아있는 세포 형광 기술의 조합을 사용 하 여 힘에 민감한 단백질 역학의 측정

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.