The authors thank G&#252;nter Oberd&#246;rster, DVM, PhD and Alison Elder, PhD (University of Rochester) and Mary Frame, PhD (Stony Brook University) for animal research collaborations resulting in tissue samples for analysis. Additionally, the authors thank: Christina Rotondi (Albany Medical College Histology Core); Rani Sellers, DVM, PhD and Barbara Cannella, PhD (Albert Einstein College of Medicine Histology and Comparative Pathology Facility); Leonardo Bezerra and Ahlam Abuawad (Brenner research team members); and Leslie Krauss, Byron Cheatham and Elyse Johnson (CytoViva). This work was supported in part by CDC-NIOSH grant OH-009990-01A1 and the NanoHealth and Safety Center, New York State, awarded to S.B.

<ol>
	<li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+a+single+mesoporous+silica+nanoparticle+into+a+human+lung+cancer+cell+observed+by+differential+interference+contrast+microscopy.">Endocytosis of a single mesoporous silica nanoparticle into a human lung cancer cell observed by differential interference contrast microscopy.</a> Anal Bioanal Che. 391 (6), 2119-2125 (2008).</li><li>Anselme, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+cells+and+bacteria+with+surfaces+structured+at+the+nanometre+scale.">The interaction of cells and bacteria with surfaces structured at the nanometre scale.</a> Acta Biomate. 6 (10), 3824-3846 (2010).</li><li>Anshup, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+gold+nanoparticles+in+human+cells.">Growth of gold nanoparticles in human cells.</a> Langmui. 21 (25), 11562-11567 (2005).</li><li>Weinkauf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+dark+field+microscopy+for+rapid+artifact+free+detection+of+nanoparticle+binding+to+Candida+albicans+cells+and+hyphae.">Enhanced dark field microscopy for rapid artifact free detection of nanoparticle binding to Candida albicans cells and hyphae.</a> Biotechnol. 4 (6), 871-879 (2009).</li><li>Sondi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+nanoparticles+as+antimicrobial+agent:+a+case+study+on+E+coli+as+a+model+for+Gram+negative+bacteria.">Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E coli as a model for Gram negative bacteria.</a> J Colloid Interface Sc. 275 (1), 177-182 (2004).</li><li>Berry, C. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperspectral+reflectance+and+fluorescence+imaging+system+for+food+quality+and+safety.">Hyperspectral reflectance and fluorescence imaging system for food quality and safety.</a> T Am Soc Ag En. 44 (3), 721-730 (2001).</li><li>Mercer, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrapulmonary+transport+of+MWCNT+following+inhalation+exposure.">Extrapulmonary transport of MWCNT following inhalation exposure.</a> Part Fibre Toxico. 10 (1), 38 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

종래의 조직 학적 염색법, 금속 산화물 나노 입자의 식별 및 분석을받은 조직 샘플은 EDFM, HSI 매핑, 및 영상 분석 기술들의 조합을 통해 달성 될 수있다 들어. 그것은 샘플 최적 시각화 50-10 ㎛의 두께로 절단하는 것이 중요하다; 조직학 또는 면역 조직 샘플 준비 유연성 (얼룩의 타입 등, 고정 또는 고정 된 조직을 사용하여)이 존재한다. 여기에 사용 된 시료를 헤 마톡 실린 및 에오신으로 염색하고 coverslipped, 유리 현미경 슬라이드에 장착, 포르말린 고정 파라핀 이전 6 ㎛의 두께로 회전하는 마이크로톰으로 절편을했다. 생체 외 피부 침투 독성 협력에서 돼지 피부 조직은 본 연구에 사용 하였다. 조직은 수성 현탁액에서 금속 산화물 나노 입자 (알루미나, 실리카, 세리아)에 노출시켰다. 관심 영역 (들)의 검출 (고 대비 eleme국세청) EDFM 후속 HSI 매핑 및 분석을 용이하게하는 중요한 첫 번째 단계입니다. 양성 및 음성 대조군 샘플 이미징 및 참조 용 스펙트럼 라이브러리를 만들기 위해 먼저 분석해야한다. 양성 대조군에서 수집 된 스펙트럼은 양성 대조군 스펙트럼 라이브러리에 수출하고 있습니다. 그리고, 음의 제어 화상의 모든 스펙트럼 특이성을 개선하기 위하여 양성 대조군의 스펙트럼 라이브러리로부터 감산된다 (위양성을 감소). 결과 필터링 스펙트럼 라이브러리는 관심 물질의 분석을 위해 제공하는 RSL 간주됩니다. 모든 조직 샘플은 동일 화상 형성 공정을 거치며 RSL 대해 매핑된다. 결과 이미지는 검은 배경 위에 관심의 요소와 영역 만 포함됩니다. 이 이미지는 다음 ImageJ에 시야 당 매핑 입자의 영역을 획득하기 위해 임계 값과 입자 분석 기능을 사용하여 분석 될 수있다. ImageJ에 얻은 수치 데이터를 수출 할 수있다추가 분석을 위해 스프레드 시트로 에드. 이는 생물학적 시료가 서로 본질적으로 다르​​며, 염색 방법 EDFM과 HSI 통해 시각화에 영향을 미칠 수 있으므로, 노출 설정은 시료의 특정 유형에 대한 가장 높은 콘트라스트 이미지를 생성하는 것에 따라 결정되어야 함을 고려하는 것이 중요하다. 오탐 (false positive)의 감소가 스펙트럼 라이브러리를 여과를 통해 달성 될 수 있지만,이 오염에 대응하는 스펙트럼 잠재적 양성 대조군의 스펙트럼 라이브러리에서 필터링 될 수 있으므로, 그것은, 관심있는 요소의 오염을 회피 한 신뢰성있는 음성 대조군을 얻기 위해 매우 중요 , 위음성 율을 증가시킨다. SP를 생성 축적 된 입자의 수​​가 높은 영역 : 또한, 하이퍼 스펙트 럴 이미징 소프트웨어와 검출 가능한 스펙트럼 강도 범위가 특정 소프트웨어의 한계 능가 없다 (본 연구를위한, 즉 16000 단위이다)강도 한도 이상의 ectral 강도 인해 위음성의 수를 증가의 위험, 스펙트럼 라이브러리에서 제외된다. HSI 시스템은 기존의 방법에 비해 많은 장점을 부여하지만, 고려해야 할 몇 가지 단점과 한계가 있습니다. 하나는 상당한 컴퓨팅 성능을 요구할 수의 수집 된 광 데이터 다량있다. 또 다른 기준 스펙트럼 라이브러리가 생성 될 때 HSI는 특히 초기 단계에서 시간이 많이 될 수 있다는 것이다. 또한, 촬영 시간은 간단한 암시 야 영상보다가 느리게 만들고, 이미지 캡처 당 몇 분을 필요로 할 수있다 그러나, 여전히 전자 현미경에 의해 샘플 준비 및 시각화를 수행하는 것보다 더 빠르다. 또한, 복잡한 시스템은 매우 전문화 제어의 개발을 필요로하고 26 어려운 표준화 보편적 기준 라이브러리의 구축을 여러 특성 스펙트럼을 초래할 수있다. 최종적으로, 첨단개별 원자를 해결할 수있는 등의 원자력 현미경 또는 투과 전자 현미경과 같은 프로브 - 또는 전자 현미경 기법보다 낮은 해상도에서 nique 결과. 이 기술의 해상도로 인해 나노 미터 수준에서 정확하게 또는 서브 미크론 수준에서 물질을 찾기위한 입자 크기를 측정하기위한 고정밀 공구 할 수없는 성질의 광자, 제한된다. 기술은 특정 조직 구획 또는 세포 소기관 내에서 입자를 정확하게 지적 할 수 있지만 (예 : 세포 핵 등)보다 1 ㎛, 작은 세포 기관 또는 기능은이 방법으로 정확하게 시각화하기 위해 도전하고 있습니다. 또한 공간 해상도 주어진 참고,의,이 방법은 단일 나노 입자 덩어리 (11)를 구별 할 수 없습니다. 기타 고려 사항은 다음과 같습니다 (예 : 귀금속 등) 특정 재료들을 쉽게 analy 할 수 있도록 할 수있는, 훨씬 더 높은 반사율과 별개의 스펙트럼 프로파일이ZE이 도구를 사용하여 스펙트럼지도. 같은 반 금속이 연구에서 조사 산화물과 탄소 기반 나노 물질 24, 27와 같은 다른 사람들은 그들의 원소 조성, 형상에 더 도전, 그리고 매트릭스에 따라 수 있습니다. 머서 의해 외. 두 뮤린 흡입 연구에서, 본 연구에 사용 된 것과 유사한 시스템이 폐와 주위 조직과의 현저하게 높은 콘트라스트 차에 기초하여 장기에 탄소 나노 튜브를 찾기 위해 사용 하였다. 탄소 섬유의 형상은 고유 식별을위한 충분한 특성이었다 때문에, 하이퍼 스펙트 럴 매핑은, 어느 연구 것으로 입증되지 않았다. 정상적인 생물 물리학 적 과정을 통하여 특정 장기에 관심 나노 입자를 증착하는 단계 (그리고 종종 그 자체 연구 주제) 예측할 수 있기 때문에, 적용 양성 대조군의 결정이 어려울 수 있으며, 상기 제어 m의 방법 생성을 고려를 요구한다 : 또 다른 고려 사항은 조직 특이 관한관심 물질의 상태에 영향을 ight. 스펙트럼 라이브러리는 관심 깨끗한 나노 입자에서 생성되는 경우, 예를 들어, 인한 변화에 따른 예를 들어 입자 (의 변화로 인한 스펙트럼 변화에 조직 또는 세포에서와 같은 나노 입자 라이브러리를 매핑하기 어려울 수있다 산도, 용해, 응집, 단백질 결합) 및 전체 미세 또는 매트릭스. 마지막으로,이 기술은 그 반 정량적 자연 제한된다 : 그것은 단지 쉽게 그러한 재료의 전체 장기 부담을 특징으로 작업을 수행 할 수 없음을 의미 유사한 해상도, 다른 이차원 현미경 기술로 정량 할 수있다. 전반적 EDFM 및 HSI는 TEM, HAADF 및 DIC 같은 종래 나노 이미징 특성화 기술에 비해 몇 가지 장점을 제공한다. EDFM / HSI 더 집중적 편의에 비해 시간과 비용을 절약 빠른 이미지 획득 및 분석을 허용적인 기술. 또한 EDFM / HSI 용 샘플 준비 시간을 절약하고이어서 다른 기술에 사용될 수 있기 때문에, 또한 주어진 샘플의보다 유연한 분석을 허용하는 일반적으로 최소 및 비파괴 모두이다. 또한, HSI 많은 조성물의 나노 물질의 분석 및 행렬의 다양한 있도록 다재다능하다. 연구팀은이 기술의 특이성에 대한 심층적 인 평가를 포함한 기타 자료 및 샘플 유형, 여기에 기술 된 방법을 구체화하기 위해 노력하고 있습니다. 연구팀의 조사에서 중요한 다음 단계는 기존의 골드 표준에 대한 이러한 기술 검증 (예, 라만, TEM, SEM) 재료와 관심의 조직 유형.

나노 물질이 점점 산업 및 다양한 용도에 사용되는 바와 같이, 더 신속한 저렴 및 전자 현미경과 같은 기존의 양상,보다 편리 나노 이미징 및 특성화 방법이 필요하다. 미분 간섭 대비 (DIC) 현미경 (1) 및 내부 전반사 (TIR) ​​또는 근 등 산장 기반 접근 방식을 포함하여 많은 광학 기술이 채용 된 세포, 조직 및 생활 시스템과 나노 입자 (NP)의 상호 작용을 시각화 필드 주사 광학 현미경 (NSOM) 2,3. 그러나 이러한 대부분의 비 전문 연구소 4의 손이 닿지 않는 곳에 하이 엔드 분석 접근 방식이다. 투과 전자 현미경 (TEM)을 포함하여 전자 현미경은 또한 세포와 5,6,7,8- NP 상호 작용을 연구하는데 사용되었다. 높은 각도 환형 암시 야 (HAADF) 주사 투과형 전자 현미경 된 NP의 상호 작용을 연구하기 위해 사용되어왔다바이러스 9. 공 초점 현미경 NP-세포 상호 작용 (10)을 연구하는 데 또 다른 인기있는 기술이다. 최근, 암시 야 계 초 분광 영상 (HSI) 기술은 생물학적 매트릭스 11 NPS를 연구하기위한 유망한 분석 도구로서 사용되어왔다. HSI 시스템 또는 하이퍼 큐브 datacube 12라고도 공간 및 스펙트럼 데이터의 3 차원 표현을 생성한다. 스펙트럼 변동 공간지도 소재 식별을 위해 사용된다. 공지 된 재료의 스펙트럼 프로파일이 생성 미지 시료에 비교 참조 라이브러리로서 사용될 수있다. HSI 시스템과 주요 이점 중 하나는 이에 의해 공지 된 유사한 조성물의 다른 기준 입자에 이들과 결합뿐만 아니라 또는 생체 생체 내 위치 알려지지 된 NP의 분포를 확립 분광법으로 촬상을 결합 할 수있는 능력이다. 여러 장점이 있습니다종래의 이미징 기술 위에 HSI 시스템을 사용 : 최소 샘플 준비가 요구된다; 시료 준비는 자연에서 일반적으로 비파괴; 이미지 수집 및 분석은 빠르다; 기술은 비용 효율적인 13이고; 혼합 된 조성물 및 / 또는 복잡한 매트릭스의 화합물의 공간 분포 분석은보다 쉽게 14 달성된다. 귀금속 나노 물질을 포함하는 샘플의 연구를위한 가장 중요한 고려 사항 중 하나는 잠재적 반복 하나 이상의 방법에 의해 시료를 검사 할 수있는 비파괴 이미징 법의 유용성이다. 반복 또는 복수의 분석은 하나의 방법에서 사용하지 못할 것입니다 포괄적 인 데이터 세트를 개발하는 것이 바람직 할 수있다. 이러한 측면에, 그 광학 특성을 연구하는 샘플을 분석하는 안전한 방법이다. 향상된 암시 야 현미경 (EDFM)와 HSI 시스템을 사용하여 샘​​플의 광학 응답을 연구 - 즉 reflectance뿐만 아니라, 흡광도 및 투과율 - 기능 식별 및 특성은 15을 행할 수있다. 잠재적 인 특성 엔드 포인트는 상대적인 크기와 샘플 내에서 나노 입자 또는 덩어리와 나노 입자의 분포의 모양에 대한 평가를 포함한다. 본 논문에서는 스펙트럼 각도 맵퍼 (SAM)로 지칭 화소 스펙트럼 매치 알고리즘을 기반 HSI 시스템을 이용하여 사후 조직에서 금속 산화물 나노 입자에 대한 구체적 매핑 방법을 설명한다. 이 동물 모델은 나노 물질에 대한 노출의 건강 영향을 평가하는 데 사용되는 것을 특징으로하는 생체 나노 독성학 연구에서 현재와 미래를 보완 할 수있는 잠재력을 가지고 있기 때문에 우리는이 특정 응용 프로그램을 선택했다. 이 방법의 응용 프로그램은 또한 조직 또는 동물 모델을 이용하여 나노 약물 전달 연구를 알릴 수있다. O에 걸쳐 특히, 나노 입자의 흡수, 분포, 대사, 배설에rgans와 조직이 시스템을 조사 할 수있다. 애플리케이션의 다양한 생물 의학 연구 (11)에서 사용하기 위해 연구되고있다. 이 방법은 원소 조성물 16-19의 다양한 나노 입자에 노출되어 (예컨대 다양한 조직 유형, 기관지 폐포 세척액 시료 및 혈액 도말 같은) 상이한 생물학적 시료의 평가에 이용 될 수있다. 또한,이 방법은 생체 내에서와 나노 약물 전달 연구 (11)에 대한 관련입니다 체외에서 나노 입자의 생체 분포를 연구하는 데 유용합니다. 생물학적 시료 넘어 EDFM 및 HSI는 폐수 20 환경 시료에서 나노 입자를 평가할 수있다. 이 나노 입자의 침입을 방지 개인 보호 장비의 효능을 평가하는 데 사용될 수 있기 때문에, 작업장 노출 평가는 물론이 기술의 사용에 의해 촉진 될 수있다. 또한, 연구 테오전 현재 직업적 노출 평가에서 수집 된 나노 입자의 필터 미디어 샘플의 평가 및 유사 EDFM HSI 프로토콜을 개발하고있다. EDFM HSI 및 이러한 다른 종류의 시료 준비는 다를 수 있지만, 그들이 쉽게 광학계에 의해 가시화 될 수있는 방식으로 제조하는 것이 중요하다. 그것은 전통적인 시야 현미경을 통해 가시화 될 것처럼 일반적 시료로한다. (11) 시판의 하이퍼 스펙트 럴 여러 이미징 시스템이있다.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CytoViva 150 Unit (condenser)</td>
			<td>CytoViva (Auburn, AL)</td>
			<td></td>
			<td>mounted to Olympus BX43 microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX43 Microscope - Analyzer Slot - HSI with 10x and 40x air objectives and 100x oil immersion objective</td>
			<td>obtained through CytoViva (Auburn, AL)</td>
			<td></td>
			<td>for use with CytoViva 150 Unit condenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dagexcel-M Digital Firewire Camera - Cooled; includes Exponent 7 software</td>
			<td>obtained through CytoViva (Auburn, AL)</td>
			<td></td>
			<td>enhanced darkfield camera and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software</td>
			<td>obtained through CytoViva (Auburn, AL)</td>
			<td></td>
			<td>hyperspectral camera and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides)</td>
			<td>Schott NEXTERION</td>
			<td>1025087</td>
			<td>reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22mm x 22mm x&#160; 1.45mm)</td>
			<td>Schott NEXTERION</td>
			<td>custom</td>
			<td>reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>type A microscopy immersion oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12368B</td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropanol in water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td></td>
			<td>free open-source software online download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>metal oxide nanoparticles</td>
			<td>supplied to the research team by industrial partners</td>
			<td></td>
			<td>alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of metal oxide nanoparticles in histological samples by enhanced darkfield microscopy and hyperspectral mapping

Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the identification, localization, and characterization of nanoscale materials in biological samples is on the rise. Currently available methods, such as electron microscopy, tend to be resource-intensive, making their use prohibitive for much of the research community. Enhanced darkfield microscopy complemented with a hyperspectral imaging system may provide a solution to this bottleneck by enabling rapid and less expensive characterization of nanoparticles in histological samples. This method allows for high-contrast nanoscale imaging as well as nanomaterial identification. For this technique, histological tissue samples are prepared as they would be for light-based microscopy. First, positive control samples are analyzed to generate the reference spectra that will enable the detection of a material of interest in the sample. Negative controls without the material of interest are also analyzed in order to improve specificity (reduce false positives). Samples can then be imaged and analyzed using methods and software for hyperspectral microscopy or matched against these reference spectra in order to provide maps of the location of materials of interest in a sample. The technique is particularly well-suited for materials with highly unique reflectance spectra, such as noble metals, but is also applicable to other materials, such as semi-metallic oxides. This technique provides information that is difficult to acquire from histological samples without the use of electron microscopy techniques, which may provide higher sensitivity and resolution, but are vastly more resource-intensive and time-consuming than light microscopy.

하이퍼 스펙트 럴 현미경 측정법에 유사한 방식으로 물질을 식별하는 능력에 유용하다. 그림 1에 나타낸 바와 같이, 각각의 재료는 여러 가지 특성 스펙트럼과 고유의 반사율의 전체 모양을 가지고 있습니다. 또한,도 1은 스펙트럼 정보의 매트릭스 - 의존 특성을 도시한다 : 조직 학적 조직 샘플에서 세 금속 산화물의 각각의 (상부 패널)에 대한 스펙트 럴 프로파일은 수성 현탁액의 3 금속 산화물 각각에 대한 스펙트 럴 프로파일 (상이한 하단 패널). 동일한 매트릭스 미지 시료에 분광 특성 정보를 매핑함으로써, 기술은 재료의 유무를 확인하는 데 유용하고, 또한 반 정량적으로 샘플 물질의 상대적인 양을 비교할 수있다. 양성 대조군 피부 샘플에서 생성 된 기준 스펙트럼 라이브러리는 실험에 매핑에 적합한피부 샘플. 도 2에 도시 된 바와 같이, 기준 스펙트럼 라이브러리 대응 양성 대조군 웰에 매핑하고 대응하는 음성 대조군에 매핑되지 않는다. 기술의 가장 중요한 장점은 샘플에서 관심 물질의 낮은 수준을 검출 할뿐만 아니라, 오염물들을 구별 할 수있는 능력이다. . 예를 들어, 개별 나노 튜브는 20~30g 쥐 25에서 40 μg의 낮은 용량의 흡입시 폐에서 관찰 할 수있다 그림 3이 조직 학적 피부 샘플을 보여줍니다 일부 입자가 암시 야 광학 이미지에서 쉽게 명백한 반면 (열을 2) 나머지는 명 시야 현미경 (컬럼 1), 또는 다른 방법을 사용하여 누락되었을 수있는 하이퍼 스펙트 럴 영상 (컬럼 3)를 사용하여 검출된다. 암시 야 HSI의 사용은 단순 시야 현미경 위에 특이성을 향상시키는 역할을한다. 이러한 이미지는 다음, 분석의 더 정량적 형태의 대상이 될 수 없음ImageJ에 통해 otably 입자 분석. 향상된 암시 야 현미경 심지어 하이퍼 스펙트 럴 이미징 부재에서 여러 가지 응용을 갖는다. 첫번째 품질 높은 콘트라스트 이미지를 생성하는 능력이다. 이 가장 잘되는 관심의 입자는 그들의 시야 대응에 비해 쉽게 식별하고, 그림 3에 의해 입증된다. 하이퍼 스펙트 럴 매핑의 부재 하에서,주의가 관심 입자로부터 오염물 입자 혼란을 방지 할 필요가 있지만 이들 이미지는 또한, 입자 정량 분석​​의 대상이 될 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig1.jpg" /> 스펙트럼 라이브러리 (서스펜션의 나노 입자)에 비해 그림 1 참조 스펙트럼 라이브러리 (조직 매트릭스). 이 도면은 유모으로부터의 기준 스펙트럼 라이브러리를 생성하는 것의 중요성을 보여준다실험 샘플과 같은 행렬에 대한 관심이 omaterials. 첫 번째 행이 연구 (알루미나, 실리카, 세리아)의 각 물질에 대한 기준 스펙트럼 라이브러리 (RSL)를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 이 RSL은 양성 대조군 조직 샘플을 음성 대조군 조직 샘플에 대해 여과하고이 프로토콜에 기재된 방법에 의해 만들어졌다. 두 번째 행은 유리 슬라이드에 액체 현탁액에 대한 관심의 나노 입자에서 생성 된 스펙트럼 라이브러리 (SL)를 보여줍니다. 더 곡선 덜 특유의 피크가 약 650의 파장에서 약 600 실리카, 피크에서 알루미나 순이익 서스펜션 SL에서 관찰되었다 반면, 알루미나를 들어, 500과 650의 파장에서 바이 모달 피크, RSL에서 발견했다 더 곡선 덜 특유의 피크가 arou에 실리카 순이익 서스펜션 SL에 보였다 반면, RSL에 존재덜 특유의 피크가이 국민 연금이 포함 된 행렬이 만들어 제안하는 것이 주변 (560)에 세리아 순이익 서스펜션 SL에서 관찰되었다 반면 차 세리아를 들어 600은 바이 모달 피크, RSL 520과 620의 파장에서 발견되었다 특정 실험에 대한 SL을 만들 컨트롤을 선택할 때 상당한 될 수 있습니다 스펙트럼의 변화. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig2.jpg" /> 그림 2. 참조 스펙트럼 라이브러리 (조직 매트릭스) 양성 대조군과 음성 대조군 돼지 피부 조직에 매핑. 각 RSL (왼쪽 열)의 대응 양성 대조군 (가운데 열)에 잘 매핑과는 음성 대조군 (오른쪽 열)에 대응에 매핑되지 않는다는 점에서이 그림은., 실험 샘플 매핑에 맞게 RSL에 확인 역할을 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig2large.jpg" target="_blank">하십시오 시간을 클릭</a>감수는이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig3.jpg" /> 금속 산화물 나노 입자에 노출 실험 돼지의 피부 조직의도 3 초 분광 매핑. 각각 표피, 진피, 피하 조직 : 위에서 아래로 행은 다른 표면에서 깊은 층에 피부의 층에 해당합니다. 첫째 행은 현탁액 중의 알루미나 NP에 노출 된 피부 샘플로부터 표피의 각질층을 나타낸다 두 번째 행은 서스펜션에 NPS를 대 실리카에 노출되었다 세 번째 행은 서스펜션에 NPS를 산화 세륨합니다. 각 열은 다른 이미징 기술과 피부의 동일한 영역을 나타낸다. 첫 번째 열은 빨간색 사각형으로 둘러싸인 영역이 확대 된 시야 현미경 (40X 잡지; 스케일 바 = 50 μm의)에 해당 (100X 잡지, 스케일 바 = 10 μm의) 강화 암시 야 현미경과 (EDF흰색 화살표가 높은 콘트라스트 된 NP를 가리키는 두 번째 열에서 M). 세 번째 열은 같은 고 대비 NP에 (흰색 화살표)를 보여, 하이퍼 스펙트 럴 카메라 (HSI)를 얻었다. EDFM 및 HSI 이미지는 100 배의 배율로 찍은; 스케일 바는 10 μm의 =. 네 번째 열은 알루미나 된 NP는 녹색, 빨간색 실리카 NP에, 그리고 세리아 NP에 표시됩니다 각 노출 그룹에 대한 각각의 RSL에 대해 매핑 HSI 이미지를 보여줍니다 노란색, 각각. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Identification of Metal Oxide Nanoparticles in Histological Samples by Enhanced Darkfield Microscopy and Hyperspectral Mapping

Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.

향상된 암시 야 현미경 및 초 분광 매핑하여 조직 학적 샘플에서 금속 산화물 나노 입자의 식별

Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the ...

identification-metal-oxide-nanoparticles-histological-samples

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.3K 조회수.  SUNY Polytechnic Institute, Colleges of Nanoscale Science and Engineering. Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.

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Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

마우스 중심에 액션 후보와 칼슘 과도의 광학 매핑

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

연구

생체공학

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide nanoparticles (IONP) (Fe3O4) to yield a magnetic bacterial nanocellulose (MBNC). The synthesis of MBNC is a precise and specifically designed multi-step process. Briefly, bacterial nanocellulose (BNC) pellicles are formed from preserved G. xylinus strain according to our experimental requirements of size and morphology. A solution of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3&#183;6H2O) and iron(II) chloride tetrahydrate (FeCl2&#183;4H2O) with a 2:1 molar ratio is prepared and diluted in deoxygenated high purity water. A BNC pellicle is then introduced in the vessel with the reactants. This mixture is stirred and heated at 80 &#176;C in a silicon oil bath and ammonium hydroxide (14%) is then added by dropping to precipitate the ferrous ions into the BNC mesh. This last step allows forming in situ magnetite nanoparticles (Fe3O4) inside the bacterial nanocellulose mesh to confer magnetic properties to BNC pellicle. A toxicological assay was used to evaluate the biocompatibility of the BNC-IONP pellicle. Polyethylene glycol (PEG) was used to cover the IONPs in order to improve their biocompatibility. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IONP were located preferentially in the fibril interlacing spaces of the BNC matrix, but some of them were also found along the BNC ribbons. Magnetic force microscope measurements performed on the MBNC detected the presence magnetic domains with high and weak intensity magnetic field, confirming the magnetic nature of the MBNC pellicle. Young&#39;s modulus values obtained in this work are also in a reasonable agreement with those reported for several blood vessels in previous studies.

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe2+ and Fe3+ ferrous ions inside the BNC mesh.

철 산화물 나노 입자와 기능화 자기 세균 Nanocellulose의 제작

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the target site while minimizing deleterious effects to off-target sites. Magnetic cell targeting is an efficient, safe, and straightforward delivery technique. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) are biodegradable, biocompatible, and can be endocytosed into cells to render them responsive to magnetic fields. The synthesis process involves creating magnetite (Fe3O4) nanoparticles followed by high-speed emulsification to form a poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) coating. The PLGA-magnetite SPIONs are approximately 120 nm in diameter including the approximately 10 nm diameter magnetite core. When placed in culture medium, SPIONs are naturally endocytosed by cells and stored as small clusters within cytoplasmic endosomes. These particles impart sufficient magnetic mass to the cells to allow for targeting within magnetic fields. Numerous cell sorting and targeting applications are enabled by rendering various cell types responsive to magnetic fields. SPIONs have a variety of other biomedical applications as well including use as a medical imaging contrast agent, targeted drug or gene delivery, diagnostic assays, and generation of local hyperthermia for tumor therapy or tissue soldering.

Targeted cell delivery is useful in a variety of biomedical applications. The goal of this protocol is to use superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) to label cells and thereby enable magnetic cell targeting approaches for a high degree of control over cell delivery and localization.

셀 라벨 및 초상 자성 산화철 나노 입자로 타겟팅

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the synthesis of hydrophobic nanoparticles, our method is based on an adaptation from thermal decomposition method to microwave driven synthesis. The new methodology produces a decrease in the reaction times in comparison with traditional procedures. Moreover, the use of the microwave technology increases the reproducibility of the reactions, something important from the point of view of clinical applications. The novelty of this iron oxide nanoparticle is the attachment of Neridronate. The use of this molecule leads a bisphosphonate moiety towards the outside of the nanoparticle that provides Ca2+ binding properties in vitro and selective accumulation in vivo in the atheroma plaque. The protocol allows the synthesis and plaque detection in about 3 hr since the initial synthesis from organic precursors. Their accumulation in the atherosclerotic area in less than 1 hr provides a contrast agent particularly suitable for clinical applications.

Microwave technology enables extremely fast synthesis of iron oxide nanoparticles for atherosclerosis plaque characterization. The use of an aminobisphosphonate in the external side of the nanoparticle provides a fast accumulation in the atherosclerotic area.

동맥 경화의 빠른 검색을위한 산화철 나노 입자의 전자 레인지 중심의 합성

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

Fabrication of a Dipole-assisted Solid Phase Extraction Microchip for Trace Metal Analysis in Water Samples

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water samples. A brief overview of the evolution of chip-based SPE techniques is provided. This is followed by an introduction to specific polymeric materials and their role in SPE. To develop an innovative dipole-assisted SPE technique, a chlorine (Cl)-containing SPE functionality was implanted into a poly(methyl methacrylate) (PMMA) microchip. Herein, diverse analytical techniques including contact angle analysis, Raman spectroscopic analysis, and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry (LA-ICP-MS) analysis were employed to validate the utility of the implantation protocol of the C-Cl moieties on the PMMA. The analytical results of the X-ray absorption near-edge structure (XANES) analysis also demonstrated the feasibility of the Cl-containing PMMA used as an extraction medium by virtue of the dipole-ion interactions between the highly electronegative C-Cl moieties and the positively charged metal ions.

The fabrication protocol of a dipole-assisted solid phase extraction microchip for the trace metal analysis is presented.

물 샘플에서 추적 금속 분석을위한 쌍극자를 이용한 고체 단계 추출 마이크로 칩의 제작

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

양자점 나노 입자를 사용하여 상호 빛 - 및 전자 현미경

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

액체에서의 펄스 레이저 어블 레이션에 의한 금속 나노 입자의 제조 : 나노 입자의 항균성 연구를위한 도구

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling molecules at low levels and damaging molecules at high levels. Accumulation of ROS in stressed plants can damage metabolites, enzymes, lipids, and DNA, causing a reduction of plant growth and yield. The ability of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) to catalytically scavenge ROS in vivo provides a unique tool to understand and bioengineer plant abiotic stress tolerance. Here, we present a protocol to synthesize and characterize poly (acrylic) acid coated nanoceria (PNC), interface the nanoparticles with plants via leaf lamina infiltration, and monitor their distribution and ROS scavenging in vivo using confocal microscopy. Current molecular tools for manipulating ROS accumulation in plants are limited to model species and require laborious transformation methods. This protocol for in vivo ROS scavenging has the potential to be applied to wild type plants with broad leaves and leaf structure like Arabidopsis thaliana.

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Here, we present a protocol for the synthesis and characterization of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) for ROS (reactive oxygen species) scavenging in vivo, nanoceria imaging in plant tissues by confocal microscopy, and in vivo monitoring of nanoceria ROS scavenging by confocal microscopy.

식물 반응 산소 종에서 Vivo에서 음이온 세 륨 산화물 나노 입자의 촉매 청소

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling ...

Using Magnetometry to Monitor Cellular Incorporation and Subsequent Biodegradation of Chemically Synthetized Iron Oxide Nanoparticles

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized in cells and then left within. One challenge is to assess their fate in the intracellular environment with reliable and precise methodologies. Herein, we introduce the use of the vibrating sample magnetometer (VSM) to precisely quantify the integrity of magnetic nanoparticles within cells by measuring their magnetic moment. Stem cells are first labeled with two types of magnetic nanoparticles; the nanoparticles have the same core produced via a fast and efficient microwave-based nonaqueous sol gel synthesis and differ in their coating: the commonly used citric acid molecule is compared to polyacrylic acid. The formation of 3D cell-spheroids is then achieved via centrifugation and the magnetic moment of these spheroids is measured at different times with the VSM. The obtained moment is a direct fingerprint of the nanoparticles&#8217; integrity, with decreasing values indicative of a nanoparticle degradation. For both nanoparticles, the magnetic moment decreases over culture time revealing their biodegradation. A protective effect of the polyacrylic acid coating is also shown, when compared to citric acid.

Iron oxide nanoparticles are synthesized via a nonaqueous sol gel procedure and coated with anionic short molecules or polymer. The use of magnetometry for monitoring the incorporation and biotransformations of magnetic nanoparticles inside human stem cells is demonstrated using a vibrating sample magnetometer (VSM).

자기 측정을 사용하여 화학적으로 합성된 산화철 나노 입자의 세포 통합 및 후속 생분해를 모니터링합니다.

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized ...

High-Speed Ultraviolet Photoacoustic Microscopy for Histological Imaging with Virtual-Staining assisted by Deep Learning

Surgical margin analysis (SMA), an essential procedure to confirm the complete excision of cancerous tissue in tumor resection surgery, requires intraoperative diagnostic tools to avoid repeated surgeries due to a positive surgical margin. Recently, by taking the advantage of the high intrinsic optical absorption of DNA/RNA at 266 nm wavelength, ultraviolet photoacoustic microscopy (UV-PAM) has been developed to provide high-resolution histological images without labeling, showing great promise as an intraoperative tool for SMA. To enable the development of UV-PAM for SMA, here, a high-speed and open-top UV-PAM system is presented, which can be operated similarly to conventional optical microscopies. The UV-PAM system provides a high lateral resolution of 1.2 &#181;m, and a high imaging speed of 55 kHz A-line rate with one-axis galvanometer mirror scanning. Moreover, to ensure UV-PAM images can be easily interpreted by pathologists without additional training, the original grayscale UV-PAM images are virtually stained by a deep-learning algorithm to mimic the standard hematoxylin- and eosin-stained images, enabling training-free histological analysis. Mouse brain slice imaging is performed to demonstrate the high performance of the open-top UV-PAM system, illustrating its great potential for SMA applications.

A high-speed and open-top ultraviolet photoacoustic microscope that can provide histological images intraoperatively for surgical margin analysis is demonstrated, including the system configuration, optical alignment, sample preparation, and experimental procedures.