Name: intravital microscopy of monocyte homing and tumor-related angiogenesis in a murine model of peripheral arterial disease
Uploaded: 2017-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease at JoVE.com

이 작품은 ELSE Kröner 재단에 의해 지원 되었다 그리고 DFG (도이치 가운데, 독일 연구 재단) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, 공동 연구 센터). 특별 기술 지원에 대 한 한스-홀거 Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, 오토 폰 Guericke 대학 마그데부르크, 마그데부르크, 독일, 감사 합니다.

우리의 연구 동물 보호에 대 한 독일 법의 섹션 8에 따라 작센-안할트, Landesverwaltungsamt 할리 상태의 권한으로 수행 되었다. (§ 8, 18.05.2016-BGBI에서에서 동물 보호에 대 한 독일 법의 단락 1. 나 S. 1206, 1313, 13.08.2013에서 § 31 TierSchVersV).
 참고: 여기 실험에 대 한 8 12 주 오래 된 남성 BALB/c 마우스 사용 되었다, 및 혈액 기증자 로부터 인간 monocytes intravital 현미경 검사 법을 통해 monocytes의 시각화를 위해 사용 되었다.
 1. 셀 준비 참고: monocytes의 격리를 참조 하십시오 우리의 이전 게시 된 비디오 정돈에 지침에 대 한: &#34; 절연 및 정 맥 주입의 Murine 골 파생 Monocytes &#34; 바그너 외. 여 4 참고: 때 셀 모든 단계 작업 것이 오염을 피하기 위하여 살 균 되어야 합니다.
<ol><li>셀 3, 3으로 얼룩 &#39;-Dioctadecyloxacarbocyanine 과염소산염 <ol><li>Resuspend 1 x 10 6 셀/mL의 농도와 혈 청 무료 문화 매체에 셀. 
		참고:만 혈 청 자유로운 매체 수는 효율적인 얼룩, 닥터지 염료 이미 혈 청의 질 성 구성 요소에 의해 캡처 그렇지 않으면 것 때문.</li>
		<li>1 m m 3, 3의 추가 5 µ L &#39;-Dioctadecyloxacarbocyanine 과염소산염 dimethylformamide 셀 서 스 펜 션의 1 ml에 신중 하 게 resuspend와.</li>
		<li>품 20 분 동안 37 ° C에서 셀 솔루션</li>
		<li>37 ° C에서 5 분에 대 한 500 x g 세포를 원심</li>
		<li>는 상쾌한을 꺼내 려 하 고 37 ° C 따뜻한 태아 종 아리 보충 하는 혈 청 매체와 셀 resuspend.</li>
		<li>1.1.4와 1.1.5 단계를 반복 하 여 두 번.</li>
		<li>수식 가진 셀의 개수: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56290/56290eq1.jpg" /></li> <li>150 µ L 살 균 0.9 %NaCl 용액으로 세포를 resuspend.</li>
		<li>꼬리 정 맥에 주입 셀.</li>
	</ol></li></ol> 2. 마 취 <ol><li>흡입 마 취 <ol><li>isoflurane 화학 안전 후드 닫힌된 빈에 5%의 농도 사용 하 여 기화 기의 도움으로 증발.</li>
		<li>마우스를 신중 하 게 처리 하 고 빈에 넣어.</li>
		<li>이동 중지 되었습니다 후 후부 목의 피부에 의해 동물 처리.</li>
	</ol></li> <li>복 마 취 참고: 사용 isoflurane 마 취, 단계 2.1, 복 주사를 수행 하려면 아래 설명 된. 빠른 복구와 isoflurane 마 취의 짧은 연기 마약 효과, 마우스를 처리 하 여 복 마 취 주사 쉽습니다.
	<ol><li>2.4 mL 마 취 제 (10%), 0.8 mL Xylazine (2%), 및 6.8 mL NaCl (0.9%)의 솔루션을 사용 하 여 복 주입을 위해.</li>
		<li>무게 동물 마 취 제를 적용 하기 전에. 
		참고: 마 취에 대 한 공식 이다: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56290/56290eq2.jpg" /></li> <li>30g 바늘 1 mL 인슐린 주사기를 사용 하 여 왼쪽된 하복 부에 주입 솔루션.</li>
		<li>마우스의 장에 놓고 마약 효과 기다립니다. 
		참고: 마약 효과 일반적으로 나타납니다 5 분 이내 주사 된 경우. 마 취의 정확한 깊이 뚜껑 반사 또는 발가락을 꼬집어, 반응 없는 호흡의 일반, 제어 속도 의해 결정 수 있습니다.</li>
	</ol></li></ol> 3. 지하실 막 같은 매트릭스의 주입 참고:이 메서드는 monocyte 주입 후 종양 혈관 신생 연구 우리의 그룹에 의해 사용 됩니다. 실험에 따라 성장 요인 지하실 막 같은 매트릭스를 추가할 수 있습니다. 우리는 마우스의 측면에서 종양을 주입 하기 전에 대 퇴 동맥 결 찰을 수행. 매트릭스는 주입을 위해 4 ° C의 온도가지고 있어야 합니다. 이 온도에, 행렬은 액체; 젤은 체온 (37 ° C)에 고체를 견고 하 게. 피하 매트릭스의 더 나은 시정을 위한 플러그, 사출 사이트에서 마우스의 피부를 면도.
 참고: 옵션: 추가 100 ng 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자, 300 ng 혈관 내 피 성장 인자, 및 지하실 막 같은 매트릭스를 무 균 조건 하에서 26 I.U. 덤플링을.
<ol><li>30 G 인슐린 주사기를 얼음에 저장소 사용까지 매트릭스의 1 mL 로드.</li>
	<li>동물 테이블에 누워 누르고 있으면 마우스의 피부 측면에 주사 부 옆.</li>
	<li>지하실 막 같은 매트릭스의 500 µ L를 피하 주사. 
	주: 실제적인 이유를 위해 그것은 피하 분산을 피하기 위해 한 위치에서 조밀 하 게 지하실 막 같은 매트릭스를 삽입 하는 데 필요한. 실험의 끝에 마우스를 희생 후 조직에서 인공 종양을 꺼내 려 하는 것이 쉬울 것 이다.</li>
</ol> 4. 정 맥 주입 꼬리 참고: 꼬리 정 맥 주입 실험 하기 전에 시험 동물에 NaCl 솔루션 연습. Monocytes는 적절 하 게 꼬리 정 맥에 주입 수 없습니다, 아무 조직의 효과 담보에 있을 것입니다. 이 프로토콜에서 2.5 백만 monocytes 주입 하 고. Bodyweight의 더 이상 5 µ L/g를 주사 하려고.
<ol><li>준비 단계 1.1.8 2.5 백만 monocytes를 포함 하는 monocyte 솔루션을 사용 하 여.</li>
	<li>30g 바늘과 1 mL 인슐린 주사기를 사용 하 여 주입을 위해.</li>
	<li>신중 하 게 마우스를 처리, restrainer에서 동물을 제 지 하 고 마우스 감염 되지 및 호흡에 대 한 충분 한 공간이 있는지 확인 하십시오.</li>
	<li>꼬리 접시에 게 연락할 수 있도록 난방 패드는 restrainer 넣어.</li>
	<li>꼬리 정 맥, 꼬리의 측면에 있는 식별.</li>
	<li>90 °, 꼬리 꼬리 정 맥 꼬리의 위 부분에 나타나도록 설정.</li>
	<li>주입 사이드는 monocytes를 주입 하기 전에 소독.</li>
	<li>세를 직면 하는 바늘의 경사와 평면 각도에 monocyte 솔루션을 주입 하려고 
	참고: 중지 주사 물집이 나타나면 이것이 실패 한 주입의 징조. 절차를 다시 시도 더 proximally.</li>
	<li>주사 사이트에서 약 60에 대 한 꼬리에 부드러운 압력을 적용 하 여 출혈을 멈추게.</li>
	<li>을 조직의 부작용에 대 한 모니터링 마우스 그것의 감 금에 있는 동물에는 완 치 후 30 분 동안 동물 관찰.</li>
</ol> 5. Intravital 현미경 <ol><li>준비 <ol><li>접착 테이프를 가진 일정 한 온도 유지 하 고 자리에는 발을 해결을 열 패드 (37 ° C)에 마 취 마우스를 놓습니다.</li>
		<li>다리 또는 현미경에 사용 되는 측면의 사이트에서 피부를 소독.</li>
		<li>머리 간섭을 유발 하지 않도록 더 나은 처리에 대 한 관심의 영역을 면도.</li>
		<li>삭제할 살 균 메스와 0.5 x 0.5 cm의 사각형 영역에 미세 집게 피부. 
		참고: 그것은 촉촉한; 관심 영역을 유지 하는 것이 중요 그렇지 않으면, 이미지와 조직의 품질 손상 될 것 이다. NaCl 솔루션 영역을 축 축 하 게 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>두 조정 가능한 우표 사이 다리를 놓고 우표 위에 커버 글라스를 위치.</li>
		<li>조직과 젖어 유리 접촉 확인.</li>
		<li>Inj혈관의 더 나은 시정을 위한 정 맥 체계로 요법 50 µ L rhodamine dextran retrobulbar.</li>
		<li>현미경 검사 법을 시작 하 고 필요한 경우 다리의 위치를 조정.</li>
	</ol></li> <li>Intravital 현미경 설정 <ol><li>현미경, 컴퓨터, 전자 인터페이스와 레이저.</li>
		<li>보육 실의 난방 단위 설정 또는 난방 (플레이트/패드), 무대 설정 온도 37 ° c.</li>
		<li>수집 소프트웨어를 시작합니다. 현미경 공명 스캐너를 갖춘 경우이 빠른 스캐닝 모드 선택.</li>
		<li>온도가 일정 수준 (35-37 ° C) 도달할 때까지 기다렸다가 
		참고: 안정 온도 대 한 중요 하다: (a) 마우스, 마 취의 밑에 그것의 온도, 및 (b) 피하 또는 적어도 최소화 초점 드리프트를 제어할 수 없습니다. 이 주변 조건 (예를 들어, 에어컨 시스템 및 사람들을 포함 한 방에 열원 수)에 따라 몇 시간 1 시간을 걸릴 수 있습니다. 침수 목적 사용 하는 경우 렌즈와 커버 유리 (또는 조직) 사이의 접촉 영역 불안정의 전형적인 소스입니다. 렌즈는 객관적인 히터 난방 도움이 될 수 있습니다; 또는, 자동 초점 시스템 현미경 좋습니다.</li>
		<li>실험의 확인 요구 사항을 충족 높은 숫자 조리개와 확대 렌즈 선택 (이 섹션의 끝에 참고).</li>
		<li>이득, 채널 설정, 검사 속도, 픽셀 해상도, 깊이 볼륨, 스텝 크기 및 단계에 실험 동물을 배치 하기 전에 평균 현미경 설정을 최적화.</li>
		<li>수집 시간을 줄이기 위해 양방향으로 스캔.</li>
		<li>현미경에는 안정적인 상태에 도달 했습니다 및 설정을 dummy의 도움으로 테스트 후 마 취 마우스 prewarmed 현미경 스테이지에 배치.</li>
		<li>관심 영역 지하실 막 같은 매트릭스 내의 초점으로 밝은 빛 조명 사용 하 여 가져오고 간단히 적용된 fluorophores에 대 한 적절 한 필터 설정으로 자외선에 의해 모 세관 검사.</li>
		<li>스캐닝 모드; 전환 낮은 해상도 256 x 256 모드에서 검색을 시작 하 고 이득을 강화 하 고 레이저 출력 신호 모니터에 관찰 때까지.</li>
		<li>관심의 구조에 초점입니다. 모든 세부 사항을 볼 수 있습니다 때까지 확대.</li>
		<li>정의 &#34; 시작 &#34; 및 &#34; 끝 &#34; 축 방향에 위치.</li>
		<li>검색 중지.</li>
		<li>스테핑 크기 (예를 들어, 0.5 µ m) 및 초점 비행기 (예를 들어, 10-20)의 수 정의.</li>
		<li>스위치 이동 subcellular 구조 또는 셀 선택 검사의 속도 따라 최종 픽셀 해상도 (512 x 512 또는 1024 x 1024) 속도 (스캔 주파수) 움직임에 가장 맞는. 스택의 인수를 고정 권장 양방향 검색. 
		참고: 충분 한 이미지 품질을 제공 하는 검색의 높은 스캔 속도 선택 합니다. 전형적인 포인트 스캐너 400 Hz 및 1.4 kHz 사이 속도 제공합니다. 공 진 스캐너 추가 8 kHz 또는 12 kHz를 제공합니다. Y-방향으로 줄 수를 줄이면, 스캔 속도 증가 될 수 있다 추가 (일반적인 값은 512 x 512, 512 x 256 또는 512 x 200 픽셀 해상도). 신호 대 잡음 비율에 따라 하나 2와 4 사이 평균 라인을 추가 하 여 이미지 품질을 개선 하기 위해 시도할 수 있습니다. 일반적으로, 8 KHz 공명 스캐너; 양방향 모드에서 18 ms의 인수 시간/프레임에 결과 없이 평균 512 x 200의 설정 512 x 200과 x 평균 4 프레임 당 56 ms 아래로 느려집니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Volz, K. S., Miljan, E., Khoo, A., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+pluripotent+stem+cells+for+vascular+therapy.">Development of pluripotent stem cells for vascular therapy.</a> Vascular pharmacology. 56 (5-6), 288-296 (2012).</li><li>Henry, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+VIVA+trial:+Vascular+endothelial+growth+factor+in+Ischemia+for+Vascular+Angiogenesis.">The VIVA trial: Vascular endothelial growth factor in Ischemia for Vascular Angiogenesis.</a> Circulation. 107 (10), 1359-1365 (2003).</li><li>Wagner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+intravenous+injection+of+murine+bone+marrow+derived+monocytes.">Isolation and intravenous injection of murine bone marrow derived monocytes.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (94), (2014).</li><li>Herold, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+monocytes:+a+novel+strategy+for+in+vivo+augmentation+of+collateral+vessel+growth.">Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth.</a> Human gene therapy. 15 (1), 1-12 (2004).</li><li>Ito, W. D., Arras, M., Scholz, D., Winkler, B., Htun, P., Schaper, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+but+not+collateral+growth+is+associated+with+ischemia+after+femoral+artery+occlusion.">Angiogenesis but not collateral growth is associated with ischemia after femoral artery occlusion.</a> The American journal of physiology. 273 (3 Pt 2), H1255-H1265 (1997).</li><li>Herold, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetanus+toxoid-pulsed+monocyte+vaccination+for+augmentation+of+collateral+vessel+growth.">Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611 (2014).</li><li>. Matrigel Matrix Available from: <a target="_blank" href="https://www.corning.com/au/en/products/life-sciences/products/surfaces/matrigel-matrix.html">https://www.corning.com/au/en/products/life-sciences/products/surfaces/matrigel-matrix.html</a> (2017)</li><li>Eubank, T. D., Galloway, M., Montague, C. M., Waldman, W. J., Marsh, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF+induces+vascular+endothelial+growth+factor+production+and+angiogenic+activity+from+human+monocytes.">M-CSF induces vascular endothelial growth factor production and angiogenic activity from human monocytes.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md. 1950). 171 (5), 2637-2643 (2003).</li><li>Fridman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+tumor+growth+of+both+primary+and+established+human+and+murine+tumor+cells+in+athymic+mice+after+coinjection+with+Matrigel.">Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel.</a> Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).</li><li>Woodman, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolin-1+knockout+mice+show+an+impaired+angiogenic+response+to+exogenous+stimuli.">Caveolin-1 knockout mice show an impaired angiogenic response to exogenous stimuli.</a> The American journal of pathology. 162 (6), 2059-2068 (2003).</li><li>Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+bone+marrow+derived+monocytes:+a+novel+approach+for+augmentation+of+arteriogenesis+in+a+murine+model+of+femoral+artery+ligation.">Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation.</a> American journal of translational research. 5 (2), 155-169 (2013).</li><li>Houthuys, E., Movahedi, K., Baetselier, P., de Van Ginderachter, J. o. A., Brouckaert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+isolation+and+purification+of+mouse+peripheral+blood+monocytes.">A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes.</a> J. Immunol. Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).</li><li>Berthold, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+monocytes+by+Ficoll+density+gradient+centrifugation.">Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation.</a> Blut. 43 (6), 367-371 (1981).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

여기 설명 하는 방법을 부수적인 동맥의 개발이이 선박에 monocytes의 동작 및 arteriogenesis의 과정에 빛이 나. 이 프로토콜을 적용 하기 위한 단계는 쉽게 학습과 과학의 다른 분야에서 사용 될 수 있습니다. 이러한 장점에도 불구 하 고 몇 가지 단점이 있다. 예를 들어, 현미경 장비 설명된 기법을 실행 해야 합니다. 한 실험에 대 한 장비를 얻는 하는 것은 장치를 공유 하는 다른 기관과 협력 하는 것이...

심혈 관 질환, 관상 동맥 심장 질환 또는 말 초 동맥 질환을 포함 하 여 죽음의 가장 일반적인 원인은 세계적으로1. 세포 치료 외과 중재를 받을 수 없는 사람들을 위해 특히 심혈 관 질환을 치료 하는 유망한 접근 이다. 치료 도구2,3는 관류를 개선 하 고 허 혈 성 및 underperfused 조직의 기능을 유지 하는 전반적인 목표와 셀 또는 그들의 secreted를 사용 하 여 여러 접근이 있다. 이 목표를 달성 하기 위해 한 시도 arteriogenesis, 부수적인 동맥의 개발을 향상을 향상 시킬 것입니다. Monocytes는 담보와 관련 한 중요 한 세포 유형입니다. 우리의 그룹 허 혈 및 후속 염증6유도 hindlimb 허 혈 모델을 사용 하 여 특히 염증4,5의 분야에서 monocytes의 효과 연구에 집중 했다. Monocytes 염증의 지역를 담보7의 개발을 이끌어 내는 복잡 한 조직 반응 일으킬 합니다.
Intravital 현미경 검사 법의 사용, 우리는 이러한 세포에 vivo에서 의 동작을 연구 하 고 염증의 지역에 주입된 monocytes의 추적 관찰 수 있습니다. 대부분의 이전 연구는만 사후 분석, 조직학 아티팩트 및 준비에 필요한 동물의 많은 수의 소개를 포함 하 여 단점을 보유 하 고 있는 설명 합니다. 우리의 접근, 우리 면역 프로세스를 조사할 수와 여러 시간 점에서 통해 부수적인 형성 라이브 이미징.
부수적인 동맥 허 혈 성 지역에서의 개발 이외 monocytes는 또한 종양의 성장 영향. 이러한 프로세스를 조사, 우리 Engelbreth-Holm-떼 마우스 육 종, 종양 세포 외 기질 단백질8, 풍부한에서 추출한 지하실 막 같은 매트릭스를 주사 하 고 intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여 분석. 이 행렬은 내 피 세포 네트워크 형성 또는 신생 억제;을 통해 항 암 치료에 대 한 스크린 테스트 분자에 사용 이 경우에, 우리는 세포 치료9,,1011monocytes의 종양 신생 잠재력을 평가할 것입니다.
이 프로토콜의 목표는 vivo에서 모델에서 허 혈에 의해 발생 하는 면역 과정을 공부 하는 간단 하 고 효율적인 방법을 보여 줍니다. 우리는 사후 근육 조직의 조직학 검사 결과에 비해 더 현실적인 테스트 환경을 생성할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>10% fetal calf serum (FCS)</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% penicillin/streptomycin</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1mL Omnifix -F insuline syringe</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml syringe&amp;nbsp;</td><td>Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany</td><td></td><td>Injectomat- syringe 50 ml with canule</td></tr><tr><td>6-well-ultra-low-attachement-plates</td><td>Corning Incorporated, NY, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8- 12 week old, male, C57BL/6, BalbC mice&amp;nbsp;</td><td>Charles River, Sulzfeld, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhesive tape</td><td>TESA SE, Hamburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquisition Software</td><td>Leica, Wetzlar, Deutschland&amp;nbsp;</td><td></td><td>Leica Application Suite Advanced Fluorescence (LAS AF); Version: 2.7.3.9723</td></tr><tr><td>Canules</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany</td><td></td><td>29G, 30G</td></tr><tr><td>Cell culture dish</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture medium</td><td>Manufactured by our group with single components</td><td></td><td>Medium199, 10% Fetal calf serum, 1% Antibiotic (penicillin/streptomycin)</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany</td><td></td><td>Allegra X-15R centrifuge</td></tr><tr><td>Depilatory cream</td><td>Veet, Mannheim, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DiO</td><td>Invitrogen Eugene, Oregon, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disinfection agent</td><td>Sch&amp;uuml;lke&amp;amp;Mayr GmbH, Norderstedt, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable scalpel No.10&amp;nbsp;</td><td>Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer flask</td><td>GVB, Herzogenrath, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 70%</td><td>Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbr&amp;uuml;cken, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Rubis, Stabio, Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flurophor/Rhodamindextran</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td><td>Katalognummer: D-1819</td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td>R&amp;ouml;sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating pad&amp;nbsp;</td><td>Labotect GmbH, G&amp;ouml;ttingen, Germany&amp;nbsp;</td><td></td><td>Hot Plate 062</td></tr><tr><td>Human macrophage-colony stimulating factor</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Germany</td><td>SRP3110&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Humane leucocyte filters</td><td>Blood preservation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter Deutschland GmbH, Unterschlei&amp;szlig;heim, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamine (10%)</td><td>Ketavet, Pfizer Deutschland GmbH, Berlin , Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leukocyte separation tubes (tubes with filter)&amp;nbsp;</td><td>Bio one GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light microscope&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany</td><td></td><td>Axiovert 40 C</td></tr><tr><td>Lymphocyte separation medium LSM1077</td><td>GE Healthcare, Pasching, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&amp;nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium M199&amp;nbsp;</td><td>PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microbiological work bench</td><td>Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany</td><td></td><td>Hera safe</td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe</td><td>Art. Nr. 1879</td><td></td></tr><tr><td>Microscope stand with incubator and heating unit</td><td>&amp;nbsp;Leica DMI 6000, Pecon, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monocyte wash buffer</td><td>Manufactured by our group with single components</td><td></td><td>PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA</td></tr><tr><td>Mouse restrainer</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multi-photon microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica, Wetzlar, Deutschland&amp;nbsp;</td><td></td><td>Leica SP5 Confocal microscope, Cameleon, Coherent</td></tr><tr><td>NaCl (0,9%)</td><td>Berlin Chemie AG, Berlin, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neubauer counting chamber&amp;nbsp;</td><td>Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-K&amp;ouml;nigshofen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective</td><td>Leica, Wetzlar, Deutschland&amp;nbsp;</td><td></td><td>Leica HC PL APO 10x/0.4 CS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany</td><td></td><td>ph 7,4 sterile</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Manufactured by our group with single components</td><td></td><td>90 % Percoll, 10% 1,5M NaCl, &amp;rho;= 1,064 g cm-3</td></tr><tr><td>Percoll solution</td><td>GE Healthcare, Bio-Science AB, Uppsala, Sweden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td><td></td><td>10&amp;micro;L/100&amp;micro;L/200&amp;micro;L/1000&amp;micro;L</td></tr><tr><td>Pipettes serological</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td></td><td>&amp;nbsp;Cellstar2ml, 5ml, 10ml</td></tr><tr><td>Pipetting heads</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetus</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol tube</td><td>Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissor</td><td>Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Mettler PM4800 Delta Range, Mettler-Toledo GmbH, Gie&amp;szlig;en, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suction unit</td><td>Integra bioscience, Fernwald, Germany</td><td></td><td>Vacusafe comfort</td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue solution 0,4 %</td><td>Sigma Aldrich, Hamburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes with cap</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td></td><td>15ml, 50ml Cellstar</td></tr><tr><td>Xylazine (2 %)</td><td>Ceva Tiergesundheit GmbH, D&amp;uuml;sseldorf, Germany</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

intravital microscopy of monocyte homing and tumor-related angiogenesis in a murine model of peripheral arterial disease

주변 동맥 질환과 허 혈 성 심장 질환에 대 한 치료 목표 hemodynamic 협 착 증으로 인 한 허 혈 성 영역에 혈액 흐름을 증가 하는. 혈관 수술은 가능한 옵션을 선택한 경우에만 통증, 중요 한 사지 허 혈, 또는 생활에 주요 중단 휴식 또는 작업 진행 등 수술을 위한 표시 없이 환자에 대 한, 그들의 질병을 완화 하기 위해 몇 가지 가능성이 있다. 부수적인 형성의 자극을 통해 관류 monocyte 강화 통해 세포 치료 비-침략 적 몇 가지 옵션 중 하나입니다.
우리의 그룹 hindlimb 허 혈 모델을 사용 하 여 마우스에 monocyte 이식 후 arteriogenesis을 검사 합니다. 이전에 우리 hindlimb 관류 syngeneic monocyte 파상풍 자극이 식을 사용 하 여 향상을 증명 하고있다. 부수적인 형성에 효과 뿐만 아니라 종양의 성장 뿐만 아니라이 치료에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 이러한 효과 조사, 우리 후 대 퇴 동맥의 폐색, 마우스의 측면에 Engelbreth-Holm-떼 육의 기질을 주입 하 여 지하실 막 같은 매트릭스 마우스 모델을 사용 합니다.
인공 종양 연구 후 우리를 vivo에서 종양-신생 및 부수적인 동맥 내에서 귀환 하는 monocyte intravital 현미경 검사 법을 사용. 이전 연구는 사후 아티팩트에 후속 분석을 전제로 동물 모델의 조직학 검사를 설명 했습니다. 우리의 접근 지역 실시간으로 시퀀스에서 담보의 monocyte 유도 시각화, 수행, 쉽게 arteriogenesis 및 종양 혈관 신생 비보의 과정을 조사 하 고.

Intravital 현미경 종양 성장과 부수적인 선박 monocytes에 의해 실행의 시험에 대 한 종양 혈관 신생 및 arteriogenesis의 분자 메커니즘에 새로운 측면을 보여줄 수 있습니다. 셀 준비 되어야 하 고 신중 하 게 프로토콜의 단계를 사용 하 여 주입. 차이 단일 실험 사이 변이 발생할 수 있습니다. 정 맥 시스템 (그림 1) 조직의 효과 유지 하 고 주입 동맥 시스템에...

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Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

Monocytes는 주변 동맥 질병의 맥락에서 arteriogenesis의 중요 한 중개자. 지하실 막 같은 매트릭스 및 intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여,이 프로토콜 대 퇴 동맥 결 찰 murine 모델에 monocyte 주입 후 monocyte 유도 및 종양 관련 신생을 조사 합니다.

Intravital 현미경 Monocyte 유도 및 주변 동맥 질병의 Murine 모델에서 종양 관련 신생의

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

7.1K 조회수.  University of Magdeburg. Monocytes는 주변 동맥 질병의 맥락에서 arteriogenesis의 중요 한 중개자. 지하실 막 같은 매트릭스 및 intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여,이 프로토콜 대 퇴 동맥 결 찰 murine 모델에 monocyte 주입 후 monocyte 유도 및 종양 관련 신생을 조사 합니다.

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Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary sites. Recently, we established that cancer cell dissemination in primary breast cancer and at metastatic sites in the lung occurs only at doorways called Tumor MicroEnvironment of Metastasis (TMEM). TMEM doorway number is prognostic for distant recurrence of metastatic disease in breast cancer patients. TMEM doorways are composed of a cancer cell which over-expresses the actin regulatory protein Mena in direct contact with a perivascular, proangiogenic macrophage which expresses high levels of TIE2 and VEGF, where both of these cells are tightly bound to a blood vessel endothelial cell. Cancer cells can intravasate through TMEM doorways due to transient vascular permeability orchestrated by the joint activity of the TMEM-associated macrophage and the TMEM-associated Mena-expressing cancer cell. In this manuscript, we describe two methods for assessment of TMEM-mediated transient vascular permeability: intravital imaging and fixed tissue immunofluorescence. Although both methods have their advantages and disadvantages, combining the two may provide the most complete analyses of TMEM-mediated vascular permeability as well as microenvironmental prerequisites for TMEM function. Since the metastatic process in breast cancer, and possibly other types of cancer, involves cancer cell dissemination via TMEM doorways, it is essential to employ well established methods for the analysis of the TMEM doorway activity. The two methods described here provide a comprehensive approach to the analysis of TMEM doorway activity, either in na&#239;ve or pharmacologically treated animals, which is of paramount importance for pre-clinical trials of agents that prevent cancer cell dissemination via TMEM.

We describe two methods for assessing transient vascular permeability associated with tumor microenvironment of metastasis (TMEM) doorway function and cancer cell intravasation using intravenous injection of high-molecular weight (155 kDa) dextran in mice. The methods include intravital imaging in live animals and fixed tissue analysis using immunofluorescence.

세포 내 이미징 및 고정 조직 분석을 사용하여 암 세포 보급과 관련된 전이 의 종양 미세 환경 평가

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

연구

암 연구학

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

라이브 마우스의 혈관 염증과 혈전 형성하는 동안 활성화 내피에 Heterotypic 혈소판 - 호중구 상호 작용의 실시간 영상

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

면역학 및 감염병학

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

골수 세포 역학의 실시간 영상<em&gt; APC<sup&gt; 최소 / +</sup</em&gt; 소장 종양 디스크 공 초점 현미경을 회전시켜

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

마우스 골수 단핵구를 추적<em&gt; 생체</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

실시간으로 마취 마우스에 생체 내에 현미경으로 장간막 혈관에서 호중구와 단핵구 이미징

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability to role and adhere to the endothelial layer. Visualization of circulating cells by injection of fluorescent dyes or fluorophore-coupled antibodies is commonly used. Alternatively, fluorescent reporter mice can be used. Interactions of leukocytes, in particular lysozyme M+ (LysM+) monocytes, with the vessel wall play pivotal roles in promoting vascular dysfunction and arterial hypertension. We here present the technique to visualize and quantify leukocyte rolling and adhesion in carotid arteries in angiotensin II (AngII)-induced hypertension in mice by IVM.
The implantation of a catheter damages the vascular wall and leads to altered blood cell responses. We compared different injection techniques and administration routes to visualize leukocytes in a LysMCre+IRG+ mouse with widespread expression of red fluorescent protein and conditional expression of green fluorescent protein in LysM+ cells. To study LysM+ cell activation, we used AngII infused mice in which rolling and adhesion of leukocytes to the endothelium is increased. We either injected acridine orange using a jugular catheter or directly though the tail vein and compared the amount of rolling and adhering cells. We found that jugular catheter implantation per se increased the number of rolling and adhering LysM+ cells in sham-infused LysMCre+IRG+ mice compared to controls. This activation was augmented in AngII-infused mice. Interestingly, injecting acridine orange directly through the tail vein did not increase LysM+ cell adhesion or rolling in sham-infused mice. We thereby demonstrated the importance of transgenic reporter mice expressing fluorescent proteins to not interfere with in vivo processes during experimentation. Furthermore, tail vein injection of fluorescent tracers might be a possible alternative to jugular catheter injections.

This manuscript describes the use of transgenic reporter mice and different administration routes of fluorescent dyes in angiotensin II-induced hypertension using intravital video microscopy of blood vessels to evaluate the activation of immune cells and their ability to roll and adhere to the endothelium.

백혈구 롤링 Angiotensin II-주입 마우스에서 접착 시각화: 기술 및 함정

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

Intravital 현미경 종양 관련 맥 관 구조를 사용 하 여 고급 등 유전자 변형 형광 생쥐 피부 집계 창 실

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

의학

Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for analyzing collateral arteries and leukocytes in arteriogenesis is ex vivo (immuno-) histological methodology. However, this technique does not allow the measurement of dynamic processes such as blood flow, shear stress, cell-cell interactions, and particle velocity. This paper presents a protocol to monitor in vivo processes in growing collateral arteries during arteriogenesis utilizing intravital imaging. The method described here is a reliable tool for dynamics measurement and offers a high-contrast analysis with minimal photo-cytotoxicity, provided by multiphoton excitation microscopy. Prior to analyzing growing collateral arteries, arteriogenesis was induced in the adductor muscle of mice by unilateral ligation of the femoral artery.
After the ligation, the preexisting collateral arteries started to grow due to increased shear stress. Twenty-four hours after surgery, the skin and subcutaneous fat above the collateral arteries were removed, constructing a pocket for further analyses. To visualize blood flow and immune cells during in vivo imaging, CD41-fluorescein isothiocyanate (FITC) (platelets) and CD45-phycoerythrin (PE) (leukocytes) antibodies were injected intravenously (i.v.) via a catheter placed in the tail vein of a mouse. This article introduces intravital multiphoton imaging as an alternative or in vivo complementation to the commonly used static ex vivo (immuno-) histological analyses to study processes relevant for arteriogenesis. In summary, this paper describes a novel and dynamic in vivo method to investigate immune cell trafficking, blood flow, and shear stress in a hindlimb model of arteriogenesis, which enhances evaluation possibilities notably.

The recruitment of leukocytes and platelets constitutes an essential component necessary for the effective growth of collateral arteries during arteriogenesis. Multiphoton microscopy is an efficient tool for tracking cell dynamics with high spatio-temporal resolution in vivo and less photo-toxicity to study leukocyte recruitment and extravasation during arteriogenesis.

쥐 뒷다리 모델에서 동맥 형성 중 백혈구 모집을 모니터링하기 위한 다광자 생체 내 이미징

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for ...

High-Resolution Three-Dimensional Imaging of the Footpad Vasculature in a Murine Hindlimb Gangrene Model

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering from its most severe form, chronic limb-threatening ischemia (CLTI), face substantial impairments to daily living, including chronic pain, limited walking distance without pain, and nonhealing wounds. Preclinical models have been developed in various animals to study PAD, but mouse hindlimb ischemia remains the most widely used. There can be significant variation in response to ischemic insult in these models depending on the mouse strain used and the site, number, and means of arterial disruption. This protocol describes a unique method combining femoral artery and vein electrocoagulation with the administration of a nitric oxide synthase (NOS) inhibitor to reliably induce footpad gangrene in Friend Virus B (FVB) mice that resembles the tissue loss of CLTI. While traditional means of assessing reperfusion such as laser Doppler perfusion imaging (LDPI) are still recommended, intracardiac perfusion of the lipophilic dye 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) is used to label the vasculature. Subsequent whole-mount confocal laser scanning microscopy allows for high-resolution, three-dimensional (3D) reconstruction of footpad vascular networks that complements traditional means of assessing reperfusion in hindlimb ischemia models.

The present protocol describes a unique, clinically relevant model of peripheral arterial disease that combines femoral artery and vein electrocoagulation with the administration of a nitric oxide synthase inhibitor to induce hindlimb gangrene in FVB mice. Intracardiac DiI perfusion is then used for high-resolution, three-dimensional imaging of the footpad vasculature.

Murine Hindlimb Gangrene 모델에서 발판 혈관 구조의 고해상도 입체 이미징

Peripheral arterial disease (PAD) is a significant cause of morbidity resulting from chronic exposure to atherosclerotic risk factors. Patients suffering ...

Intravital 현미경 Monocyte 유도 및 주변 동맥 질병의 Murine 모델에서 종양 관련 신생의

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