이 프로토콜은 매우 드문 INK T 세포의 정화를 가능하게하고, 그들의 수에 30 배 확장을 허용한다. 정제는 하루에 수행 될 수 있으며 2 주 동안 생체 내 및 체외 연구를위한 즉시 사용할 수있는 잉크 T 세포의 많은 수를 생성 할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 실험실의 사후 문서인 글로리아 델판티(Gloria Delfanti)입니다.
마우스 비장을 해부 한 후, 70 나노 미터 세포 스트레이너를 통해 분쇄하여 2 % FBS로 PBS의 10 밀리리터에서 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 원심분리기는 5분간 300배 G로 합니다. 상체를 제거하고 멸균 암모늄 염화 칼륨 리신 버퍼의 1 밀리리터로 세포 펠릿을 다시 분리합니다.
실온에서 3분 동안 세포를 배양한 다음 2%의 FBS로 PBS 5밀리리터로 차단합니다. 원심분리기는 5분간 300배 G로 합니다. 상체를 제거 한 후, 2 %의 FBS와 PBS의 세 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 파이펫팅하여 지방 잔류물을 제거합니다.
농축 단계를 위해 세포를 차갑게 유지하고 섭씨 4도에서 미리 냉각된 다음 얼음 위에 보관하는 솔루션을 사용합니다. 원심분리기는 5분간 300배 G로 합니다. 2%FPS 및 Fc 차단제로 적절한 양의 PBS로 모든 셀을 재중단하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
1,000만 개의 세포당 MACS 분리 버퍼1~2밀리리터로 세척하고 10분 동안 300배 G에서 원심분리기로 세척합니다. 상체를 제거한 후 CD19-FITC 및 H2-IAb-FITC로 세포를 염색하고 4-8°C에서 어둠 속에서 15분 동안 배양합니다. 1,000만 개의 세포당 MACS 버퍼1~2밀리리터를 추가하고 10분 동안 300배 G의 원심분리기를 추가하여 셀을 세척합니다.
1,000만 개의 세포당 90마이크로리터의 MACS 버퍼에서 수퍼를 제거하고 세포 펠릿을 재연합니다. 1,000만 개의 세포당 10마이크로리터의 안티 FITC 마이크로비드를 추가합니다. 잘 섞고 4~8도의 어둠 속에서 15분간 배양하세요.
1,000만 개의 세포당 MACS 버퍼1~2밀리리터를 추가하고 10분 동안 300배 G의 원심분리기를 추가하여 세포를 세척합니다. 상체를 제거하고 MACS 버퍼의 500 마이크로 리터에서 최대 1억 2,500만 개의 세포를 재연하십시오. MACS 분리기의 자기장에 LD 컬럼을 배치합니다.
막힘을 피하려면 LD 열에 사전 분리 필터를 적용하고 MACS 버퍼의 두 밀리리터로 헹신다. 셀 서스펜션을 필터에 적용하고 컬럼을 통과하는 레이블이 없는 셀을 수집합니다. MACS 버퍼 1밀리리터로 빈 기둥 저장소를 세 번 씻으시면 됩니다.
T 세포농축 유출물을 수집하고 세포를 계산하여 FACS 분석을 위해 50마이크로리터를 유지합니다. 5 분 동안 300 회 G에서 원심 분리 한 후, 상체를 제거하고 CD1d 테트라머 -PE로 세포를 얼룩. 잘 섞어서 얼음 의 어둠 속에서 30 분 동안 배양하십시오.
1,000만 개의 세포당 MACS 버퍼의 1~2밀리리터를 추가하여 셀을 세척합니다. 10분 동안 300회 G에서 원심분리 후, 1,000만 개의 세포당 80마이크로리터의 MACS 버퍼에서 수퍼나탄을 제거하고 세포 펠릿을 재보페한다. 1,000만 개의 세포당 20마이크로리터의 안티-PE 마이크로비드를 추가합니다.
잘 섞고 4~8도의 어둠 속에서 15분간 배양하세요. 1,000만 개의 세포당 MACS 버퍼1~2밀리리터를 추가하고 10분 동안 300배 G의 원심분리기를 추가하여 셀을 세척합니다. 상체를 제거하고 MACS 버퍼의 500 마이크로 리터에서 최대 1 억 개의 세포를 다시 일시 중단하십시오.
셀 수에 따라 LS 또는 MS 컬럼을 MACS 분리기의 자기장에 배치하고 MACS 버퍼로 컬럼을 헹구는다. 셀 서스펜션을 컬럼에 적용하고, 이전에 설명한 대로 열을 세 번 통과하고 세척하는 레이블이 없는 세포를 수집합니다. 이것은 음수 분수입니다.
자기장에서 컬럼을 제거하고 새 수집 튜브에 배치합니다. 파이펫 MACS는 컬럼에 버퍼링하고 제공된 플런저를 컬럼으로 밀어 잉크 T 셀에 농축된 양수 분획을 플러시합니다. INK T 셀 복구를 더욱 증가시키기 위해 음극을 10분 동안 300배 G로 원심분리하고 새로운 LS 또는 MS 열을 사용하여 이전 단계를 반복합니다.
양수 분획을 당기고 셀 수를 결정합니다. FACS 분석을 위해 50마이크로리터를 양수 및 음극분수 모두 유지하여 순도를 확인합니다. 1대1 비율로 INK T 세포를 활성화하려면 항 CD3 및 CD28 자기 구슬의 적절한 부피를 튜브로 옮기고 PBS의 동일한 부피로 5초 동안 소용돌이를 전달합니다.
튜브를 자석에 1분간 놓고 상체를 폐기합니다. 자석에서 튜브를 제거하고 RPMI의 적절한 부피에서 세척 된 자기 구슬을 다시 분리합니다. 원심분리기는 잉크 T 세포를 5분 동안 300배 G로 정결하고 마우스 T-활성제 안티 CD3 또는 CD28 자기 구슬과 혼합합니다.
셀 서스펜션의 1밀리리터, 안티 CD23 및 CD28 마그네틱 구슬을 48웰 플레이트에 넣고 밀리리터 IL-2당 20단위를 한 다음 섭씨 37도에서 배양합니다. 5 일 후, 추가 10 밀리 리터 IL-7 당 나노 그램. 80~90%의 합류에 도달하면 세포를 반으로 나누고, 항상 밀리리터 IL-2당 20단위, 밀리리터 IL-7당 10나노그램을 추가합니다.
이러한 조건하에서 INK T 세포는 최대 15일 동안 확장할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여, 잉크 T 세포는 면역 자기 분리 과정을 통해 형질전환 마우스의 비장에서 풍부하게 된다. 농축 후, 세포는 항 CD3 및 CD28 구슬로 확장될 수 있으며, 그 결과 배양14일까지 평균 30배의 확장이 가능합니다.
안티 CD3 및 안티 CD 비드를 통한 강력한 활성화는 세포 표면에 IMK T 세포 TCR 발현의 다운레핑을 유도하고 이중 음수 집단이 나타났다. 확장된 잉크 T 세포의 대다수는 CD4 음성입니다. 계보 특이적 전사 인자 PLZF 및 ROR 감마 T의 특성화는 0일 및 14일에 농축된 잉크 T 세포에 대한 NKT1, NKT2 및 NKT17 표현형을 식별할 수 있게 하였다.
농축 된 잉크 T 세포는 PMA 및 이오노마이신 자극 후 인터페론 감마와 IL-4의 분비에 의해 확인된 바와 같이 14 일 간의 확장 후 보존되는 T80과 같은 이펙터 표현형을 보여줍니다. 정화 단계 동안, 미리 냉각 된 솔루션으로 빠르게 작동하고 파이펫하는 동안 볼 수있는 지방 잔류물을 제거해야합니다. 확장된 INK T 세포는 유전자 전달 또는 편집을 통해 기능적 수정 후에도 체외 분석 및 생쥐로의 생체 내 전달을 위해 악용될 수 있다.
INK T 세포의 체외 확장은 빈약에 의해 주어진 한계를 극복, 종양 면역 감시의 분야에서 전임상 연구에서 악용 만들기, 전염병, 및 자동 면역.
