This work was supported by EMBO (to Y.E.), Foundation Machaon (to Y.E.) and SNSF (to B.A.I.). We thank the Bioimaging Core Facility for the availability of the Nikon A1r microscope and technical assistance. We thank Mrs. Clarissa Bartley for English correction.

참고 : 동물 절차는 스위스 제네바에서 동물 관리의 기관 윤리위원회와 분할 한 수의학 사무소에 따라 수행되었다. 인증 번호 GE / 14분의 63. 골수에서 단일 세포 현탁액 1. 준비 <ol><li> 자궁 전위에 의해 희생 마우스 (구 8-12주). 70 % 에탄올로 뒷다리를 소독. 뒷다리에서 피부를 제거합니다. </li><li> 마우스 대퇴골과 경골을 해부하고 메스와 다리에서 조직을 제거합니다. PBS로 가득 배양 접시에 90 %의 에탄올과 장소 다리를 씻어. </li><li> 무릎 관절에 메스 분리와 대퇴골과 경골의 문화 후드, 깨끗한 조직에서. 뼈의 양쪽 끝을 잘라. </li><li> 50 ㎖에 23G 바늘과 준비 매체 (페놀 레드가없는 DMEM / F12, 1 %의 쥐 혈청)로 채워진 1 ML의 주사기를 사용하여 각각의 뼈에서 플러시 골수 튜브 나사. 섬세 23G 북동 통해 계대에 의해 세포 집합체를 중단edle과 1 ML의 주사기. 준비 배지 25 ml의 총 부피를 가져와. </li><li> 원심 분리기 250 XG, 5 분, 4 ℃. 폐기 뜨는. 1 용액에 재현 탁 펠릿은 적혈구 용해 RBLC 버퍼 15 ㎖의 튜브 나사 (8.3 g NH 4 CL, 증류수 1 L에 완전한 1g의 수 NaHCO3, 1 ml의 EDTA (100 밀리미터), 0.22 μm의 필터링). 얼음에 30 초를 품어. </li><li> 준비 매체와 원심 분리기 250 XG 10 ㎖, 5 분, 4 ° C를 추가합니다. 2 ml의 준비 매체에 뜨는에 resuspend 폐기하십시오. </li></ol> 음의 선택 2. 호중구 심화 <ol><li> 마우스 호중구 농축 칵테일 (전지 분리 플랫폼 키트 등 EasySep 등)의 150 μl를 추가합니다. 혼합 및 10 분 동안 얼음 위에서 배양한다. </li><li> 페놀 레드없는 DMEM의 10 ML을 추가합니다. 한 번 반전 및 원심 분리기 250 XG, 3 분, 4 ℃. </li><li> 폐기 뜨는. 바닥 튜브 라운드 5 ml의 폴리스티렌 1.75 ml의 준비 매체에 재현 탁 펠렛. 250 μL 비오 추가선택 칵테일. 혼합 및 10 분 동안 얼음 위에서 배양한다. </li><li> 입자를 재현 탁 30 초 동안 (전지 분리 플랫폼 키트) 자성 입자를 소용돌이. 세포 현탁액 500 μL 자성 입자를 추가합니다. 혼합 및 10 분 동안 얼음 위에서 배양한다. </li><li> 자석에 튜브를 놓습니다. 3 분을 기다립니다. </li><li> 원하는 레이블이없는 세포를 수집하기 위해 바닥 튜브 라운드 새로운 5 ml의 폴리스티렌에 자석 전환. 튜브에 매달려 마지막 한 방울을하지 마십시오. 원하지 않는 세포는 자석 내부의 튜브에 남아있게됩니다. 생물 학적 폐기물로이 튜브를 폐기하십시오. </li><li> 자석에 새 튜브를 놓습니다. 3 분을 기다립니다. </li><li> 새로운 15 ml를 원하는 표지 된 세포를 수집하기 위해 관 나사에 자석을 전환. 튜브에 매달려 마지막 한 방울을하지 마십시오. </li><li> 페놀 레드없는 DMEM 5 ml의 완전한 볼륨. </li></ol> 호중구 3. 라벨링 <ol><li> 휴대 추적기 오렌지으로 오렌지 염료의 0.5 μl를 추가 (작업 농도1 μM, CMRA - 클로로 메틸 rodol 아세테이트, 주식 DMSO 10 mm)이다. 37 ℃에서 2 분을 품어. </li><li> 준비 매체의 2.​​5 ML을 추가합니다. 원심 분리기 250 XG, 5 분, 4 ℃. </li><li> 폐기 뜨는. 1.5 ML 튜브에 1 ㎖의 준비 매체에 재현 탁 펠렛. </li><li> hematocytometer를 함께 계산하는 나누어지는 가져 가라. </li><li> 37 ℃에서 5 분을 품어. 원심 분리기 250 XG, 5 분, 4 ℃. </li><li> 폐기 뜨는. 1 ml의 PBS에 재현 탁 펠렛. 원심 분리기 250 XG, 5 분, 세척 4 ° C. </li><li> 폐기 뜨는. 100 μL PBS 당 10 × 10 6 세포 등을 Resuspend 펠렛. IV 주입까지 얼음에 보관하십시오. 참고 : 세포가 IV는 가능한 한 빨리 주입해야한다. 6-12x10 6 호중구 / 마우스는 일반적으로 얻을 수있다. </li></ol> 생체 내에 현미경 4. 마우스 준비 주 :.. 단계 4.1) 및 4.2)에 IC 표지 호중구 오랜 대기 시간을 방지하기 위해 실험의 시작에서 수행되어야이자형. <ol><li> CX 3 (CR1)의 GFP 마우스 (구 8~12주)를 달아. </li><li> (PBS에 1.75 ㎎ / ㎏ acepromazone 케타민 60 ㎎ / ㎏, 자일 라진 4.5 ㎎ / ㎏) 마취제의 800 μl를 준비합니다. </li><li> 마우스를 마취. 마우스의 200 μL / 20g와 사출 IP. 곤란 발가락으로하고 호흡을 확인하여 제어 마취. </li><li> 호중구 (100 μL PBS에 10 × 10 6 세포) 정맥 실험자의 편의에, 측면 꼬리 정맥 또는 역 궤도 동을 사용하여 주입한다. </li><li> 가열 패드에 마우스를 놓고 눈 젤 눈을 보호 할 수 있습니다. </li><li> 유리 커버 슬립 (35mm 직경)는 직경 30mm의 구멍을 갖는 10cm 조직 배양 접시에 넣고있다. 사용 된 오일과 접촉하는 커버 슬립 조직 배양 접시를 유지하는 것이다. </li><li> 복막을 노출 가위로 복부 피부를 절개. 소장을 노출 가위로 복막을 절개. </li><li> 200 ㎕의 PBS로는 P (37 ℃에서 예비 가열)를 추가eritoneal 공동. 당신의 손에 마우스를 가지고 소장은 부드러운 압력으로 복강에서 얻을 수 있도록이 아래를 향십시오. 조직 배양 접시에 마우스를 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 장간막 혈관을 노출하기 위해 커버 슬립에 멸균 면봉으로 장을 deroll. </li><li> 대역에서 종이 조직을 잘라 37 ℃ 가열 PBS로 그들을 젖은. 연동 운동에 의한 운동을 감소 종이 조직의 조각을 고정 부위. </li><li> 거꾸로 현미경의 맞춤형 트레이 무대에 37 ° C 온도 조절 챔버 내부의 조직 배양 접시와 마우스를 넣습니다. 뒷다리에 마취제 사우스 캐롤라이나를 포함하는 주사기를 소개합니다. 참고 : 또한, 마우스 마스크와 산소 (0.5 L / 분)를받을 수 있습니다. </li><li> 발가락이 곤란 및 호흡마다 30 분을 확인하여 마취에 대한 제어 마우스. 필요한 경우, 적절하게 마취를 유지하기 위해 마취의 향상 (20 μl를) 제공합니다. 아니E : 혈관의 건조는 피해야한다. 따라서, 그 습도 정기적 37 ° C-PBS로 가온 부위를 고정하기 위해 사용 된 종이 조직 습윤에 의해 유지된다. </li></ol> 생체 내에 현미경을 사용하여 생체 내에서 염증 선박 5. 측정 호중구와 단핵구 행동 <ol><li> 설정 레이저는 488- 레이저에 의한 광독성을 방지하기 위해 필요한 최저 전력에서 561-합니다. 실험에서는, 0.5 % 미만이다. 호중구에서 단핵 세포에서 GFP와 오렌지 염료의 강도는 일반적으로 0.3 %가 충분 너무 밝습니다. 참고 :이 우리의 체제와 0.15 mW의 0.25의 레이저 출력을 나타냅니다. </li><li> 거꾸로 현미경의 20X 건조 목표를 사용하여 오픈 핀홀 2.2 초에 512 X 512 픽셀 (즉, 635 μm의)의 이미지를 획득. 낮은 레이저 파워와 충분한 신호를 보장 20 μm의 10 ~ Z-깊이를 사용합니다. 참고 : 우리는 보통 12 ~ 16 사이의 Z-깊이 실험을 수행(56); M. 제시된 도면 및 동영상의 경우, Z-20 μm의 깊이이다. 위상차 내피 벽의 식별이 가능하고 촬상은 장간막 정맥상에서 수행된다. 순찰 세포가 관심 분야를 기록, 5-10 μm의 / 분 (6)의 속도가 매우 느리게 이동 이후 매 20 초 만족 스럽다. 설명 된 설정으로, 전동 스테이지 동시에 관심 최대 7 필드의 기록을 허용한다. </li><li> 이를 첫 번째 동영상의 획득 전에 30 분 동안 제제로부터 복구 할 수있는 마우스 및 현미경의 서모 스탯 실 장간막 혈관을 놓는다. 이 기간 동안 관심의 여러 필드를 선택합니다. 목적에 가장 가까운 혈관의 내강 표면에 초점을 맞 춥니 다. 필요한 경우, 포커스를 설정할 내피 약간 자동 형광 활용. 참고 : 마우스를 준비하는 동안 수술은 약간 내피을 강조하고있다. 결과적으로 호중구의 압연/ 또는 단핵 세포는 처음 15 분 다음 마우스 제제에서 관찰 될 수있다. </li><li> 정상 상태의 조건에서 30 분, 하나의 이미지 매 20 초 동안 첫 번째 영화를 기록합니다. 참고 :이 소프트웨어는 2.2 초에 대한 관심의 각 필드를 취득하고, 모터 단계는 자동으로 다른 하나의 필드에서 이동합니다. 그것은 영화의 기록을 30 분 동안 다시 20 초 이내에 제 1 위치로 간다. </li><li> 혈관 염증을 개시, TLR2 100㎍을 함유 PBS 20 μL의 방울을 추가 / TLR1 작용제 Pam3CSK4 12 직접 묘화 혈관 상. </li><li> 관심의 각 필드에 대해 초점을 제어 할 수 있습니다. 참고 : 인수하는 과정에서 항상 존재 z 축에 초점이 약간 변경됩니다. 10 ~ 20 μm의 z의 깊이에도 불구하고,이 형광 강도의 감소가 발생할 수 있습니다. 필요에 따라서, 수동으로 각 영화의 끝에서 관심있는 각각의 필드를 집중할. 30 분 - 기간과 3 시간까지 기록 영화탈 염증의 개시 후. </li><li> 실험의 마지막에, 경부 탈구에 의해 마취 된 마우스를 희생. </li></ol> 동영상 파일과 백혈구의 추적의 6 세대 참고 : 니콘 수집 소프트웨어는 파일을 .nd2 발생하지만 다음 절차는 다른 소프트웨어 및 브랜드와 유사하다. <ol><li> 티파니 시리즈로 내보내기 파일. </li><li> ImageJ에 소프트웨어 (이동 <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ). TIFF 시리즈를 가져옵니다. 다른 파일로 각 채널. </li><li> 배경 잡음을 줄일 수있는 녹색과 적색 채널 (공정&gt; 필터&gt; 중간 ...) 2.0 픽셀의 반경과 중간 필터를 적용합니다. </li><li> (이진 만들기&gt; 프로세스&gt; 이진) 바이너리로 파일을 변환 할 수 있습니다. 각각의 이미지에 대한 임계치를 계산하는 소프트웨어를 사용. </li><li> 하나의 이미지 시리즈 (이미지&gt; 색상&gt; ... 채널 병합)에 채널을 병합합니다. 초에서 단핵구를 선택N 채널, 적색 채널 및 채널에 회색 투과광에서 호중구. </li><li> RGB 색상에 쌓인 이미지 변환 (이미지&gt; 색상&gt; RGB로 스택). </li><li> .AVI와 같은 파일을 저장 </li><li> 데이터를 가져 와서 Imaris 소프트웨어 (비트 평면)에서 컴파일됩니다. 단핵구와 호중구의 운동은 스팟 추적 마법사를 사용하여 추적됩니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaching+multiple+barriers:+leukocyte+motility+through+venular+walls+and+the+interstitium.">Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).</li><li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+migration+into+inflamed+tissues.">Leukocyte migration into inflamed tissues.</a> Immunity. 41, 694-707 (2014).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11.+Intravital+microscopic+investigation+of+leukocyte+interactions+with+the+blood+vessel+wall.">Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall.</a> Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).</li><li>Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+leukocyte+rolling+in+vivo+and+in+vitro.">Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro.</a> Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).</li><li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+blood+vessels+and+tissues+by+a+population+of+monocytes+with+patrolling+behavior.">Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior.</a> Science. 317, 666-670 (2007).</li><li>Cros, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD14dim+monocytes+patrol+and+sense+nucleic+acids+and+viruses+via+TLR7+and+TLR8+receptors.">Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors.</a> Immunity. 33, 375-386 (2010).</li><li>Hanna, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+NR4A1+(Nur77)+controls+bone+marrow+differentiation+and+the+survival+of+Ly6C-+monocytes.">The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes.</a> Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).</li><li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+junctional+adhesion+molecule+JAM-C+regulates+polarized+transendothelial+migration+of+neutrophils+in+vivo.">The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo.</a> Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).</li><li>Proebstl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+support+neutrophil+subendothelial+cell+crawling+and+breaching+of+venular+walls+in+vivo.">Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo.</a> J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).</li><li>Wantha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-derived+cathelicidin+promotes+adhesion+of+classical+monocytes.">Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes.</a> Circ Res. 112, 792-801 (2013).</li><li>Ozinsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+repertoire+for+pattern+recognition+of+pathogens+by+the+innate+immune+system+is+defined+by+cooperation+between+toll-like+receptors.">The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).</li><li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo.">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498, 371-375 (2013).</li><li>Carlin, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nr4a1-dependent+Ly6C(low)+monocytes+monitor+endothelial+cells+and+orchestrate+their+disposal.">Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal.</a> Cell. 153, 362-375 (2013).</li><li>Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+mouse+bone+marrow+monocytes+in+vivo.">Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo.</a> J Vis Exp. , (2015).</li><li>Iqbal, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD68+promoter+GFP+transgenic+mice+allow+analysis+of+monocyte+to+macrophage+differentiation+in+vivo.">Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo.</a> Blood. 124, e33-e44 (2014).</li><li>Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+spinning-disk+confocal+microscopy+for+the+intravital+analysis+of+platelet+dynamics+in+response+to+systemic+and+local+inflammation.">The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation.</a> PloS One. 6, e25109 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

이 논문에서 설명하는 방법을 효율적으로 정상 상태와 염증 조건에서 장간막 정맥에서 단핵구와 호중구의 행동을 연구하는 일관성있는 접근 방식을 제공한다. 준비의 중요한 단계는 PBS-젖은 조직과 소장의 고정입니다. 제대로 수행 한 경우, 장간막 혈관 멋지게 이미지 수집에 대한 커버 슬립에 노출되어있다. 이는 장간막 혈관에서 백혈구의 동작을 모니터링하는 관심 여러 ...

<html> 호중구와 단핵구는 지속적으로 혈액 순환 선천성 면역 체계의 세포이다. 부상이나 감염되면 염증 신호는 여기에 세포 면역 반응 1-3 시작, 손상 및 감염 조직으로 백혈구 diapedesis를 유도한다. 백혈구 동원의 신속성은 면역 반응의 긍정적 인 결과를 결정한다. 이러한 복잡한 프로세스는 백혈구에 연루 분자에 대한 통찰력을 얻을 .TO 순환 백혈구와 내피 1-3 사이의 접착제 접촉의 설립을 도와 염증이 내피 세포에 존재하는 특정 분자 (예를 들어, 셀렉틴, 내피 세포 결합 된 케모카인)에 의존 모집 캐스케이드, 그것은 세포의 모집 동력학을 시각화하고, 각 셀 / 인구의 동작을 추적하는 것이 중요하다. 효과적인 방법은 관심의 세포에 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스에 생체 내에 현미경을 포함한다. 현재까지 콘텐츠 &quot;&gt;, 생체 내에 현미경을 사용하여 여러 가지 방식은 화상에 개발 된 맥관 4,5-. 예를 들어, 귀 진피 혈관 또는 생체 내에 공 촛점 현미경으로 장간막 정맥 촬상 뮤린 Ly6C 낮은 단핵구 및 인간의 순찰 동작을 식별하는 데 사용 하였다 CD14는 정상 상태 조건 6-8 하에서 혈관의 내강 측에 CD16 + 단핵구 희미. 마우스 cremaster의 혈관 모델은 종종 트랜스 제닉 마우스에서의 염증 또는 허혈 조건 호중구 염증 Ly6C 높은 단구의 동작을 모니터링하기 위해 사용된다. 것을 경우, cremaster이 IL1β, CCL2, TNFβ 또는 fMLP의 intrascrotal 주입을 통해 자극한다. 2-4 시간 후, 조직은 수술 표면화되고, 생체 내에 공 초점 현미경 9-11으로 분석 하였다. 다음은 프로토콜과 동시에 단핵구 및 호중구를 모니터링하는 방법을 설명거꾸로 형광 공 초점 현미경. 또한, 우리의 방법은 백혈구 모집의 역학을 수행하는 방법에 대해 이전 이미지 같은 용기 (정상 상태)과 염증 후에 방법에 대해 자세히 설명합니다. 이 목적을 위해, 우리는 누구의 단핵구 eGFP는 표현, IV 오렌지 염료 표지 쥐의 호중구 주입 CX 3 CR1 GFP / 중량 마우스를 사용합니다. 반전 된 공 초점 현미경을 사용하여, (1) 추적하고 정상 상태 조건 및 (2) 로컬 염증 후 동일한 용기에서 두 단핵구 및 호중구의 채용을 따르지하에 순찰 Ly6C 낮은 단핵구를 분석 할 수있다. 여기에서 우리는 TLR2 / TLR1 효능 Pam3CSK4 (12)를 사용하여 염증 상태를 만듭니다. 또한, 이러한 영상은 특정 녹아웃 마우스 또는 차단 항체 6,9,13의 존재 하에서 수행하는 경우 백혈구 모집 캐스케이드의 다양한 단계에 대한 관심의 특정 분자의 역할을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene round bottom tubes&#160;</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x CFI Plan Apochromat 0.45&#160;&#160; DT:4mm&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x CFI Plan Apochromat VC 0.75&#160;&#160; DT:1mm&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Tracker Orange CMRA Dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C34551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>19762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil Type A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>any viscous oil&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Life Box Temperature Control System</td>
			<td>Life Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R</td>
			<td>inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol red free DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21041-025</td>
			<td>any phenol red free medium is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAM3CSK4</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-pms</td>
			<td>reconstitute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat serum</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td></td>
			<td>included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture dish 100</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging neutrophils and monocytes in mesenteric veins by intravital microscopy on anaesthetized mice in real time

효율적인 면역 반응은 감염이나 부상의 사이트에 혈액 백혈구의 신속한 동원에 의존한다. 생체 내에서 백혈구의 이동을 조사하는 혈관 내피 세포와 백혈구의 transendothelial 마이그레이션 및 상호 작용의 분자 기초를 이해하는 데 매우 중요합니다. 하나의 강력한 접근 방식은 관심의 세포에 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스에 생체 내에 현미경을 포함한다. 여기에서 우리는 거꾸로 공 초점 현미경 오렌지 염료 표지 호중구 주입 CX 3 CR1 GFP / 중량 마우스 IV에 영상 단핵구와 호중구을위한 프로토콜을 제시한다. 시간 경과 영화는 모두 정상 상태와 염증 조건에서 장간막 혈관에서 백혈구 행동의 분석을 허용 영상의 몇 시간이 30 분에서 모였다. 로컬 TLR2 / TLR1 효능 Pam3SK4과 혈관 염증을 유발하고 subseque을 모니터에 우리는 또한 단계를 설명호중구와 단핵구의 NT 모집. 제시된 기법은 또한 백혈구의 다른 개체군을 모니터링하고 다른 자극 또는 트랜스 제닉 마우스를 이용하여 백혈구 보충 또는 거래에 관련 분자를 조사하는데 사용될 수있다.

원고를 쉽게 실시간으로 마취 된 마우스의 장간막 정맥 단구와 호중구의 동작을 모니터링하기위한 최적화 된 프로토콜을 설명한다. 37 ° C-온도 조절 챔버의 사용은, 마우스의 온도를 유지하기 위해 필수적으로 인해 또한 백혈구의 온도 의존 움직임이다. 마우스의 제조는도 1에 표시되는도 2는 현미경으로 보이는 모든 영역을 나타낸다. 전송 된 빛은 장간막 정맥 (빨간색 화살표) 및 ?...

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Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.4K 조회수.  University of Geneva. We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

비디오: Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

추적 호중구 Intraluminal 크롤링, Intravital 비디오 현미경에 의한 조직의 Transendothelial 마이 그 레이션 및 Chemotaxis

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

연구

면역학 및 감염병학

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

라이브 마우스의 혈관 염증과 혈전 형성하는 동안 활성화 내피에 Heterotypic 혈소판 - 호중구 상호 작용의 실시간 영상

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

의 상호 작용을 연구<em&gt; 황색 포도상 구균</em&gt; 유동 세포 계측법 및 시간 경과 현미경에 의한 호중구와

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

어린 싹 센터의 높은 해결의 intravital 스트라이프 - 조명 현미경

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

골수 세포 역학의 실시간 영상<em&gt; APC<sup&gt; 최소 / +</sup</em&gt; 소장 종양 디스크 공 초점 현미경을 회전시켜

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

CXCR6.Gfp 기자 마우스를 사용하여 건강하고 병에 걸린 간에서 면역 세포의 장기 생체 내에 다중 광자 현미경 이미징

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

에 대한 응답으로 인간의 기본 호중구와 단핵구에 의해 항진균 활성의 라이브 영상<em&gt;를했다. 투스</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

영상 셀 상호 작용 Tracheal 점 막에서 2 광자 Intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여 인플루엔자 바이러스 감염 중

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The current protocol represents a practical and reproducible method to visualize the leukocyte endothelium interaction leading to leukocyte recruitment in skeletal muscle derived tissue within the intact organism of the mouse. The model is applicable to all fields of research that focus on granulocyte activation and their role in disease.
We provide a step by step protocol to guide through the method and to highlight potential pitfalls and technical difficulties. The protocol covers the following aspects: experimental settings and required material, anesthesia of the mouse, dissection of the cremaster muscle as well as tracheal and carotid cannulation, IVM recordings and offline analysis. Data formats like adherent leukocytes, rolling flux (RF) and rolling flux fraction (RFF) are explained in detail and appropriate applications are discussed. Representative results from dystrophin deficient mdx mice are provided in the results section.
IVM is a powerful tool to assess leukocyte recruitment in an in vivo setting; however, delineating for example endothelial and leukocyte function may require a combination with ex vivo setups like flow chamber experiments. Furthermore, the genetic background of animals of interest may greatly influence baseline recruitment, requiring individual fine tuning of the protocol provided. Despite its limitations, IVM may serve as a platform to readily translate in vitro findings into a living vertebrate organism.

Here, we show how to perform intravital microscopy on post-capillary venules of the mouse cremaster muscle. Commonly applied to different models of inflammation and sepsis, particularly those induced by chemokines and cytokines, we highlight its relevance in the study of muscolopathies involving exaggerated muscular leukocyte infiltration.

Intravital 현미경 검사법에 의해 평가된 마우스에 있는 Cremaster 근육의 백혈구 침투

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...