시투 혼성화의 전산은 과학자들이 배아 발달의 분자 기초를 이해할 수 있게 하는 강력한 기술입니다. "전체 마운트"는 조직 조각뿐만 아니라 전체 배아가 사용될 것임을 나타냅니다. ""그 자리에서"위치"를 의미하는 라틴어 문구입니다. 그리고 마지막으로, "혼성화"는 유기체의 세포 내의 mRNA 전사체에 합성적으로 생성된 RNA 분자의 상호 결합을 지칭한다.

이 비디오는 발달 장애에 대한 이해를 더 잘 할 수있는이 기술의 절차, 예상 결과 및 선택 된 응용 프로그램을 보여줍니다.

유기체 형태 발생의 기초유전자는 배아 발달 과정에서 시간적으로 공간적으로 제한된 패턴으로 표현된다.

리보프로브라고 불리는 합성 생산RNA 프로브는 상호 보완적인 결합에 의해 mRNA를 검출하는 데 사용됩니다. 리보프로브는 디니트로페놀, 비오틴 또는 디포산소신과 같은 "haptens"를 함유한 특수 뉴클레오티드로 표시된다. Haptens는 더 큰 분자에 붙어 있을 때 면역 반응을 유도할 수 있는 분자이고, 그러므로 항체 결합을 위한 표적입니다. 이러한 검출 항체는 고추냉이 과산화효소 또는 알칼리인스파아제와 같은 효소에 결합되어 형광 또는 착색염이 증착될 수 있는 화학 반응을 촉매하는 것이다.

기존의 시상 혼성화 기술은 내부 구조물의 검출을 용이하게 하기 위해 배아의 조직 섹션의 준비를 필요로 한다. 그 결과, 유기체 전체의 유전자 발현에 대한 완전한 평가는 컴퓨터 소프트웨어의 도움으로 5-6 μm 조직 조각에서 재구성되어야 합니다. 그러나, 전산 기술의 발달과 함께, 전체 태아 내의 더 큰 거리에 대한 유전자 발현 분석을 얻을 수 있다.

현장에서 전체 마운트의 원리를 살펴보고 후, 단계별로 실험 프로토콜을 살펴보겠습니다.

이 절차의 첫 번째 단계는 조사될 모델 유기체에서 표적 서열의 식별을 포함한다. 표적 DNA 서열은 RNA 폴리머라제 개시 서열을 포함하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭된다. 증폭된 DNA 템플릿은 이제 hapten 표지된 뉴클레오티드로 체외에서 전사됩니다. 이 햅텐 레이블리보프로브는 이제 혼성화 단계에 대한 준비가 되었습니다.

배아는 단백질을 안정시키고 RNass로부터 보호하는 교차 연결 시약인 포름알데히드로 고정을 통해 혼성화를 위해 준비됩니다. 고정 후, 포름알데히드는 트위엔과 같은 소량의 세제를 함유한 인산염 완충식염으로 배아를 여러 번 세척하여 제거된다. 세포 지질을 제거하고 조직에 프로브 침투를 용이하게하기 위해, 배아는 메탄올 세정의 등급 이열에서 탈수된다: 예를 들어: 25%, 50%, 75%, 100% 메탄올. 배아는 -20°C에서 최대 1개월(또는 그 이상)동안 100% 메탄올로 보존될 수 있다.

혼성화를 위해 배아를 준비하려면 세척당 메탄올이 점진적으로 적은 채의 메탄올세척제로 채점된 일련의 메탄올 세척에 의해 재수화되어야 합니다. 배아는 조직에 리보 프로브의 확산을 용이하게하기 위해 프로테아프로 소화된다. 표지된 리보프로브가 배아에 첨가되고 혼성화가 수행된다.

하이브리드화 후 세차스는 비특이적 혼성화를 제거하기 위해 수행됩니다. RNases A T1은 단일 좌초 RNA를 소화하여 불완전하게 혼성화된 프로브를 제거하기 위해 첨가됩니다. 혼성 프로브는 햅텐 라벨리보프로브를 결합하는 항체 효소 컨쥬게이트로 검출된다. 앞서 언급했듯이, 알칼리성 인산염과 같은 효소는 햅텐 특이적 항체에 접합되고, 색 변화를 유도하기 위해 효소 기판을 첨가하여 검출된다. 반응 생성물은 이 예에서 볼 수 있듯이 발현 된 mRNA의 위치를 표시하는 어두운 보라색 침전물을 형성한다.

이제 시투 혼성화에서 전체 마운트를 수행하는 방법을 알고 있으므로 이 기술의 일부 응용 프로그램을 살펴보겠습니다.

시투 혼성화의 전체 탈것은 과학자들이 말라리아, 뎅기열 및 웨스트 나일 질병과 같은 치명적인 모기 매개 질병을 해결하는 데 사용되었습니다. 모기 의 번식 및 개발에 관여하는 유전자를 특성화함으로써, 새로운 생물학적 또는 화학 살충제는 질병을 운반하는 모기를 더 잘 표적으로 하기 위하여 디자인될 수 있습니다.

이 기술의 또 다른 응용 프로그램은 테라토겐, 또는 태아 발달을 방해하는 에이전트에 노출과 관련되었던 유전자 발현 패턴 변경의 특성화를 관련시킵니다.

여기서, 시투 혼성화의 전체 탈은 알코올에 노출 된 후 발현 패턴이 변경되는 유전자를 식별하기 위해 태아 알코올 증후군의 제브라피시 모델에 사용되었습니다. 이것은 자궁 알콜 노출에 있는 결과를 완화하기 위하여 치료의 발달에 있는 것을 도울 수 있습니다.

시투 혼성화의 전체 탈것은 선천성 질환과 관련된 현상적 변화를 검증하는 데도 사용될 수 있다. Bardet-Biedl 증후군과 관련되었던 돌연변이는 합성으로 생성된 돌연변이 mRNAs를 통해 제브라피시 배아로 소개되었습니다. 정의된 기간 이후에, 태아는 결함의 엄격에 근거를 둔 그룹으로 분할되었습니다. 돌연변이 유전자의 하류 유전자의 발현을 시각화하는 것은 표현성 변화를 검증하는 데 사용되었다. 따라서, 피노티픽 채점과 함께 시투 혼성화의 전체 마운트는 발달 결함의 근본적인 특정 돌연변이의 역할에 대한 더 나은 이해를 용이하게 할 수 있다.

당신은 단지 시투 혼성화의 전체 마운트에 JoVE의 비디오를 보았다. 이 기술은 유기체 내의 유전자 발현의 정확한 시간 적 및 공간 특성화를 가능하게 하는 강력한 도구입니다. 현장에서 의 전산 혼성화는 현재 다수의 모델 유기체에서 발달하는 동안 유전자 발현 패턴의 아틀라스를 생성하는 데 사용되고 있다. 이러한 연구는 암을 포함한 인간 질환을 치료하는 새로운 치료법의 개발을 용이하게 할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사합니다!