이 방법은 만성 질환의 노화 및 발달 중 뇌혈 흐름 조절과 관련이 있기 때문에 뇌혈관 생리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생리적 조건하에서 본체 형태인 대뇌 동맥 내피의 세포내 칼슘과 막 전위의 동시 측정을 허용한다는 것입니다. 마우스 뇌를 격리하려면 현미경으로 두개골 위에 피부와 머리카락을 제거합니다.
차가운 칼슘이 없는 PSS로 과도한 혈액을 제거합니다. 다음으로 표준 해부 가위의 팁만 사용하여 절개를 합니다. 후두 뼈에서 시작하여 두개골의 비강 뼈를 통해 확장.
그런 다음 그녀는 거친 팁 포셉을 사용하여 절개를 따라 조심스럽게 두개골을 열고 결합 조직을 분리하여 뇌를 노출시합니다. 차가운 칼슘없는 PSS로 고립 된 뇌를 부드럽게 씻어 혈액을 제거합니다. 뇌복부를 대뇌 동맥의 분리를 위해 차가운 해부 용액을 포함하는 챔버에 뇌 복부 면을 올려 놓습니다.
대뇌 동맥을 분리하려면, 그것을 통해 두 개의 스테인레스 스틸 핀을 삽입하여 차가운 해부 용액에서 고립 된 뇌를 확보, 유리 페트리 접시의 바닥에 숯 주입 실리콘 폴리머 코팅에. 그 후, 외과적으로 후방 대뇌 동맥을 약 0.3~ 0.5센티미터 세그먼트를 후방 통신 및 바실라 동맥으로부터 분리합니다. 스테인레스 스틸 핀을 사용하여 페트리 접시의 해부 용액에서 격리된 후방 대뇌 동맥을 모두 보호합니다.
그런 다음 날카로운 미세 기울어진 집게를 사용하여 결합 조직을 제거하여 격리 된 후방 대뇌 동맥을 조심스럽게 청소하십시오. 효소 소화를 위해 그대로 동맥을 1~2밀리미터 세그먼트로 자른다. 이 절차에서는 현미경, 카메라 및 챔버 및 미세 조작제를 들고 있는 알루미늄 스테이지를 사용하여 삼각 장치를 준비합니다.
단계와 시편에 인접한 펌프 컨트롤러로 현미경을 확보하십시오. 다음으로 미네랄 오일로 적정 파이펫을 완전히 채우고 미세 한 피스톤 위에 고정하십시오. 그런 다음 펌프 컨트롤러와 함께 현미경을 사용하여 기포가 없는지 확인하면서 약 130 나노리터의 해화 용액을 파이펫으로 인출합니다.
그 후, 10 밀리리터 유리 튜브에 필요한 효소 농도로 해리 용액의 1 밀리리터에 그대로 동맥 세그먼트를 배치합니다. 부분 소화를 위해 섭씨 34도에서 10~12분 동안 배양합니다. 소화후 효소 용액을 5밀리리터의 신선한 해리 용액으로 대체하십시오.
1 밀리리터 파이펫을 사용하여 실온에서 해리 용액을 포함하는 챔버로 한 세그먼트를 옮기. 다음으로 파이펫을 챔버내 해리 용액에 넣고 소화된 용기의 한쪽 끝에 가깝게 배치합니다. 펌프 컨트롤러에서 초당 2~5나노리터 범위 내에서 속도를 설정하여 부드러운 트리튜레이션을 제공합니다.
100배내지 200배의 배율을 통해 보는 동안 내피관을 생성하는 동안 동맥 분단을 철회하고 배출하여 부드러운 근육 세포를 해리시한다. 필요한 경우 미세 한 포셉을 사용하여 내피 튜브에서 해리 된 출현 및 내부 탄성 라미나분리를 조심스럽게 사용하십시오. 모든 부드러운 근육 세포가 해리되고 내피 세포만 그대로 튜브로 남아 있는지 확인하십시오.
마이크로 조작기사용, 보로실리케이트 유리 고정 파이펫을 사용하여 슈퍼퓨전 챔버의 유리 커버 슬립에 내피 튜브의 각 끝을 확보. 챔버에서 해리 된 출현과 부드러운 근육 세포를 씻어. 그리고 해리 용액을 염화 칼슘 PSS 2마리로 대체한다.
안전한 내피 튜브를 사용하여 모바일 플랫폼을 슈퍼퓨전 및 실험 장비의 현미경으로 전송합니다. 그런 다음 6개의 깨끗한 50 밀리리터 저장소를 사용하여 실험 중에 PSS 및 각 약물 용액을 지속적으로 전달합니다. 인라인 유량 제어 밸브를 사용하여 유량 흐름을 진공 흡입에 일치시키면서 라미너 흐름만큼 일관된 흐름을 수동으로 설정합니다.
배경 데이터 및 염료 적재물을 기록하기 전에 적어도 5 분 동안 내피 튜브의 슈퍼 주입을 위해 챔버에 PSS를 전달합니다. 세포 내 칼슘 농도와 함께 멤브레인 전위를 동시에 측정하려면 날카로운 전극을 당기고 두 개의 어금니 칼륨으로 백필하여 fura-2 염료로 로드된 세포에서 기록하십시오. 염료 전달을 통한 세포내 커플링을 연구하려면 2개의 어금니 칼륨염에 용해된 0.1%의 프로피듐 요오드로 마이크로전극을 백필한다.
다음으로 전극을 마이크로 조작기로 고정된 전기계 헤드 스테이지에 부착된 파이펫 홀더에 염화물로 코팅된 은철위에 놓습니다. 마이크로 조작기를 사용하여 전극의 끝을 챔버내의 흐르는 PSS에 간략하게 배치하고 4배 의 목표를 통해 볼 수 있습니다. 그 후, 접지 된 목욕 잠재력과 일치 하 고 나머지 막 잠재력을 0으로 설정 합니다.
원하는 경우 전기계에 연결된 가청 기준 모니터를 사용하여 사운드 피치를 잠재적 인 기록과 연결합니다. 그 후, 40배의 목표를 사용하여 배율을 400배로 늘리고 내피관의 세포 바로 위에 전극의 끝을 배치한다. 포토메트릭 소프트웨어를 사용하여 포토메트릭 창을 조정하여 약 50~80개의 내피 세포에 초점을 맞춥니다.
그런 다음 마이크로 조작기를 사용하여 내피 튜브의 세포 중 하나에 전극을 부드럽게 배치하고 휴식 막 전위가 안정화될 때까지 적어도 2분 정도 기다립니다. 일단 휴식 막 잠재력은 예상된 값에 안정, 빛의 부재에 형광 인터페이스에 광증 튜브를 켜고 510 나노 미터에서 꽃 방출을 수집하는 동안 340 및 380 나노미터에서 340 및 380 나노미터에서 번갈아 흥미로운 Fura-2에 의해 세포 내 칼슘 농도의 취득을 시작합니다. 멤브레인 전위 및 세포내 칼슘 농도의 동시 측정이 완료되면, 약물의 적용 전에 일정한 라미나르 유량으로 PSS와 내피 튜브의 슈퍼 주입을 위해 약 5 분을 허용합니다.
PSS에서 제조된 약물을 일정한 유량으로 슈퍼퓨전 챔버에 적용하십시오. 약물 치료 중 F340/F380 비율의 멤브레인 전위를 동시에 측정합니다. 실험이 완료되면 전극을 셀에서 철회합니다.
그런 다음 멤브레인 전위 및 세포 내 칼슘 농도의 각각의 기록을 중지하고 데이터 분석을 위해 파일을 저장합니다. 이것은 40배의 목표를 사용하여 포토메트릭 윈도우에서 실험을 위해 조정된 마우스 뇌동맥 내피튜브의 차동 간섭 대조 이미지이다. 날카로운 전극은 이미지 의 상단에 표시된 대로 셀에 배치됩니다.
다음은 100 마이크로몰러 ATP에 대한 응답으로 F340/F380 비율 및 멤브레인 전위의 동시 측정을 위한 원시 추적의 예입니다. 이 절차에 따라, 공초점 형광 현미경 검사법과 같은 다른 방법은 내피 칼슘및 반응성 산소 종의 미세 도메인 신호에 관한 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다, 예를 들어. 일반적으로이 기술은 혈액과 림프 순환에서 혈관 기능과 노화를 탐구하는 세포 생리학연구를위한 길을 계속 포장할 것입니다.
