Name: assessing specificity of anticancer drugs in vitro
Uploaded: 2016-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
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부인 스터 씨 Honrath 박사 지앙은 뛰어난 기술 지원을 부탁드립니다. 또한 닥터 VOLZ 및 디지털 PCR 장치에 대한 액세스를 제공하기위한 Dandri 박사의 연구 그룹은 알 것이다.

1. 혼합 문화 종양 세포와 비 암세포 모두 포함 준비 <ol><li> 확립 된 세포주 MPNST S462 (5)에서 종양 세포를 사용합니다. 비 - 종양 세포로 -6,7- 섬유 아세포를 사용하여 </li><li> 배양 모두 종양 세포를 10 % 소 태아 혈청 표준 DMEM 배지에서 섬유 아세포 (BSA), 3 mM의 글루타민, 0.1 mM의 2- 머 캅토 에탄올, 500 U가 / ㎖ 페니실린, 500 ㎍ / ㎖ 스트렙토 마이신 및 1 mM의 피루브산 나트륨, 37 ℃에서 5 % CO 2 5-7. 부 합류, 0.05 % 트립신으로 세포를 수확하고 혈구를 사용하여 계산. </li><li> 0.2 ㎖의 배지에서 96- 웰 배양 플레이트의 각 웰에 함께 400 종양 세포 및 1600가 아닌 종양 세포를 섞는다. 오일의 치료 기간 동안 종양 세포의 빠른 성장을 고려하여, 종양 세포의 초기 비율은 25 %로 설정 하였다. 설정 4는 각각의 약물 농도에 대한 복제합니다. 37 ℃에서 세포를 인큐베이션하고, 5 % CO 2 O / N. </li></ol> 2. 드루g 치료 <ol><li> 시험 약물로서 닐 로티 닙을 사용합니다. DMSO 0, 2, 4 및 20 밀리미터 닐 로티 닙의 스톡 용액을 준비한다. 0, 10, 20 및 100 μM 6.7의 2 배 농축 된 약물 용액주고, 5 ㎖의 DMEM 배지에서 200 배 그들 각각의 희석. </li><li> 각 0.1 ml의 매체를 잘 제거하고 매체를 포함하는 약 0.1 ml에 추가 할 수 있습니다. 최종 농도가 0, 5, 10 및 50 μM이다. 5 일간 매체를 포함하는 약물의 세포를 배양 계속합니다. </li><li> 처리의 끝에서, 위상차 현미경을 사용하여 부착 된 세포를 검사하고 사진을 촬영. 멀리 매체를 기음 0.2 ml의 PBS로 한번 살아 접착제 세포를 씻는다. </li></ol> 3. 디지털 PCR을위한 DNA 준비 <ol><li> 유능한 8을 이용하여를 Lyse 셀. <ol><li> 각 웰에 50 ㎕의 알칼리 분해 용액 (25 mM의 NaOH를 0.2 mM의 EDTA)를 추가합니다. 호일로 우물을 밀봉합니다. 오븐에서 30 분간 가열 플레이트상에서 95 ℃에서 플레이트를 인큐베이션. MICR에서 확인oscope 더 이상 손상 세포가 우물의 표면에 남아 있지 않은지 확인합니다. 경우에 세포를 완전히 용해시키기 가열 시간을 늘리거나 세제를 추가하지 않았다. -20 °에서 한 번에 동결은 세포를 파괴 강화합니다 C. </li><li> 물론 각 용액 (40 mM 트리스-HC, 산도 4.0) 중화 50 μl를 추가합니다. 10 ~ 30 분 동안 95 ° C에서 PCR의 자전거 타는 사람에 PCR 플레이트와 건조의 U 형 우물에 모든 해물을 전송합니다. 증류수 20 μL와 해물을 복원합니다. </li></ol></li><li> 드롭 투석 구를 사용하여 탈염 <ol><li> 평균 기공 크기는 0.025 μm의 가진 멤브레인 필터를 사용한다. </li><li> 12 웰 플레이트의 우물에 빛나는 쪽이 위로 증류수에 필터를 플로트. 5 분 동안 가습 필터. 필터 및 물과 공기 방울을 방지하기 위해주의. </li><li> 피펫 신중 필터의 4 각 영역에 진입 단계 3.1.4에서 각 샘플의 재구성 해물. 접시를 덮고 30 ~ 60 분 동안 투석. </li><li> 필터를 통해 틀지이나 방울을 방해하지 않고 필터에서 물을 멀리 빨아. </li><li> 새로운 PCR 플레이트의 우물에 해물-방울을 전송합니다. PCR의 사이 클러 10 분 30 95 ° C에서 가열에 의한 DNA-방울을 건조시킵니다. 10 μl의 물에 해물을 복원합니다. </li></ol></li></ol> 4. 디지털 PCR <ol><li> 이러한 DNA, 버퍼 및 RT의 분석 믹스로 해동 냉동 구성 요소 (예를 들어, VWR 미니 원심 분리기) 가능한 원심 분리기의 최대 힘에서 10 초 동안 스핀 다운 후 얼음에 보관하십시오. </li><li> DNA (표 1)을 제외한 모든 구성 요소를 포함하는 마스터 혼합물을 준비합니다. 죽은 볼륨을 고려하고 필요한 양보다 약 10 % 더 마스터 혼합물을 계산합니다. 참고 : 상업 키트에 사용 된 프라이머 및 프로브를 사용합니다. </li><li> 소용돌이 마스터 혼합물 (예를 들어, VWR 미니 원심 분리기) 가능한 원심 분리기의 최대 힘에서 10 초 동안 스핀 다운 각 15 μl를 분배96 PCR 플레이트의 웰. 마스터 혼합물을 함유하는 웰에 각 시료 (DNA를 포함) 모두 해물을 추가한다. 전송 RT에서 카트리지의 시료 측의 각 웰에 반응 혼합물 20 μL. </li><li> 카트리지의 유로 측의 각 웰에 방울 생성기 오일 70 μL 분주. 가스켓과 카트리지를 닫고 방울 생성기로 전체 설정을 배치합니다. 액적 생성을 시작합니다. </li><li> 96 웰 PCR 플레이트의 우물로 전송 40 μL 방울-솔루션입니다. 포일와 함께 접시를 밀봉하고 PCR의 자전거 타는 사람에 접시를 놓습니다. 105 ° C에서 뚜껑 온도를 설정하고 2 ° C / sec의 속도를 램프. 표 2의 설정을 사용하여 PCR을 수행하십시오. PCR을가, 방울 리더에 플레이트를 전송하고 읽기 시작 후. 또한, 최대 24 시간 동안 4 ° C에서 접시를 저장합니다. </li></ol> 5. 종양 세포의 비율을 계산 <ol><li> 디지털 PCR 데이터를로드 및 자동 분석가​​를 수행이다. </li><li> 직접 양극과 음극 방울의 일차원 및 2- 차원 분포를 조사하여 각각의 분석의 결과를 제어하고 잘 분리하고, 임계 라인 오른쪽 위치에 있다고 확인. 결과는 예를 들어, 기준을 만족하지 제외, 상기 분석에서 포지티브 및 네거티브 방울의 명확한 분리. 엑셀 시트에 결과 비 NF1 / RPP30를 복사합니다. </li><li> 2 × (1- NF1 / RPP30)으로 종양 세포의 비율을 계산합니다. </li></ol> 종양 세포의 비율 6. 용량 의존적 변화 <ol><li> 각각의 약물 농도를 들어, 4 회 반복의 평균과 표준 편차를 계산한다. 수단 및 약물 농도에 대한 표준 편차를 플롯. </li></ol>

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	<li>Caponigro, G., Sellers, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+preclinical+testing+of+cancer+therapeutic+hypotheses.">Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 179-187 (2011).</li><li>McMillin, D. W., Negri, J. M., Mitsiades, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+tumour-stromal+interactions+in+modifying+drug+response:+challenges+and+opportunities.">The role of tumour-stromal interactions in modifying drug response: challenges and opportunities.</a> Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 217-228 (2013).</li><li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development.">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).</li><li>Edwards, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+target+validation+using+patient-derived+cells.">Preclinical target validation using patient-derived cells.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 149-150 (2015).</li><li>Frahm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+phenotypic+characterization+of+tumor+cells+derived+from+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+of+neurofibromatosis+type+1+patients.">Genetic and phenotypic characterization of tumor cells derived from malignant peripheral nerve sheath tumors of neurofibromatosis type 1 patients.</a> Neurobiol Dis. 16 (1), 85-91 (2004).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+selectivity+of+nilotinib+on+NF1-associated+tumors+in+vitro.">Efficacy and selectivity of nilotinib on NF1-associated tumors in vitro.</a> J Neurooncol. 116 (2), 231-236 (2014).</li><li>Jiang, W., Mautner, V. F., Friedrich, R. E., Kluwe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+assessment+of+the+anticancer+drug+response+of+plexiform+neurofibroma+tissue+using+primary+cultures.">Preclinical assessment of the anticancer drug response of plexiform neurofibroma tissue using primary cultures.</a> J Clin Neurol. 11 (2), 172-177 (2015).</li><li>Montero-Pau, J., Gomez, A., Munoz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+an+inexpensive+and+high-throughput+genomic+DNA+extraction+method+for+the+molecular+ecology+of+zooplanktonic+diapausing+eggs.">Application of an inexpensive and high-throughput genomic DNA extraction method for the molecular ecology of zooplanktonic diapausing eggs.</a> Limnology and Oceanography-Methods. 6, 218-222 (2008).</li><li>Saraswat, M., Grand, R. S., Patrick, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desalting+DNA+by+drop+dialysis+increases+library+size+upon+transformation.">Desalting DNA by drop dialysis increases library size upon transformation.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 77 (2), 402-404 (2013).</li><li>Iglesias-Bartolome, R., Martin, D., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+head+and+neck+cancer+oncogenome:+widespread+PI3K-mTOR+pathway+alterations+and+novel+molecular+targets.">Exploiting the head and neck cancer oncogenome: widespread PI3K-mTOR pathway alterations and novel molecular targets.</a> Cancer Discov. 3, 722-725 (2013).</li></ol>

The procedure is patent-protected (10 2013 221 452, Germany)

시험 관내 약물 특이성 평가 본 genetic- 셀 기반 도구의 핵심 단계는 하나 이상의 암 특이 유전자의 기능을 이용하여 종양 세포의 비율을 결정한다. 종래의 표현형 특징 7 대조적으로, 유전자 기능은 특정 안정하고 정량화하기 쉽다. 예를 들면, 종양 특이적인 변이 또는 카피 수 변이가 아닌 종양 세포에 독점적으로 종양 세포가 아니라 존재한다. 이러한 유전 적 특질을 확실하고 정확하게 본 연구에서 입증 된 바와 같이 디지털 PCR하여, 예를 들어, 정량 할 수있다. 디지털 PCR의 경우, DNA의 순도가 필수적인 것은 아니다. 그러나, 탈염 및 억제 분자를 제거하는 적절한 필터를 이용하여 드롭 투석에 의해 달성 될 수있는 필요하다. 모은 용해 및 드롭 투석, 간단하고 신속 특별한기구를 필요로하지 않으며, 따라서 임의의 표준 실험실에서 수행 될 수있다. 세포의 브리를하지 않으면또한 K, 추가 처리는, -20 ° C에서 세포를 동결 세제를 추가 및 / 또는 단백질 분해 효소를 사용하는 것으로 간주 될 수있다. 본 연구에서, NF1 유전자의 이형 삭제 정량화 대한 종양 특이 기능을 사용한다. 마찬가지로, 다른 유전자 나 좌위의 결실이 또한 사용될 수있다. 또한 돌연변이는 종양 세포를 정량화하기 위해 사용될 수있다. 이러한 경우에, 디지털 돌연변이 PCR 분석법 정상 대립 유전자는 광범위 그들 각각 특이성을 확인하기 위해 검증되어야한다. 종양 세포의 투여 량 - 의존 비율은 약물 - 특이성 또는 선택성에 대한 표시를 제공한다. 게다가, 그것은 또한 약물 (도 4)에 혼합 배양 총 세포의 반응에서 종양 세포의 추출 반응을 가능하게한다. 이 추출 전략없이 종양 모두 포함 차 배양을 사용의 기술적 문제에 대한 솔루션 (제공약물 테스트를위한 N-종양 세포). genetic- 때문에 응용 가능성을 가질 수있다 본 연구에서 입증 시험 관내 도구에서 셀 기반 (1)가 시험 관내에서 약물 특이성 또는 선택성을 평가하고 플랫폼을 제공 약물 발견 (2) 맞춤 암 치료에 어디를 차 문화에서 시험 약물을 가능하게하고 결과적으로 보조 화학 요법 사에서 약물 선택에 기여할 수있다. 특정 유전자 변경 또는 여러 유전 적 변화는 약물 치료 중이어서 할 수 있기 때문에 또한, 약물의 약리 메커니즘은이 도구를 사용하여 공부하실 수 있습니다. 개별화 차 배양을 사용에 어려움이 결핍 종양 세포의 정량 범용 유전 기능이다. 그러나, 전체 게놈 시퀀싱 오늘의 진행과 함께 자주 변경 유전자 영역이 공통 종양으로 알려져있다. 예를 들어, 머리와 목 사이종양, 71 %, 23 % 및 22 %는 TP53, FAT1 돌연변이 및 CDKN2A 유전자, 60 %, 34 % 및 26 %가 CDKN2A, STK11 및 PTEN 각각 10 유전자 영역의 결실을 가지고있다. 타겟 시퀀싱 및 / 또는 디지털 PCR을 이용하여 5 내지 10 등의 유전자 및 / 또는 영역을 스크리닝 따라서 가능성 유래 일차 배양에서 종양 세포의 정량에 이용 될 수있는 하나 이상의 유전 적 변형을 확인한다. 또 다른 제한은 차 문화를 설정하는 절제된 종양의 자주 부족한 양이다. 유리한 기능과 genetic-의 유망한 응용 잠재력과 셀 기반 체외 도구가, 그 한계를 염두에 보관해야하고 시험 관내 특성이 강조되어야한다에도 불구하고. 예를 들어, 종양 세포에 대한 약물의 차동 영향이나 독성 수도 인해 오히려 세포 유형의 차이 (슈반 세포 대 섬유 아세포)를하거나(다른 개인의) 다른 기원. 비 - 종양 세포에 비해 종양 세포에 대한 약물의 강력한 효과는 전자가 후자보다 더 빠르게 증가한다는 사실에 의해 설명 될 수있다. 가장 중요한 것은, 체외 동작 셀은 인체 세포보다 다르며 따라서, 시험 관내 평가의 결과들은 실제 임상 상황을 반영하지 않거나 부분적으로 수행. 따라서, 효능, 독성 및 배양 된 세포에 대해 얻어진 약물의 특이성은 오히려 바이오 마커 성격이지만 항생제 전임상 측정 효과의 신뢰성이 없습니다. 그럼에도 불구하고, 혼합 문화 및 / 또는 주 문화에 세포 라인에서 이동하는 생체 외 약물 효과와 특이도 / 선택도를 평가하는데 앞으로 단계입니다. 광범위한 노력으로, 시험관 조건에서 적어도 일부 의약품에 대한 환자의 실제 반응과 체외 데이터의 합리적인 상관 관계를 가능하게하는 찾을 수 있습니다.

Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools1. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios. 
Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines2. More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing2-4.
An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated. 
This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.

<table><tbody><tr><td>Membrane filter of 25 mm diameter</td><td>Merk-Millipore</td><td>VSWP 02500</td><td>For drop-dialysis</td></tr><tr><td>ddPCR assay for NF1</td><td>BioRad</td><td>dHsaCP1000177</td><td>FAM-labelled</td></tr><tr><td>ddPCR assay for RPP30</td><td>BioRad</td><td>dHsaCP2500350</td><td>HEX-labelled</td></tr><tr><td>QX200</td><td>BioRad</td><td>186-4001</td><td>The previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200</td></tr><tr><td>Droplet oil</td><td>BioRad</td><td>186-3005</td><td></td></tr><tr><td>Cartriges&amp;nbsp;</td><td>BioRad</td><td>186-3004</td><td></td></tr><tr><td>Gaskets</td><td>BioRad</td><td>186-3009</td><td></td></tr><tr><td>Cartrige holder</td><td>BioRad</td><td>186-3051</td><td></td></tr><tr><td>Pierceble foil</td><td>BioRad</td><td>181-4040</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing specificity of anticancer drugs in vitro

종양 및 비 종양 세포를 모두 함유하는 배양 물을 사용하여 시험 관내에서 항암제의 특이성을 평가하기위한 절차가 설명된다. 핵심 요소는 이중 디지털 프로브 PCR 분석 및 종양 세포의 비율의 후속 계산을 사용하여, 범용 서열과 관련하여 암 특이 적 유전자 변화를 정량한다. 상기 분석은 종양 설정된 광고의 세포를 함유하는 배양에서 수행되는 스파이크 된 비 - 종양 세포. 혼합 문화는 다양한 농도에서 시험 약물로 치료한다. 처리 후, DNA를 간단하고 저렴한 방법을 사용하여 96- 웰 플레이트의 웰에서 살아 접착 세포로부터 직접적으로 제조되며, 암 특이 적 유전자 변화와 기준 범용 시퀀스를 측정하기위한 이중 프로브 디지털 PCR 분석을 실시 . 본 데모에서, NF1 유전자의 이형 삭제가 암 특이 유전자 변형으로 사용되며기준 유전자와 같은 유전자 RPP30. 비 NF1 / RPP30를 사용하여, 종양 세포의 비율을 계산 하였다. 종양 세포의 비율의 용량 의존적 인 변화는 약물의 특이성에 대한 시험 관내 표시를 제공하기 때문에, 이러한 유전자 및 세포 - 기재 시험 관내 분석 가능성 신약 개발에 응용 가능성을 가질 것이다. 또한, 맞춤형 암 치료를 위해,이 genetic- 및 셀 기반 도구는 개별 종양의 차 문화를 사용하여 테스트 효능 및 후보 약물의 특이성에 의해 보조 화학 요법을 최적화에 기여할 수있다.

DNA의 품질이 결합 된 유능한가 / 드롭 투석을 만족 디지털 PCR (그림 1B)에 대한 충분한 사용하여 제조. 2000 아세포를 들어, 약 3000 ± 500 긍정적 방울 예상 4,000 복사본 (하나의 셀에 2 부)의 75 %에 해당 얻었다. 본 연구에서 종양 세포가 5 NF1 유전자의 이형 접합체 삭제 것으로 알려진 확립 라인 MPNST S462에서 있었다. 이것은 50 %의 유전자 투여 량의 감소는 분명히 듀얼 디지털 PCR 분석 (도 1b)에 의해 검출 하였다. 대조적으로,이 유전자의 두 카피가 섬유 아세포에서 측정 하였다. 종양 및 비 종양 세포 간의 이러한 차이는 유전 혼합 배양에서 종양 세포 (도 2)의 비율의 계산을 가능하게한다. RPP30에 NF1의 상대 유전자 투여 량을 측정하여, 혼합 배양에서 종양 세포의 비율이 결정될 수있다각각의 약물 농도 (그림 3). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig1.jpg" /> 원리 그림 1. 디지털 PCR. (A)입니다. (B) 듀얼 프로브 분석은 기준 (RPP30) 유전자와 관련하여 종양 세포 MPNST S462에서 대상 (NF1) 유전자의 감소 된 양을 알 수있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig2.jpg" /> 도 2 종양 세포의 비율 계산. 종양 세포 및 비 - 종양 세포를 다양한 비율로 혼합하고 96 플레이트의 각 웰에 시딩 하였다. 첨부 O / N, 세포가 용해 된 후, 재치시간인가요 / 드롭 투석 탈염 해물 NF1 / RPP30 비율 준 디지털 PCR을 실시 하였다. 이 비율에 대한 자료는 각 웰에서 종양 세포의 비율을 계산 하였다. 평균과 각 4 설정 비율로 복제에서 종양 세포의 비율의 표준 편차를 계산 하였다. 종양 세포 (Y 축)의 계산 된 비율은 셋업 비율 (X 축)에 대해 도시 하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig3.jpg" /> 도 종양 세포의 비율 3 투여 량에 따른 변화. (A) 용량 의존적 표시 필수적인 세포의 감소. (B) 종양 세포의 비율 (평균 4 회 반복의 표준 편차)을 계산<html> NF1 비율 - 10 μM RPP30 0의 범위에서 감소 하였다. 가장 높은 용량 50 μM에서 몇 가지 중요한 세포로 인해 모든 세포에 독성 효과, 가능성이 남았다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig4.jpg" /> . 비 종양 세포에서의 종양 세포의 응답을 분리 한도 4 (A) 가능성 및 / 또는 전체 세포의 증식은 통상의 분석법을 사용하여 측정 될 수있다; 종양 세포의 비율은 본 연구에서 설명 된 절차를 사용하여 결정될 수있다. 두 개의 매개 변수를 사용하여 (B)은, 약물을 혼합 배양에서 총 세포의 반응은 종양 세포가 아닌 종양 세포 반응의 반응으로 나눌 수있다..COM / 파일 / ftp_upload / 53752 / 53752fig4large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <table fo:keep-together.within-page="1"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"></td><td style="width:171px;"> 1 반응 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> 2 × ddPCR 수퍼 믹스 </td><td style="width:171px;"> (12) </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> NF1에 대한 분석 믹스 </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> RPP30에 대한 분석 믹스 </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> HaeIII </td><td style="width:171px;"> 0.6 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> 소계 </td><td style="width:171px;"> (15) </td><td style="width:99px;"> 마스터 혼합물 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> DNA </td><td style="width:171px;"> 9 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> 합계 </td><td style="width:171px;"> (24) </td><td style="width:99px;"> 최종 PCR 혼합물 </td></tr></tbody></table> 표 1은 듀얼 ddPCR 반응 설정 <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 단계 </td><td> 동작 </td><td> 온도 </td><td> 시각 </td><td> 사이클 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Polym활성화를 삭제 </td><td> 95 ° C </td><td> 10 분 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 이 </td><td> DNA 변성 </td><td> 94 ° C </td><td> 30 초 </td><td rowspan="2"> (40) </td></tr><tr><td> 삼 </td><td> 소둔 / exetension </td><td> 60 ° C </td><td> 1 분 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 중합 효소 비활성화 </td><td> 98 ° C </td><td> 10 분 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> (5) </td><td> 홀드 (선택 사항) </td><td> 4 ° C </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 표 2 PCR 자전거 타는 설정

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Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

이 프로토콜의 목적은 종양 및 비 종양 세포를 모두 포함하는 혼합 된 배양 물을 사용하여 시험 관내에서 항암제의 특이성을 평가하는 것이다.

항암 약의 특이성 평가<em&gt; 체외</em

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

9.4K 조회수.  University Medical Center Hamburg-Eppendorf.  이 프로토콜의 목적은 종양 및 비 종양 세포를 모두 포함하는 혼합 된 배양 물을 사용하여 시험 관내에서 항암제의 특이성을 평가하는 것이다. 

비디오: Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance can be caused by a range of mechanisms, including increased drug elimination, decreased drug uptake, drug inactivation and alterations of drug targets. Recent data showed that other than by well-known genetic (mutation, amplification) and epigenetic (DNA hypermethylation, histone post-translational modification) modifications, drug resistance mechanisms might also be regulated by splicing aberrations. This is a rapidly growing field of investigation that deserves future attention in order to plan more effective therapeutic approaches. The protocol described in this paper is aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of several in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes. In particular, we evaluated the differential splicing of DDX5 and PKM transcripts. The aberrant splicing detected by the computational tool MATS was validated in leukemic cells, showing that different DDX5 splice variants are expressed in the parental vs. resistant cells. In these cells, we also observed a higher PKM2/PKM1 ratio, which was not detected in the Panc-1 gemcitabine-resistant counterpart compared to parental Panc-1 cells, suggesting a different mechanism of drug-resistance induced by gemcitabine exposure.

Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models

Here we describe a protocol aimed at investigating the impact of aberrant splicing on drug resistance in solid tumors and hematological malignancies. To this goal, we analyzed the transcriptomic profiles of parental and resistant in vitro models through RNA-seq and established a qRT-PCR based method to validate candidate genes.

에 약물 저항 관련 소설 스플 라이스 변종을 감지하는 RNA 시퀀싱을 사용하여<em&gt; 체외</em&gt; 암 모델

Drug resistance remains a major problem in the treatment of cancer for both hematological malignancies and solid tumors. Intrinsic or acquired resistance ...

연구

암 연구학

Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; therefore their preparation should be conducted under an inert atmosphere. Evaluation of the anticancer activity of these complexes can be achieved by the MTT assay.
The MTT assay is a colorimetric viability assay based on enzymatic reduction of the MTT molecule to formazan when it is exposed to viable cells. The outcome of the reduction is a color change of the MTT molecule. Absorbance measurements relative to a control determine the percentage of remaining viable cancer cells following their treatment with varying concentrations of a tested compound, which is translated to the compound anticancer activity and its IC50 values. The MTT assay is widely common in cytotoxicity studies due to its accuracy, rapidity, and relative simplicity.
Herein we present a detailed protocol for the synthesis of air sensitive metal based drugs and cell viability measurements, including preparation of the cell plates, incubation of the compounds with the cells, viability measurements using the MTT assay, and determination of IC50 values.

A method for synthesis of air-sensitive titanium and vanadium anticancer agents is described, along with the evaluation of their cytotoxic activity towards human cancer cell line by the MTT Assay.

MTT의 분석에 의해 합성 및 세포 독성 평가 : 항암 금속 합성물

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

화학

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with or without surgery. While platinum-based chemotherapy regimens currently represent the gold standard in terms of efficacy and are given in the vast majority of cases, new chemotherapy regimens, namely immunotherapy are emerging. However, the response rates and therapy resistance mechanisms for either chemo regimen are hard to predict and remain insufficiently understood. Broad variations of chemo and radiation resistance mechanisms are known to date. This study describes the development of a standardized, high-throughput in vitro assay to assess HNSCC cell line&#39;s response to various therapy regimens, and hopefully on primary cells from individual patients as a future tool for personalized tumor therapy. The assay is designed to being integrated into the quality-controlled standard algorithm for HNSCC patients at our tertiary care center; however, this will be subject of future studies. Technical feasibility looks promising for primary cells from tumor biopsies from actual patients. Specimens are then transferred into the laboratory. Biopsies are mechanically separated followed by enzymatic digestion. Cells are then cultured in ultra-low adhesion cell culture vials that promote the reproducible, standardized and spontaneous formation of three-dimensional, spheroid-shaped cell conglomerates. Spheroids are then ready to be exposed to chemo-radiation protocols and immunotherapy protocols as needed. The final cell viability and spheroid size are indicators of therapy susceptibility and therefore could be drawn into consideration in future to assess the patients&#39; likely therapy response. This model could be a valuable, cost-efficient tool towards personalized therapy for head and neck cancer.

We describe the evolution of a spheroid-based, three-dimensional in vitro model that enables us to test the current standard of experimental therapy regimens for head and neck squamous cell carcinoma on cell lines, aiming at evaluating therapy susceptibility and resistance on primary cells from human specimens in the future.

머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 회전 타원 체 기반 3D 셀 문화 모델에서 테스트 하는 치료

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines respond to therapeutic compounds in 2D (dimensional) monolayer cell cultures, 3D culture systems were developed to understand the efficacy of drugs in more physiologically relevant models. In recent years, a paradigm shift was observed in pre-clinical research to validate the potency of new molecules in 3D culture systems, more precisely mimicking the tumor microenvironment. These systems characterize the disease state in a more physiologically relevant manner and help to gain better mechanistic insight and understanding of the pharmacological potency of a given molecule. Moreover, with the current trend in improving in vivo cancer models, zebrafish has emerged as an important vertebrate model to assess in vivo tumor formation and study the effect of therapeutic agents. Here, we investigated the therapeutic efficacy of hydroxycoumarin OT48 alone or in combination with BH3 mimetics in lung cancer cell line A549 by using three different 3D culture systems including colony formation assays (CFA), spheroid formation assay (SFA) and in vivo zebrafish xenografts.

Here, we present the preclinical screening of anticancer coumarins using 3D culture and zebrafish.

Spheroids, 식민지 대형 분석 실험, 그리고 Zebrafish Xenografts 제 Coumarin OT48의 Bioactivity의 전 임상 평가

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy against cancer. Here we provide a protocol to identify a rational combination at the preclinical step. First, we describe a cell-based assay to assess the synergism between anticancer mAb and cytotoxic drugs, that uses the combination index equation of Chou and Talalay1. This includes the measurement of tumor cell drug- and antibody-sensitivity using an MTT assay, followed by an automated computer analysis to calculate the combination index (CI) values. CI values of &lt;1 indicate synergism between tested mAbs and cytotoxic agents1. To corroborate the in vitro findings in vivo, we further describe a method to assess the combination regimen efficacy in a xenograft tumor model. In this model, the combined regimen significantly delays tumor growth, which results in a significant extended survival in comparison to single-agent controls. Importantly, the in vivo experimentation reveals that the combination regimen is well tolerated. This protocol allows the effective evaluation of anticancer drug combinations in preclinical models and the identification of rational combination to evaluate in clinical trials.

This protocol describes how to assess synergism between an anticancer antibody and antineoplastic drugs in preclinical models by using the combination index equation of Chou and Talalay.

Potentiation Antineoplastic 약물으로 항 암 항 체 효능: 조합 인덱스 방정식을 사용 하 여 항 체-마약 성분의 검출

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target protein. Due to its several advantages over monoclonal antibodies, aptamer development has gained enormous popularity among cancer researchers. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) is the most common method of developing aptamers specific for proteins of interest. Following SELEX, a quick and efficient binding assay accelerates the process of identification, confirming the selectivity and specificity of the aptamer. 
This paper explains a step-by-step flow cytometric-based binding assay of an aptamer specific for epithelial cellular adhesion molecule (EpCAM). The transmembrane glycoprotein EpCAM is overexpressed in most carcinomas and plays roles in cancer initiation, progression, and metastasis. Therefore, it is a valuable candidate for targeted drug delivery to tumors. To evaluate the selectivity and specificity of the aptamer to the membrane-bound EpCAM, EpCAM-positive and -negative cells are required. Additionally, a non-binding EpCAM aptamer with a similar length and 2-dimensional (2D) structure to the EpCAM-binding aptamer is required. The binding assay includes different buffers (blocking buffer, wash buffer, incubation buffer, and FACS buffer) and incubation steps. 
The aptamer is incubated with the cell lines. Following the incubation and washing steps, the cells will be evaluated using a sensitive flow cytometry assay. Analysis of the results shows the binding of the EpCAM-specific aptamer to EpCAM-positive cells and not the EpCAM-negative cells. In EpCAM-positive cells, this is depicted as a band shift in the binding of the EpCAM aptamer to the right compared to the non-binding aptamer control. In EpCAM-negative cells, the corresponding bands of EpCAM-binding and -non-binding aptamers overlap. This demonstrates the selectivity and specificity of the EpCAM aptamer. While this protocol is focused on the EpCAM aptamer, the protocol is applicable to other published aptamers.

A necessary step in anticancer aptamer development is to test its binding to the target. We demonstrate a flow cytometric-based assay to study this binding, emphasizing the importance of including a negative control aptamer and cancer cells that are positive or negative for that particular protein.&#160;

항암 압타머의 선택성 및 특이성을 평가하기 위한 유세포분석 기반 세포 표면 단백질 결합 분석

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a lack of clinical efficacy. This high failure rate illuminates the inability of the current preclinical models to predict clinical efficacy, mainly due to their inadequacy in reflecting tumor heterogeneity and the tumor microenvironment. These limitations can be addressed with 3-dimensional (3D) culture models (spheroids) established from human tumor samples derived from individual patients. These 3D cultures represent real-world biology better than established cell lines that do not reflect tumor heterogeneity. Furthermore, 3D cultures are better than 2-dimensional (2D) culture models (monolayer structures) since they replicate elements of the tumor environment, such as hypoxia, necrosis, and cell adhesion, and preserve the natural cell shape and growth. In the present study, a method was developed for preparing primary cultures of cancer cells from individual patients that are 3D and grow in multicellular spheroids. The cells can be derived directly from patient tumors or patient-derived xenografts. The method is widely applicable to solid tumors (e.g., colon, breast, and lung) and is also cost-effective, as it can be performed in its entirety in a typical cancer research/cell biology lab without relying on specialized equipment. Herein, a protocol is presented for generating 3D tumor culture models (multicellular spheroids) from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using two complementary approaches: a cell-viability assay (MTT) and microscopic examinations. These multicellular spheroids can be used to assess potential drug candidates, identify potential biomarkers or therapeutic targets, and investigate the mechanisms of response and resistance.

The present protocol describes generating 3D tumor culture models from primary cancer cells and evaluating their sensitivity to drugs using cell-viability assays and microscopic examinations.

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

결합 된 3 차원 조직은 엔지니어링<em&gt; 체외</em&gt; /<em&gt; 인 실리코</em특정 돌연변이 배경에서 약물의 효과를 예측&gt; 폐 종양 모델

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

생체공학

Quantifying Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity in a Tumor Spheroid Model: Application for Drug Discovery

Monoclonal antibody-based immunotherapy targeting tumor antigens is now a mainstay of cancer treatment. One of the clinically relevant mechanisms of action of the antibodies is antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), where the antibody binds to the cancer cells and engages the cellular component of the immune system, e.g., natural killer (NK) cells, to kill the tumor cells. The effectiveness of these therapies could be improved by identifying adjuvant compounds that increase the sensitivity of the cancer cells or the potency of the immune cells. In addition, undiscovered drug interactions in cancer patients co-medicated for previous conditions or cancer-associated symptoms may determine the success of the antibody therapy; therefore, such unwanted drug interactions need to be eliminated. With these goals in mind, we created a cancer ADCC model and describe here a simple protocol to find ADCC-modulating drugs. Since 3D models such as cancer cell spheroids are superior to 2D cultures in predicting in vivo responses of tumors to anticancer therapies, spheroid co-cultures of EGFP-expressing HER2+ JIMT-1 breast cancer cells and the NK92.CD16 cell lines were set up and induced with Trastuzumab, a monoclonal antibody clinically approved against HER2-positive breast cancer. JIMT-1 spheroids were allowed to form in cell-repellent U-bottom 96-well plates. On day 3, NK cells and Trastuzumab were added. The spheroids were then stained with Annexin V-Alexa 647 to measure apoptotic cell death, which was quantitated in the peripheral zone of the spheroids with an automated microscope. The applicability of our assay to identify ADCC-modulating molecules is demonstrated by showing that Sunitinib, a receptor tyrosine kinase inhibitor approved by the FDA against metastatic cancer, almost completely abolishes ADCC. The generation of the spheroids and image acquisition and analysis pipelines are compatible with high-throughput screening for ADCC-modulating compounds in cancer cell spheroids.

Here, we present a method to identify compounds that modulate the ADCC mechanism, an important cancer cell-killing mechanism of antitumor antibodies. The cytotoxic effect of NK cells is measured in breast cancer cell spheroids in the presence of Trastuzumab. Image analysis identifies live and dead killer and target cells in spheroids.

종양 스페로이드 모델에서 항체 의존성 세포 독성 정량화: 약물 발견을 위한 응용

Monoclonal antibody-based immunotherapy targeting tumor antigens is now a mainstay of cancer treatment. One of the clinically relevant mechanisms of ...

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

암 약물 과민 반응의 효과를 평가<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

항암 약의 특이성 평가

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