이 작품은 건강 연구 캐나다 연구소 (CIHR, 걸레 - 86749)에서 연구 부여에 의해 지원되었다. L. 리우 CIHR 새로운 탐정 수상 (MSH - 95374)의 수상자이다.

1. 아가로 오스 겔에 Chemoattractant의 준비 <ol><li> 피펫 10 50 ML 원뿔 튜브 2 × PBS의 ML, 그리고 뜨거운 물이 들어있는 비커에 넣고하여 튜브를 따뜻하게. </li><li> 피펫 10 증류수의 ML 다른 50 - ML 원뿔 관에 0.4 g 아가로 오스 분말을 추가 (약간 느슨하게의 모자)와 혼합 가열 (700 와트 전자렌지에서 ~ 1 분) 전자 레인지에 불과 끓는까지 . </li><li> 아가로 오스 솔루션 튜브, 소용돌이 혼합 용액에 예열이 × PBS를 추가하고 뜨거운 물을 비커에 따뜻하게 유지. </li><li> Micropipette의 chemoattractant 3 μl 인도 잉크를 포함하는 1.5 - ML Eppendorf 튜브의 뚜껑에 솔루션 (예 : CXC의 케모카인 1 ㎜의 WKYMVm의 MIP - 2 또는 12 μl의 0.5 μg의 10 μl)와 (방지 micropipette를 사용 흡인하여 잘 섞는다 공기 방울). </li><li> 뚜껑에 200 μl pipet 팁 및 아가로 오스 솔루션 (42 ° C)의 micropipette 110 μl의 팁 끝을 잘라 즉시 다른 피펫 팁을 (공기 방울을 방지)를 사용하여 잘 섞는다. </li><li> 4에서 chemoattractant 함유 겔을 저장 ° C. </li></ol> 2. Intravital 현미경에 대한 Cremaster 근육의 준비 (그림 1) <ol><li> 10 MG / kg xylazine 200 MG / kg 케타민을 하이드로 클로라이드의 혼합물의 IP 주사하여 성인 남성이 마우스를 마취. </li><li> 오른쪽 외부 경정맥 정맥과 전기 면도기와 음낭의 앞쪽에을 통해 지역을 면도. 마취 후, anesthetized 마우스 특별한 관심과주의를주는 것이 중요합니다. 가열 램프는 저체온증에서 마우스를 방지하기 위해 사용할 수 있습니다. 마우스 통증 반응에서 무료로해야합니다. </li><li> , 수평 절개를 찾아 100 U / ML 헤파린의 식염수에 가득한 PE - 10 튜브를 사용하여 경정맥 정맥을 ...에 카테 테르를 꽂다. 필요한 경우 경정맥 혈관의 Catheterization은 추가 anesthetics 마약의 관리를 위해 필요합니다. </li><li> 마우스가 집에서 만든 cremaster 근육 보드 (그림 1)에 얼굴을 거짓말로 배꼽 테이프와 마우스 뒷다리를 수정. </li><li> cremaster 근육 및 마우스 몸을 따뜻하게 유지하기 위해 37 ° C의 물 순환 장치에 보드를 연결합니다. </li></ol> 참고 : 2.6에서 2.14로 모든 절차가 매우 부드럽게 5 수행해야합니다. <ol start="6"><li> 왼쪽 cremaster 근육을 노출 scrotal 피부에 절개를합니다. 관련 근막에서 근육을 조심스럽게을 해부하다. </li><li> 37과 cremaster 근육을 Superfuse ° C - 예열 연동 펌프를 사용하여 (131.9 NaCl, MM의 4.7 KCl, 1.2 MgSO 4, 20 NaHCO 3,, 산도 7.4) 염분 중탄산염 버퍼. </li><li> cremaster 근육 보드의 명확한보기 유리 받침대에 잡아 cremaster 근육의 말초 끝에 4-0 치료를 묶어. </li><li> 길이 방향 cremaster 근육을 부식. 4-0 봉합사로, 근육 평면을 보유하고 받침대에있는 가장자리를 따라 그것을 확보. 기본 근육의 고환과 epididymis을 분리하여 복강으로 그들을 이동합니다. </li><li> ~ 0.6 37 ° C - 예열 재관류 버퍼와 ML / 분 및 22 노출된 근육 커버 × 22mm 유리 coverslip에있는 근육 Superfuse. </li><li> , 현미경 무대에 cremaster 근육 보드를 놓습니다 현미경 근육을 검사, 적절한 postcapillary venule을 (똑바로 unbranched이며 일반 전단 속도와 25-40 μm의의 직경을 가지고있는 venule 선택) 찾아 비디오 카메라를 조정 venule은 TV 모니터 중 하나를 왼쪽이나 오른쪽 끝에 수직 위치에서 시각 수 있도록합니다. </li><li> 30 분의 평형 후, 비디오 레코더를 사용하여 기본적인 제어 데이터로 5 분 선택한 postcapillary venule의 영상 이미지를 기록합니다. </li><li> superfusion를 중지하고 근육에 coverslip을 제거합니다. </li><li> 350 μm의에서 preselected 영역에 cremaster 근육의 표면에 ~ 1 mm 3 크기 chemoattractant 함유 젤 장소 및 병렬 관찰 postcapillary venule로, 장소에 젤 잡아 coverslip을 추가하고 매우에서 근육 조직을 superfuse 천천히 출시 및 겔의 형성 chemoattractant의 그라디언트의 설립을 허용하는 속도가 느린 속도 (≤ 10 μl / 분). </li><li> chemoattractant 포함된 젤의 추가 90 분 영상 이미지를 기록합니다. 녹음하는 동안, 조정 및 준수에 현미경 초점을 유지, 크롤 링 transmigrating 및 venule 내부와 근육 조직에 leukocytes을 chemotaxing. </li><li> 실험 후, 분석을 위해 컴퓨터에 비디오 파일을 가져옵니다. </li></ol> 3. ImageJ를 사용하여 셀 추적 <ol><li> 컴퓨터에서 추출하여 AVI 포맷 (예, AVI 파일을 DVD 비디오로 변환 무료 컴퓨터 소프트웨어 bitRipper를 사용)에 동영상을 변환합니다. </li><li> 시간 타락한 동영상을 생성하는 비디오 편집 소프트웨어를 사용합니다. 예를 들어, 시간이 타락한 영화 (512분의 1 또는 1천24분의 1 시간 - 경과하기 위해 Windows Movie Maker를 사용하여원래, 실시간 비디오에서 t 30 FPS 속도). 변환 및 DV - AVI 형식으로 압축 시간 타락한 영화를 저장할 수 있습니다. </li><li> 같은 현미경 설정에 따라 교정 마이크로 미터의 이미지를 기록, 컴퓨터에 이미지를 가져오려면, ImageJ로 이미지를 엽니다. ImageJ에서 총 픽셀 화면 (예를 들어, 720 × 480 픽셀)의 왼쪽 상단에 나타납니다. X와 Y의 축 (예 : 200 × 150 μm의) 모두에서 화면의 크기를 측정합니다. 이에서 μm의 당 픽셀 (예를 들어, X = 200분의 720 = 3.6 픽셀 / μm의,와 y = 150분의 480 = 3.2 픽셀 / μm의)의 개수를 계산합니다. </li><li> 동영상을 가져오려면, 오픈 ImageJ 다시, &quot;QT 영화 오프너&quot;의 인터페이스에서 &quot;OK&quot; &quot;파일 - 가져오기를 사용하는 QuickTime 동영상 플러그인 것은&quot;분석하는 동영상을 선택하고를 누릅니다. </li><li> 세포를 추적하는 &quot;플러그인 - 수동 추적&quot;을 클릭하십시오. 시작하기 전에 추적 하단에있는 필드에 해당 정보를 입력합니다. 간단히, <ol><li> 시간 간격 (초)을 = fold-time-lapse/30 (예를 들면, 1020 × 시간 경과가 30분의 1,020 = 34 초 / 프레임 간격 것입니다.) </li><li> X / Y 교정 = 마이크로 미터의 이미지의 보정을 사용하여 μm의 / 픽셀 측정. </li><li> Z 교정 = 0 (마우스 cremaster 근육이 조직 및 세포 크롤링 및 마이 그 레이션의 매우 얇은 층 밝은 필드 transillumination 아래에 약 2 차원뿐입니다 등). </li><li> = 1 중심에 대해 사각형 크기를 검색합니다. </li><li> 도트 크기 / 선 폭 / 글꼴 크기 : 필요한 경우 그들이 조정할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 기준점으로 안정적이고 명확한 지점을 선택합니다. 이 기준점은 모든 실험을하는 동안 변경하고 안정적​​인 남아​​있는 명확하고 작은 구조 지점 수 있습니다. 마지막 프레임에 처음부터 참조 지점을 추적하고 &quot;최종 트랙&quot;을 클릭하여 &quot;트랙 추가 &#39;를 클릭합니다. 데이터는 자동으로 결과를 테이블에 나타납니다. </li><li> neutrophils를 크롤 링하고 마이 그 레이션 트랙을 하나씩 클릭 각 프레임에 그 실종 조직의 모양의 세포를 추적하고 Microsoft Excel에서 결과를 완료하고 저장 &quot;최종 트랙&quot;을 클릭하여 &quot;트랙을 추가.&quot; </li></ol> 4. 호중구 채용 매개 변수의 분석 <ol><li> Microsoft Excel에서 결과 파일을 열고 (분석에 기준점의 변화를) 데이터를 분석할 수 있습니다. </li><li> Intraluminal 크롤링 <ol><li> 거리를 크롤링 : 총 거리는 세포가 최적의 윤회 사이트 (μm의)에 초기 자기편 사이트에서 루멘으로 크롤 링합니다. </li><li> 속도를 크롤 링 거리 / 시간 (μm의 / 분) 크롤 링. </li></ol></li><li> Transendothelial 마이 그 레이션 <ol><li> 윤회 시간 : 세포가 전체 세포의 몸이 venule 밖이며 셀 시체가 루멘 (분 또는 초)에서 볼 수 없습니다 때 시간 내피를 통해 윤회하다 시작 시간부터. </li><li> 파견 시간 : 시간에서 전체 셀 몸이 세포가 venule (꼬리 retracts) (분 또는 초)과 접촉을 잃는 경우 시점에 (바로 윤회 후) 그냥 venule 밖입니다. </li></ol></li><li> 조직에 Chemotaxis <ol><li> 마이 그 레이션 거리 : 조직에서 마이 그 레이션의 끝 지점 (μm의)로 시작 시점에서 세포가 이동하는 거리의 합계. </li><li> 마이 그 레이션 속도 : 조직 / 시간에 마이 그 레이션 거리 (μm의 / 분). </li><li> Chemotaxis 거리 : 거리 세포의 합계가 조직의 X - 축 (μm의)에서 마이 그 레이션합니다. </li><li> chemotaxis의 속도 : chemotaxis 거리 / 시간 (μm의 / 분). </li><li> Chemotaxis 지수 : 조직에서 마이 그 레이션 거리로 chemotaxis 거리를 나누어의 비율. </li></ol></li></ol> 5. 대표 결과 : bightfield intravital 현미경은 백혈구 - 내피 세포 상호 작용의 연구에 사용되며 neutrophils for 반드시되지 않을 수 있지만, 우리는 조직학 연구에 의해, neutrophil chemoattractant - 대우 cremaster 근육의 고용 세포의 이상 95% 실제로 neutrophils 있었 확인 . 이 보고서에서, 호중구 - 선택 chemoattractants를 사용하여, 우리는 생체내에 neutrophils의 채용을 추적 절차를 제시한다. 특히, 우리는 추적 호중구 intraluminal 크롤링, transendothelial 마이 그 레이션, 그리고 시간 경과 intravital 비디오 현미경과 ImageJ를 사용하여 anesthetized 마우스에 cremaster 근육 조직의 chemotaxis의 프로토콜을 설명합니다. cremaster 근육에 chemoattractant 함유 아가로 오스 겔 천천히 chemoattractant을 출시하고 chemoattractant 그라디언트가 조직 설립 수 있습니다. 호중구의 chemoattractant는 마우스에 cremasteric postcapillary venules에서 호중구 - 내피 세포 상호 작용을 유도. 전체 실험은 TV 모니터에 컬러 비디오 카메라에 의해 예상과 비디오 레코더에 기록된 영상과 직립 brightfield intravital 현미경 시각이다. 우리는 호중구 결정intraluminal 크롤링, transendothelial 마이 그 레이션 및 마이 그 레이션 및 응답의 근육 조직의 chemotaxis은 chemoattractant MIP - 2를 호중구하고 WKYMVm는 (그림 2) 아가로 오스 겔에서 준비했습니다. 우리는 MIP - 2 (0.5 μm의)와 WKYMVm이 (0.1 MM에서) 거의에서 비교의 시간 길이, 호중구 마이 그 레이션 및 근육 조직의 chemotaxis에 대한 venule에서와 비슷한 속도, 호중구 transendothelial 마이 그 레이션과 분리에서 호중구 intraluminal 크롤 링을 elicited 것을 발견 유사한 호중구의 chemotaxis 인덱스 (P&gt; 0.05, 학생 t 시험)와 같은 속도합니다. <img src="/files/ftp_upload/3296/3296fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. intravital 현미경 시스템의 개략도 그림. 마우스 cremaster 근육은 현미경 스테이지에 cremaster 근육 보드의 명확한보기 받침대에 exteriorized 37 ° C - 예열 중탄산염 버퍼 식염수에 superfused 있습니다. 직립 현미경 brightfield intravital 현미경에 CCD 컬러 비디오 카메라로 연결됩니다. 흑백 깊은 냉각 CCD 디지털 카메라도 형광 현미경을위한 intravital 현미경 포트에 연결되어, 이미지가있는 직접 컴퓨터에 의해 처리됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3296/3296fig2.jpg" alt="그림 2" /> brightfield intravital 현미경의 그림 2. 호중구 모집 매개 변수. 호중구 모집은 아가로 오스 겔 준비 MIP - 2 또는 WKYMVm이 postcapillary venule에 인접한 350 μm의 배치 호중구의 chemoattractant의 점진적 릴리스에 의해 유도되었다. 시간 타락한 비디오 데이터는 실험의 실시간 비디오 녹화를 처리 후 ImageJ에 의해 분석되었다. cremaster 근육 (D)에서 호중구 intraluminal 링 (A), 윤회 시간과 분리 시간 (B), 조직에서 마이 그 레이션 속도와 chemotaxis 속도 (C) 및 chemotaxis 지수는 MIP - 2 또는 WKYMVm 아가로 오스 겔에의 관리 후 결정 C57BL / 6 마​​우스에 cremaster 근육 (N = 3, # 추적 세포의 = 22 일 (A와 B) 및 27 (C와 D)를 각각 MIP - 2, 그리고 = 26 일 (및 B) 44 ( WKYMVm에 대한 각각 C와 D)에서).

<ol>
	<li>Liu, L., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+leukocyte+recruitment:+organ-specific+mechanisms+of+action.">Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action.</a> Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).</li><li>Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+leukocyte+recruitment:+an+in+vivo+perspective.">The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective.</a> J. Immunol. 180, 6439-6446 (2008).</li><li>Phillipson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraluminal+crawling+of+neutrophils+to+emigration+sites:+a+molecularly+distinct+process+from+adhesion+in+the+recruitment+cascade.">Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade.</a> J. Exp. Med. 203, 2569-2575 (2006).</li><li>Wong, C. H., Heit, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulators+of+leucocyte+chemotaxis+during+inflammation.">Molecular regulators of leucocyte chemotaxis during inflammation.</a> Cardiovasc. Res. 86, 183-191 (2010).</li><li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research:+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations.">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li><li>Bullen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+imaging+techniques+for+drug+discovery.">Microscopic imaging techniques for drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).</li><li>Hazelwood, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entering+the+Portal:+Understanding+the+Digital+Image+Recorded+Through+a+Microscope.">Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).</li><li>Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-selectin+facilitates+emigration+and+extravascular+locomotion+of+leukocytes+during+acute+inflammatory+responses+in+vivo.">L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo.</a> J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).</li><li>Cara, D. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+as+a+tool+for+studying+recruitment+and+chemotaxis.">Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSP1+is+an+endothelial+gatekeeper+of+leukocyte+transendothelial+migration.">LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration.</a> J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).</li><li>Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+accelerates,+but+is+not+required+for,+neutrophil+chemotaxis+to+fMLP.">PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP.</a> J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Intravital 현미경은 염증시 백혈구 모집의 세포 및 분자 메커니즘을 밝히 위해 필수적인 도구입니다. 이러한 cremaster 근육 및 장간막과 같은 transluscent 조직의 microvasculature에서 백혈구 - 내피 세포 상호 작용의 결정에 대한 양적 시각화의 기법 1.5의 응용 프로그램에 대한 황금 표준 남아 있습니다. 기존 brightfield의 intravital 현미경은 많은 독특한 기술 특징을 가지고 있으며, 이들 조직에서 공?...

표 : 재료, 특정 시약 및 장비 <table border="1"><tr><td> 시약 / 장비 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 폴리에틸렌 튜브, PE10 </td><td> Becton 디킨슨 </td><td> 427401 </td><td> ID 0.28mm × 0.61mm OD </td></tr><tr><td> 먹물 </td><td> Speed​​ball 예술 </td><td> 슈퍼 블랙 </td><td> 100 % 카본 블랙 안료 - 염료도 없습니다 </td></tr><tr><td> 소작 </td><td> 아론 의료 </td><td> AA03 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> 바이엘 헬스케어, 바이엘 주식 회사 </td><td> DIN 02169592 </td><td></td></tr><tr><td> 케타민을 하이드로 클로라이드 </td><td> Bioniche 동물 건강 캐나다, 주식 회사 </td><td> DIN 01989529 </td><td></td></tr><tr><td> Murine 재조합 MIP - 2 </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 452 - M2 </td><td></td></tr><tr><td> WKYMVm </td><td> 피닉스 제약 주식 회사 </td><td> 072-12 </td><td></td></tr><tr><td> 아가로 오스 </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-027 </td><td> Ultrapure </td></tr><tr><td> 헤파린 </td><td> 시그마 </td><td> H - 3393 </td><td></td></tr><tr><td> 직립 현미경 </td><td> 하늘 </td><td> BX61WI </td><td></td></tr><tr><td> 3CCD 컬러 비디오 카메라 </td><td> SONY </td><td> DXC - 990 </td><td></td></tr><tr><td> HD - DVD 비디오 레코더 </td><td> LG 전자 주식 회사 </td><td> RH398H - M </td><td></td></tr><tr><td> TV 모니터 </td><td> LG 전자 주식 회사 </td><td> 22LG30 </td><td></td></tr><tr><td> 물 순환 장치 </td><td> 써모 과학 </td><td> HAAKE의 DC10 </td><td></td></tr><tr><td> 연동 펌프 </td><td> Gilson; Pharmacia </td><td> Gilson MINIPULS 3; Pharmacia P - 3 </td><td></td></tr><tr><td> Cremaster 근육 보드 </td><td> 서스캐처원 대학 </td><td></td><td> 집에서 만든 </td></tr></table>

tracking neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in tissue by intravital video microscopy

혈류에서 염증 조직 leukocytes 순환의 모집은 염증의 1,2의 결정과 복잡한 프로세스입니다. 염증 조직의 postcapillary venules에서 venular 벽 luminal 표면에 처음에는 밧줄과 롤 leukocytes. 내피에 leukocytes 연금을 롤백하고 케모카인 또는 venular 표면에 다른 chemoattractants에 대한 응답으로 확고한 접착력을 받고있다. 많은 자기편 leukocytes이 내피에있는 junctional 넘쳐 흐름 사이트에 부착의 초기 사이트에서 재배치, 프로세스 intraluminal 3를 크롤 링 칭했다. 크롤링 다음, leukocytes는 chemoattractant의 소스 (chemotaxis) 4쪽으로 extravascular 조직에서 내피 (윤회)를 통해 이동하고 마이 그 레이션. Intravital 현미경은 생체내에서 백혈구 - 내피 세포 상호 작용을 시각화하고 백혈구 모집 2,5의 세포 및 분자 메커니즘을 드러내는위한 강력한 도구입니다. 이 보고서에서는, 우리는 호중구 chemoattractant의 경사도에 대응 마우스 cremaster 근육에서 호중구 모집의 세부 프로세스를 시각화하고 결정하는 brightfield intravital 현미경을 사용하는 포괄적인 설명을 제공합니다. 호중구 채용, 호중구 chemoattractant MIP - 2 (CXCL2, CXC의 케모카인) 또는 WKYMVm (TRP - LYS - 티르 - 발 - D - 만났고, 합성 아날로그를 포함한 아가로 오스 겔의 작은 조각 (~ 1 mm 3 크기)를 유도하기 위해 세균성 펩타이드의)는 관찰 postcapillary venule에 인접한 근육 조직에 배치됩니다. 시간 타락한 비디오 촬영 및 컴퓨터 소프트웨어 ImageJ, 내피, 호중구 transendothelial 마이 그 레이션 및 조직에서 마이 그 레이션 및 chemotaxis에 호중구 intraluminal 크롤 링 시각 및 추적과 함께. 이 프로토콜은 intraluminal 크롤링 속도, 윤회 시간, 분리 시간, 마이 그 레이션 속도, chemotaxis 속도와 조직의 chemotaxis 지수 많은 호중구 모집 매개 변수의 신뢰성 및 정량 분석​​이 가능합니다. 우리는이 프로토콜을 사용하여 이러한 호중구 모집 매개 변수가 안정적으로 결정하고 단세포 운동이 편리 생체내에서 추적할 수있다는 것을 보여준다.

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Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

우리는 생체내에서 호중구 chemoattractant의 근원에 대한 응답으로 호중구 모집 중에 동적으로 호중구 - 내피 세포 상호 작용을 측정하기위한 brightfield intravital 현미경의 프로토콜을 설명합니다. 호중구 intraluminal 크롤링, 마우스 cremaster 근육 조직에 transendothelial 마이 그 레이션 및 chemotaxis 시간은 타락한 동영상 사진 및 ImageJ와 추적과 시각입니다.

추적 호중구 Intraluminal 크롤링, Intravital 비디오 현미경에 의한 조직의 Transendothelial 마이 그 레이션 및 Chemotaxis

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

tracking-neutrophil-intraluminal-crawling-transendothelial-migration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

19.6K 조회수.  University of Saskatchewan. 우리는 생체내에서 호중구 chemoattractant의 근원에 대한 응답으로 호중구 모집 중에 동적으로 호중구 - 내피 세포 상호 작용을 측정하기위한 brightfield intravital 현미경의 프로토콜을 설명합니다. 호중구 intraluminal 크롤링, 마우스 cremaster 근육 조직에 transendothelial 마이 그 레이션 및 chemotaxis 시간은 타락한 동영상 사진 및 ImageJ와 추적과 시각입니다.

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Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

연구

면역학 및 감염병학

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

사타구니 림프 노드의 Intravital 현미경

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

곰팡이 병원체 Phagocytosis의 라이브 셀 비디오 현미경

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

시험관 내 병원균 유도 호중구 트랜스 상피 이동을 평가하는 공동 문화 분석

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. During infection of the urinary bladder, polymorphonuclear leukocytes (PMN; neutrophils) migrate from the bloodstream and traverse the bladder epithelium. Failure to resolve infection in the absence of a neutrophilic response demonstrates the importance of PMN in bladder defense. To facilitate colonization of the bladder epithelium, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), the causative agent of the majority of urinary tract infections (UTIs), dampen the acute inflammatory response using a variety of partially defined mechanisms. To further investigate the interplay between host and bacterial pathogen, we developed an in vitro model of this aspect of the innate immune response to UPEC. In the transuroepithelial neutrophil migration assay, a variation on the Boyden chamber, cultured bladder epithelial cells are grown to confluence on the underside of a permeable support. PMN are isolated from human venous blood and are applied to the basolateral side of the bladder epithelial cell layers. PMN migration representing the physiologically relevant basolateral-to-apical direction in response to bacterial infection or chemoattractant molecules is enumerated using a hemocytometer. This model can be used to investigate interactions between UPEC and eukaryotic cells as well as to interrogate the molecular requirements for the traversal of bladder epithelia by PMN. The transuroepithelial neutrophil migration model will further our understanding of the initial inflammatory response to UPEC in the bladder.

We developed an in vitro model that mimics an important component of the acute inflammatory response during infection of the bladder with uropathogenic Escherichia coli. The transuroepithelial neutrophil migration assay enables quantitative assessment of human neutrophil migration across bladder epithelia, cultured on permeable supports, in response to bacterial infection or chemoattractant substances.

교양 방광 상피 세포 간 인간 호중구 이주의 정량 평가

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

어린 싹 센터의 높은 해결의 intravital 스트라이프 - 조명 현미경

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

IL-1β의 발기인 기반을 DsRed 기자 마우스를 사용 호중구 초벌의 생체 내에 영상

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...