이 나노 포자 기반 검출 방법은 개별 분자를 물리적으로 특성화하고 식별할 수있는 잠재력을 입증했습니다. 이 비디오의 목적인 메탈로 나노 입자로 작업하는 것은 측정의 정확성과 정밀도를 제한하는 것에 대한 우리의 이해에 도전적입니다. 이 기술의 주요 장점은이 장치는 우리가 나노 포어에서 더 빠른 결과와 더 많은 반응을 볼 수 있습니다 기존의 지질 이중 층 메모리 설정보다 더 큰 대역폭을 가지고 있다는 것입니다.
이 기술은 1990년대 초에 단백질 나노포레에서 게이팅, 즉 다른 상태 들 사이를 전환하면 제어될 수 있고 분자가 모공 벽에 결합될 수 있다는 것을 보여주었기 때문에 가능해졌습니다. 이 기술은 최소한의 샘플을 사용하기 때문에 상용 DNA 염기서열 분석 응용 프로그램을 위해 개발되고 있습니다. 형광 라벨이 필요하지 않으며 기존 방법보다 읽기 길이가 훨씬 길어집니다.
이 기술은 또한 젤 전기 전광및 크로마토그래피보다 더 큰 정확도와 속도로 크기에 따라 폴리머를 구별하기 위해 개발되었습니다. 먼저, 1-연체 나트륨 의 용액 500 밀리리터와 전해질로 초순수 수에서 10밀리알라 모노나트륨 인산염을 준비한다. 이 특정 설정으로 신선한 솔루션과 샘플을 사용하는 것이 가장 좋습니다.
또한, 우리는 고품질의 탈이온수가 성공적으로 멤브레인을 형성하는 데 매우 중요하다는 것을 발견했습니다. 다음으로, lyophilized 야생 형 단백종 S.aureus 알파 헤몰리신 파우더의 1 밀리그램을 초순수 수의 1 밀리리터와 결합합니다. Staph aureus 알파 혈몰리신 독소 단백질로 작업하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.
이 절차를 수행할 때 MSDS의 예방 조치를 따르십시오. 다음으로, 유리 신발성 유리병에서 endecaine에 밀리리터 DPhyPC 당 5 밀리그램의 4 밀리리터를 준비합니다. 유리병을 폴리테트라플루오로틸렌 안감의 캡으로 캡을 씌우고 최대 한 달 동안 섭씨 4도에 보관하십시오.
그 후, 2 밀리머 폴리옥소 메탈라네이트 용액을 만들기 위해 전해질의 10 밀리리터에 12-인산 산 수화의 57.6 밀리그램을 용해. POM 솔루션을 두 개의 5밀리리터 부분으로 나눕니다. 수산화 나트륨 3개를 사용하여 하나의 POM 용액의 pH를 5.5로 조정합니다.
시험을 위해 준비하는 것을 시작하려면, 평면 지질 양층 전기 생리학 장치의 시험 세포를 조립. 첫째, 600그루의 모래사포가 달린 은색 와이어를 10분 동안 시판되는 하이포염소산 나트륨에 담그어 은은염화물 와이어 전극을 만듭니다. 장치의 석영 모세관에 삽입하기 전에 와이어 전극을 헹구고 건조시십시오.
전극을 석영 나노포어 멤브레인 또는 QNM 내부에 보관하여 모세관과 저수지를 분리합니다. 그런 다음 저수지의 은 와이어에 장착 된 원통형 은 은 염화물 펠릿 전극을 놓습니다. 두 전극을 앰프 회로 기판에 연결합니다.
다음으로 데이터 수집 프로그램을 열고 0 밀리볼트에서 전원 공급 장치를 시작합니다. 빈 셀의 전극 사이에 DC 전류가 검출되지 않는지 확인합니다. 이 데모 동안 트랜스 카세필 압력이 멤브레인 형성과 후속 나노 포어 형성에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 지켜보는 것이 중요합니다.
이 두 단계를 올바르게 수행하지 않으면 실험이 작동하지 않습니다. 전해질 약 1밀리리터를 주사기에 적재하고 저수지에 연결된 유체 선에 연결합니다. 증폭기를 포화시키는 전극 사이의 이온 전류에 의해 표시된 바와 같이 QNM의 면이 침수될 때까지 저장소에 전해질을 추가합니다.
증폭기가 포화되지 않으면, 1볼트의 팝 전압을 적용하거나 모세관 압력을 약 300밀리미터까지 증가시킴으로써 QNM을 막히게 한다. 필요한 경우 두 기술을 모두 사용합니다. 증폭기가 포화되면, 현재가 0으로 돌아오는 것으로 표시된 대로 용액 수준이 QNM 아래로 떨어질 때까지 저장소에서 전해질을 철회하십시오.
지질 이중층 형성 공정을 시작하려면 전해질 용액 수준을 QNM의 얼굴 보다 훨씬 높게 올리고 얼마나 많은 용액이 걸렸는지 주목하십시오. 그런 다음 10 마이크로리터 파이펫 팁을 DPHyPC 솔루션에 담그고 눈에 보이는 모든 지질을 팁에 그립니다. 파이펫 끝을 전해질 용액의 표면에 터치하고 지질이 공기 물 인터페이스를 가로 질러 파이펫에서 흐를 수 있도록합니다.
지질이 용액 에 균일하게 퍼질 때까지 2~5분 정도 기다립니다. 다음으로, 용액의 표면이 QNM 아래에 있을 때까지 천천히 전해질을 철회한 다음 QNM 위의 용액을 들어 올려 절연 지질 이중층 멤브레인을 형성합니다. 두 층이 세 번의 시도 후에 형성되지 않으면 이전에 설명된 것과 같은 다른 지질 부분을 적용하고 프로세스를 반복하십시오.
이중층이 형성되면, 이중 층을 팝업 모세관에 압력을 증가하 여 천천히 하 강 하 하 고 이전 과 같은 방식으로 솔루션 수준을 높이 면 그것을 개혁. 이 프로세스를 여러 번 반복하여 QNM이 막히지 않고 이중 레이어가 형성되었는지 확인합니다. 다음으로, 얼음이나 실온에서 알파 헤몰리신 단백질의 알리쿼트를 해동합니다.
250 나노그램의 단황 알파 혈몰리신 단백질과 약 250마이크로리터의 초순수로 저수지를 채웁니다. 이어서, 공극 형성을 유도하기 위해 200~400밀리볼트 바이어스를 적용한다. 모공 형성을 용이하게 하기 위해 모세관 압력을 40~200mm의 수은으로 증가시켜 QNM에서 이중층을 확장합니다.
일단 나노포어가 형성되면, 측정 전압에 적용된 바이어스를 줄이고 압력을 삽입 압력의 약 절반으로 줄입니다. 테스트를 시작하려면 DC 오프셋 전압을 재조정하여 적용된 전위가 0으로 설정될 때 측정된 전류가 없도록 합니다. 다음으로, 저수지에 비해 120밀리볼트에서 음수 120밀리볼트의 적용된 잠재력에 대한 이온 전류 추적을 획득한다.
자발적인 전류 봉쇄로 표시될 오염 물질이 없는지 확인합니다. 저장고에 pH 5.5 2밀리머 POM 클러스터 솔루션의 1~6개의 마이크로리터를 추가합니다. 음의 120 밀리볼트의 적용 된 전압에서 이온 전류 타임 시리즈 측정을 적용합니다.
알파 혈모리신 채널을 통한 개별 음이온 인성 인산 분자의 이동은 평균 개방 포공 이온 전류를 약 80%까지 감소시키는 일시적인 봉쇄를 생성하여 입자-모공 상호작용과 직접적으로 관련이 있어 이온종은 상대 봉쇄 깊이비의 히스토그램에서 분화될 수 있도록 한다. pH 5.5에서 깊이 비율은 약 0.06 및 0.16으로 두 개의 피크를 관찰하였다. 인NMR을 기준으로, 사소한 피크는 6-마이너스 인산주 종이었고, 주요 피크는 7-마이너스 종이었다.
pH 7.5에서 상대 농도는 6-마이너스 종의 더 높은 비율로 7-마이너스 종으로 이동했습니다. pH 5.5에 비해 봉쇄 이벤트의 20배 감소는 자유로운 인산염 및 텅스테이트 이온으로 의분해되었기 때문입니다. 거주 시간 분포를 맞추기 위해서는 여러 기하급수적 기능이 필요했으며, 이는 각 이온 종 내에서 여러 유형의 파티클-모공 상호 작용을 나타냅니다.
pH 7.5의 짧은 체류 시간은 pH 5.5보다 약한 입자-모공 상호 작용을 제안했으며, 알파 혈류증 채널 루멘 의 상대적 수의 pH 의존적 변화를 보여주는 이전 연구와 일치합니다. 고순도 탈이온된 물은 이 특정 한 설정에 매우 중요합니다. 소비된 유기물 필터 카트리지는 실험실에서 몇 달 동안 QMC에 멤브레인을 형성할 수 없는 원인일 가능성이 큽니다.
이 특정 버전의 메서드에 새로 새로 워진 개인은 멤브레인이 너무 작고 나노 포자를 형성하는 트릭이 있기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 수십 년 전에 시작된 이 방법은 이온, 핵산 및 합성 폴리머뿐만 아니라 DNA 염기서열을 분석하는 데 유용하다고 입증되었습니다. 그것은 또한 생물 물리학 및 기본 세포 생물학에 있는 응용프로그램을 찾아볼 수 있었습니다.
예를 들어, 이 절차는 합성 폴리머 및 바이오 폴리머의 물리적 특성을 연구하여 크기, 다른 분자와의 상호 작용 및 기타 중요한 질문을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
