We thank Dr. Shahid Mukhtar for critiquing the manuscript and Dr. Xinnian Dong for the sample data analysis file. This work is supported by a NSF-CAREER award (IOS-1350244) to KPM and the UAB Biology Department.

다음 텍스트는 애기 장대에서 PSM ES4326 주사기 침투 분석을 최적화 수행하기 위해 단계적으로 프로토콜을 설명합니다. 이 분석 주요 절차는 단순화 된 플로우 차트 (그림 1)에 표시됩니다. 1. 식물 성장 조건 <ol><li> 소우 씨 <ol><li> 느슨하게 바닥 O에서 그들을 담가 토양과 물을 냄비 가득 2 냄비 (직경 4, 높이 3.75)를 준비 / N 여분의 물을 배수하기 전에. </li><li> 시트 나 다른 종이 무게 접힌 70mm 각 냄비, 50 ~ 100 애기 씨, 야생 형 골-0 또는 npr1-1 돌연변이를 뿌리고. </li><li> 80-90% (그림 2A)에 상대 습도를 높이기 위해 물을 뿌려 투명 돔이있는 냄비를 커버. </li></ol></li><li> 전체 계층화 및 동기 발아 수 있도록 72 시간 동안 4 ° C에서 냄비를 품어. </li><li> 표준 성장 조건에 냄비로 이동 (12 시간 빛/ 12 시간 어두운, 21 ° C, 빛의 세기 100 μmol / 평방 미터 / 초, 상대 습도 40 %)은 씨앗이 발아 할 수 있도록합니다. 물 응축을 방지하는 데 도움이됩니다 성장 방에 전송 직후 구멍에 2-3 생성 돔 균열. </li><li> 최초의 진정한 잎은 길이 2~3mm의 크기에 도달하면, 평면 흙으로 채워진 72 우물에 냄비에서 모종을 이식. <ol><li> 평면에서 토양 표면의 중앙에 1 깊은 함몰 만들 손가락 또는 1 ml의 피펫 팁을 사용한다. </li><li> 부드럽게 가능한 한 적은 루트 손상 개별 모종을 분리합니다. 조심스럽게 집게로 그대로 뿌리를두고 모종을 선택합니다. </li><li> 우울증에 이식 충격을 최소화하고 부드럽게 우울증을 채우기 위해 주변의 흙을 가볍게하기 위해 부착 된 흙 덩어리와 함께 하나의 분리 된 종묘를 놓습니다. 생물 학적 폐기물 용기에 여분의 모종과 토양을 취소하고 따라 폐기 할 것지역 생물 학적 폐기물 처리 지침. </li><li> 물은 상부로부터 모종을 옮기고 완전히 80~90% 습도를 유지하기 위해 물이 뿌려 투명한 돔 평평한 커버. 다음 4 일의 아침에 돔 균열 완전히 그 날의 말을 제거, 3 일간 돔에 보관하십시오. 주 : 파종 종자 대안 평면 토양 가득 72 웰 상 유리 피펫 2-3 종자를 전송 한 다음 4 ℃에서 48 시간 동안 1 ㎖의 0.1 % 한천을 함유하는 1.5 mL의 원심 분리 튜브에 층화 종자에 의해 수행 될 수있다. 플랫은 발아 후 1 주일 제거 될 수 투명 돔 커버 될 필요가있다. 여분 모종 잘 당 하나의 모종을 남길 수있다. </li></ol></li><li> 20 분 동안 1 물에 아파트를 적시에 의한 워터 식물 매 2 일 후 여분의 물을 배수. 주 : 식물에 물을위한 시간 간격이 성장 실내 습도에 따라 결정하고, 결정된 염기 있어야사용자의 식물 성장 시설의 지속적인 관찰에 D. 그들이 잘 물결 무늬가 있는지 확인하기 위해 매일 식물을 확인합니다. 단지 몇 명소, 물 물총 병 상단에서 그 식물을 건조하는 경우. </li><li> 또는 성장 조건 (광주, 온도)에 따라 3-5 주 이전에 해당 발달 단계 # 3.50 (장미의 크기가 50 % 최종 크기), 근처에 식물 병원균 감염 분석 (단계 3-5)을 수행합니다. 꽃이 핌 출현 (스테이지 # 5)으로 인해 나이와 관련된 저항 (38, 39)의 발병 후 식물을 감염시키지 마십시오. </li></ol> 문화 미디어 및 플레이트 2. 준비 <ol><li> 왕의 B (KB) 액체 배지 1 L합니다. 부드럽게 1,000 ml의 가시적 펠릿 없다 2 O까지 탈 H와 자기 교반 막대를 사용하여 최대 20 g proteose 펩톤 2g 및 인산 칼륨 수화물을 교반한다. 20 분주기에 액 150 ㎖ 유리 병에 나누어지는 100 ㎖ 오토 클레이브. </li><li> 준비KB 고체 배지와 배양 플레이트. <ol><li> 부드럽게 20g Proteose 펩톤, 2g 칼륨 인산염 이염 수화물 1,000 mL를 15g의 한천이 탈 H 2 O를 저어 오토 클레이브. </li><li> 그것은 미래의 응축을 최소화하고 항생제의 저하를 방지하기 위해 터치 멋진 때까지 자기 볶음 접시에 매체를 냉각. 매체에 1 M 황산 멸균 18 ml의 멸균 80 % 글리세롤과 5 mL를 추가합니다. PSM ES4326 50 μg의 ml의 최종 농도로 냉각 매체를 추가 스트렙토 마이신, 스트렙토 마이신에 대해 저항성을 전달 감안할 - 1. </li><li> 접시를 붓는다. 100mm X 15mm 및 150mm X 15mm 배양 접시 : KB 미디어 판의 두 개의 서로 다른 크기를 준비합니다. 작은 페트리 접시 함유 배지는 기본 박테리아 배양 플레이트로서 기능하고, 세균이 플레이트를 계수로 큰 페트리 접시는 역할을한다. 주 : 플레이트 카운트 박테리아, 직사각형 플레이트는를 감소시키기 위해 사용될 수있다두 배 처리는 기존의 둥근 판에 비해 플레이트 당 플롯 할 수 있기 때문에 소모품 비용. <ol><li> 감염 실험을하기 전에 판을 따르십시오. 스트렙토 마이신, 황산 이후까지 2 ~ 3 개월 동안 4 ℃에서 보관 KB 매체 판은 점차 항생제 활동 (40)를 잃는다. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. 강화 된 질병 감수성 (EDS) <ol><li> 1 일 - 접시에 킬 박테리아 <ol><li> 이틀 EDS 분석하기 전에, 행진 PSM ES4326은 -80 C 글리세롤 재고 ° KB-연쇄상 구균 세균 배양 접시에와 24 ~ 48 시간 동안 28 ° C에서 품어. </li></ol></li><li> 제 2 일 - 액체 배양 물 식물을 시작 <ol><li> 28 ° CO / N을 1 스트렙토 마이신 250 rpm으로 흔들 - 50 μg의 용액을 포함하는 4 ml의 액체 KB 매체 멸균 시험관에 액체 문화를 시작합니다. 참고 : EDS 감염 분석의 경우, 유전자형 추천입니다 당 6 식물을 사용하여에디션. STI와 MTI 분석의 경우, 처리 당 유전자형 당 6 식물 권장합니다. 박테리아 접종 들어, 0.3 내지 0.6의 λ 600 ㎚에서 광학 밀도를 갖는 신선한 배양액을 사용하는 것이 권장된다. </li><li> 마크 샘플링에 감염된 조직을 쉽게 식별 무딘 엔드 방수 마커 잎 번호 5와 6의 잎자루 (그림 1). 기공의 개구부를 강화하고 리프로 병원체 용액 입구를 촉진, 20 분 동안 바닥에서 평탄 담가 아니라 식물을 물, 그 여분의 물을 배수. 주 : 대안 적으로, 투명한 돔 평면을 커버하고 개구 기공을 증가 2-4 시간 동안 물에 담가. </li><li> 3 일 - 병원체 희석 주사기 침투 참고 : 아침 시간 동안 병원체 감염 취약 유전자형에서 가장 뚜렷한 질병 증상의 병원균의 증식 및 개발에 최적입니다. 감염되고 유지하기 위해 모든 노력을일관된 이온 타이밍 실험 복제 간의 변동을 줄이는 데 도움 주기성 리듬과 낮의 유전자 조절 (41, 42)의 영향을 제거한다. <ol><li> 실온에서 2 분 동안 9,600 XG에서의 microcentrifuge 1.5 ML 튜브의 박테리아 문화를 펠렛과 상층 액을 버린다. 멸균 10 1 ml의 밀리미터의 MgCl 2 세균성 펠렛을 재현 탁. 참고 : 마그네슘 양이온 (P)의 운동성 및 접착력을 향상시킬 수 있습니다 syringae (43). 또한, 같은 농도에서 황산을 사용합니다. 멸균 물은 마그네슘 염 솔루션에 대한 허용 대체합니다. </li><li> 50 mL의 원심 분리 튜브에 10 mM의의 MgCl 2 9 mL를 박테리아 현탁액을 희석 및 λ = 600 nm에서 분광 광도계로 세균의 광학 밀도 (OD)를 측정한다. 최종 OD600nm에서 10 밀리미터의 MgCl 2 = EDS 감염 분석을위한 0.0002와 박테리아를 희석. </li><li> 잎 침투희석 된 세균 용액을 포함 (일반적으로 인슐린 주사기로 알려짐) 1ml의 끝이 무딘 바늘 주사기. </li><li> 전체 용량의 주사기를 위로 기입하지 마십시오. 침투 과정에서 훨씬 더 잘 제어 할 수 있도록 0.5 ~ 0.6 ㎖로 그것을 입력합니다. </li><li> 집게 손가락의 위에 판의 하부면을 노출하고 부드럽게 손가락의 도움으로 잎 위치를 조정. 그 압력이 균일하게 분포되어 있는지 확인하기 위해 잎 표면에 수직으로 주사기를 놓습니다. 잎 손상을 줄이기 위해 침투하는 동안 주맥 지역을 피하십시오. </li><li> 천천히 세균 솔루션을 침투하는 플런저를 밀어; 리프 어두운 색으로 표시된 바와 같이 잎 엽육에 액상 항목 가시화 될 것이다. 잎의 전체 표면을 침투 시도합니다. 이것은 하나의 시도에서 달성되지 않을 경우, 다른 침윤 스폿을 선택하고, 전체 잎 표면이 피복 될 때까지 상술 된 작업을 반복한다.</li><li> 완료되면, 부드럽게 별도의 병원체 용액을 제거 흡수 조직과 잎을시킨다. 시각적으로 손상 감염된 잎의 조직을 검사합니다. 참고 : 침투가 완료된 후 원형 주사기 인상은 볼 수 없습니다해야합니다. </li><li> 원래의 성장 조건으로 그들을 반환하기 전에 1 ~ 2 시간 동안 건조하기 위해 침투 식물을 남겨주세요. 다음, 물 맑은 돔 스프레이 커버 감염된 식물을 2 시간 동안, 다음 구멍에 2-3를 생성하고 감염 실험의 나머지 부분에 걸쳐 그것을 떠날 돔 균열. 참고 : P. 이후 syringae은 동일한 시설에서 배양 다른 식물에 감염 인자를 전파의 위험이없고, 공기 병원체 아니다. 그러나, 추가 예방 조치로, 인근에 감염된 식물과 다른 실험 식물 사이의 물리적 접촉을 피하십시오. 투명 돔 플랫 취재하면 병원체 독성을 증가시키고 질병의 진행을 가속화 할 것이다.커버링 기간이 단계 및 최적의 기간이 사용자의 식물 성장 설비의 습도에 기초하여 결정되어야 위해 필요하다. </li></ol></li><li> 5 일 - 미디어 판을 사전 건조 <ol><li> 냉장 유니트에서 150mm X 15mm의 KB 판을 가지고 접시에있는 기존의 물 응축을 건조. 약 24 시간 동안 실온에서 그들을 유지하여 건조 판. 이 프로세스의 속도를 높이려면 30 ~ 60 분 동안 금이 그들의 뚜껑 층류 후드에 배치합니다. 주 :이 단계는 다음 단계에서 판의 표면에 원형의 액적 형성에 중요하다. </li></ol></li><li> 6 일 - 병원균의 성장을 정량화 주 : 다음 병원체 정량화 과정이 동일한 양의 박테리아가 식물 잎의 형태를 변경 한 경우에, 특히, 리프로 전달 확인을 위해 감염 후 이전의 시점에서 수행 될 수있다. <ol><li> 출현 후 감염된 조직을 처리백화 현상의 감수성 유전자형에 감염된 조직의 황색으로 표시하지만, 괴사 성 병변의 개발 (그림 2B) 전에. 참고 : 추천 샘플링 시간이 삼일 병원균 접종 후입니다. 병원균의 성장이 환경 적 요인들에 따라 달라질 수 있기 때문에, 인큐베이션의 길이는 2 ½ -3- ½ 일의 범위 내에서 변화 및 ​​사용자의 식물 성장의 시설에서 감염의 진행에주의 관찰에 의해 결정될 필요가있다. <ol><li> 각각의 유전자형 (그림 1) 6 연마 튜브를 준비합니다. 한 스테인레스 스틸 연마 공을 놓고 각각의 튜브에 10 밀리미터의 MgCl 2 멸균 500 μl를 추가합니다. </li><li> 공장에서 감염된 잎을 분리하고 1 구멍 용지 펀치 (그림 1)과 잎 디스크를 펀치. 참고 : 샘플링 오차를 최소화 동일한 위치에서 각각의 표본 잎 펀치하려고. 상단에서 리프 디스크의 샘플링잎의 권장합니다. </li><li> 무작위로 집게를 사용하여 각 연마 튜브 (두 개의 서로 다른 식물에서) 2 잎 디스크를 넣습니다. </li><li> 상기 튜브를 밀봉하고 10 분 동안 최대 속도로 높은 처리량 모지 나이저 (분당 1,600 획)로 조직을 균질화. 조직이 잘 균질화하고 솔루션으로 인해 감염된 잎에서 엽록소 릴리스로 녹색으로 될 때까지 필요한 경우이 과정을 반복합니다. </li></ol></li><li> 균질화 기다리는 동안 멀티 채널 피펫 및 피펫 저장조를 사용하여 180 μL 된 10 mM의 MgCl 2를 96 웰 배양 플레이트의 제 6 행들을 채운다. </li><li> 분쇄 후, 96 웰 플레이트의 첫 번째 행으로 접지 조직 현탁액 20 μL를 전송하고 상기 액체를 위로 및 아래로 반복 피펫 팅에 의해 혼합한다. 조직의 작은 조각이 팁을 방해하는 경우, 용액의 정확한 용적을 습득 2-3 mm 정도를 클립. <ol><li> 상단 O에 물방울을위한 충분한 공간을 제공하기 위해플레이트, 공간 다른 행에 다른 유전형의 조직 (그림 1) F. 10 배 연속 희석을 준비하기 위해, 두 번째 행에 20 μL의 액체를 전송하고 여섯 번째 희석 될 때까지이 과정을 반복합니다. </li></ol></li><li> 전사 나누어 피펫 팁 (도 1)를 사용하여 150mm X 15mm KB 플레이트 상에 96 웰 플레이트에서 용액 20 μL. 가장 집중에 가장 묽은 현탁액에서 작업 할 수 있습니다. 참고 : 번째로 희석 대부분에서 진행 것은 불필요한 희석 사이에 피펫 팁을 변경할 수 있습니다. 플레이트를 미리 잘 건조 된 경우 (일반적으로 15 ~ 30 분)에 흡수 될 때까지 전송 된 액체 방울은 매체의 위에 그대로 유지한다. 건조 시간 RT와 습도에 따라 달라집니다. </li><li> 뚜껑이 금이 실온에서 접시를 닦아냅니다. 더 이상 액체가 플레이트 표면에서 관찰 할 수 없습니다되면, 뚜껑, 반전을 닫고 실온에서 플레이트 또는 28 ° C 배양기를 품어. </li><li> 식민지가 표시 될 때까지 40 ~ 60 시간 동안 번호판을 품어. 판의 성장 단위 (CFU)를 형성 식민지의 예측 10 배 드롭 (그림 2C)를 반영하는지 확인합니다. 그들이 자라다과 식민지 융합 전에 박테리아를 계산합니다. 중첩 콜로니가없는 최저 희석 박테리아의 수를 결정한다. 일반적으로 선호 희석은 10 ~ 50 식민지 사이에 포함됩니다 계산합니다. 주 : 변화는 기술 복제 사이에 존재할 수있다; 따라서, 각 복제에 대한 최저 희석 따로 결정되어야한다. </li><li> 세균 증식의 레벨을 계산하기 위해, 로우 (R)뿐만 아니라, 서면으로 복제 기술 (T) 내의 세균 수의 수를 기록. 콜로니 형성 단위의 수를 결정합니다 - 식을 통해 CFU / 잎 디스크를 : CFU / 잎 디스크 = (T는 × 10 R / 20) 2분의 500 × </li><li> PRODU 다음 스프레드 템플릿에 데이터를 입력그래프 (도 1)에 세륨 (스프레드 시트 데이터 분석 템플릿 파일은 표 2 참조). 각 데이터 포인트는 대수 스케일에 여섯 복제 기술의 평균으로 표현된다. 오차 막대는 평균값의 95 % 신뢰 구간을 나타내는 (N = 6). 참고 : 95 % 신뢰 구간의 산출 수단에서, 기술의 복제 수에 기초하여 조절 될 필요가있다. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. SA-트리거 내성 (STI) <ol><li> 주 1 : 단계 3.1에 ​​기재된 것과 동일한 절차를 수행. </li><li> 주 2 : 액체 세균 배양 (단계 3.2) 식물에 물을하고 시작하는 것 외에도, SA 파생 나트륨 살리 실 레이트 (21)의 외부 응용 프로그램에 의해 저항을 유도한다. 참고 : 순수 SA 가난한 물 용해도가 이전의 pH 조정이 필요, 따라서이 분석하지 않는 것이 좋습니다입니다. <ol><li> 피에 대한 SA-매개 방어를 유도하기 위해 syringae와 미래의 감염 (21)에 대한 주요 식물,(모의)을 벌금 1 mM의 나트륨 살리 실 레이트의 안개 또는 H 2 O 24, 스프레이 식물 병원균 감염 전에 16 ~ 24 시간. </li></ol></li><li> 주 3 : = OD600nm에서 0.001을 병원체 희석을 준비하고 주사기 침투 (단계 3.3)로 전체 잎 표면에 박테리아를 밀어 넣습니다. </li><li> 6 일 방법 : EDS 분석 (단계 3.4 및 3.5)에 기재 한 바와 같이 병원체 정량 및 계산 과정의 경우, 절차를 따르십시오. 접시와 카운트 H 2 O 및 나트륨 살리 실 레이트 - 별도 전처리 샘플. 전처리 된 식물 - 야생형 애기 장대의 경우, 병원균의 성장 1-2 log 감소는 나트륨 살리 실 레이트로 예상된다. </li></ol> 5. MAMP 트리거 면역 (MTI) 참고 :이 분석에서 우리는 애기 장대 야생형 골-0 및 돌연변이 fls2 및 EFR 식물을 사용합니다. FLS2 및 EFR 플라즈마 막 지역화 패턴 인식 수용체 (PRRS) flg22 및 elf18가 인식 할 수있는, respe 있습니다ctively 9, 10. PSM ES4326 외부 MAMP 전처리 및 주사기 침투 다음 돌연변이에 변경되지 않은 병원균의 성장에 의해 표시된다 MAMP의 특정 유형에 무감각 각 PRR 결과의 손실. <ol><li> 제 1 일 및 2 : 단계 3.1 및 3.2에 기술 된 것과 동일한 절차를 수행. </li><li> 주 3 : MAMP 전처리 및 병원체 감염 <ol><li> 의 MAMP 트리거 면역을 설정 플라 젤린 에피토프 flg22 또는 EF-화 에피토프 elf18과의 1 μm의 솔루션을 준비하기 위해 병원체 감염 (단계 3.3.3-3.3.6) 이전에 전체 잎 표면에 4 시간에 그것을 주사기를-침투. 이 피에 대한 MAMP 매개 방어의 유도를 허용합니다 syringae 프라임 미래 감염 6,37의 식물. 참고 : 공개 된 마이크로 어레이 데이터는 flg22 또는 elf18 처리 37,44 후 4 시간을 일 MAMP 응답 유전자의 최대 전사 재 프로그래밍을 밝혔다. 따라서, 4 시간은 좋습니다골-0 MAMP 처리 및 fls2 및 EFR 돌연변이 사이의 병원균 성장에 명확한 차이를 달성 초래 MAMP 사전 치료 기간. </li><li> 흡수성 티슈로 여분의 MAMP 솔루션을 제거하고 잎 내의 액체 흡수 과정을 속도를 폭로 식물을 둡니다. 주사기의 압력 침투의 부상 효과를 설명하기 위해, 제어 식물의 잎에 H 2 O를 침투. </li><li> 외경 600 ㎚에 병원균 희석을 준비 = 0.001 MAMP / H 2 O 전처리 주사기 침투하여 잎 (단계 3.3)의 전체 잎 표면에 박테리아를 밀어 넣습니다. </li></ol></li><li> 제 6 일 : 단계 3.4 및 3.5에 설명 된대로 병원균 정량 및 계산 과정의 경우, 절차를 따르십시오. 접시와 별도로 H 2 O와 MAMP 전처리 샘플을 계산합니다. 야생형 애기는 병원균 성장 1-2 log 감소는 다소 강한 더불어 MAMP 예비 처리 된 식물에서 예상flg22 의해 매개 ER 감소 elf18에 비해. </li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

인구 available 농지 감소와 증가함에 따라, 전 세계의 연구자들은 작물 개선을위한 긴급한 필요로하는 과제를 안고 있습니다. 수율은 매우 다양한 생물학적 및 비 생물 적 스트레스에 의해 영향을받을 수있다. 그 중에서도, 병원체 감염 단독 45 US에서 약 12 %의 손실에 대해 책임 작물 수확량 감소의 주요 원인 중 하나이다. 이 문제를 해결하려면, 대규모 연구는 모델 애기 장대에서 진행되고?...

때문에 자신의 고착 자연, 식물은 지속적으로 다양한 라이프 스타일과 영양 전략 1을 나타내는 병원균의 과다에 의해 위협을 받고있다. necrotrophic 병원균 적극적으로 비밀 독소와 효소가 호스트 조직을 죽이고 죽은 세포 (1)에 공급하는 동안 첫 번째 근사, biotrophic 병원균, 영양분을 검색 할 수 살아 자신의 호스트를 유지한다. 병원균이라고 hemibiotrophs의 또 다른 그룹은 병원체의 축적 (2) 특정 임계 값에 도달시 necrotrophic 단계에 biotrophic 무대와 변화와의 감염 과정을 시작합니다. 효과적으로 이들 미생물로부터 자신을 방어하기 위해, 식물 병원체 공격을 검출 및 트리거하도록 여러 감시기구를 구비 한 복잡한 선천 면역을 진화 세포사 3뿐만 아니라 전신 획득 저항성 (SAR)을 4 프로그램 지역화. 현재의 연구는 필수 SIG의 특성에 초점을 맞추고naling 구성 요소와 식물 면역 체계 (5) 내에서 교차 회담. &quot;지그재그&quot;모델 5에 제시된 바와 같이, 식물 선천성 면역 반응의 제 1 층은 미생물의 침입을 검출하는 세포막 지역화 패턴 인식 수용체 (PRRS)의 존재를 필요로한다. PRRS는 미생물 - 관련 분자 패턴 (MAMPs)를 인식하고 MAMP 트리거 면역 (MTI) 6을 설정할 수 있습니다. 항균 PR 단백질 7을 코딩하는 유전자의 전사 상향 조절을 유도 외에, MTI는 세포벽에 활성 산소 종의 생산 (ROS) 반응성 질소 종 (RNS) callose 증착 포함 병원균의 성장을 저지 다양한 이벤트에 이르게 뿐만 아니라 여러 키나제 시그널링의 활성화 경로로 8. 지금까지 여러 MAMPs 세균 flg22 9 포함, 애기 장대에서 MTI을 트리거 확인 된 </sup&gt; (편모로부터 유도 된 22 아미노산 단편)과 구조적 세포벽 성분 elf18 10 (박테리아 번역 연장 인자 화 18 아미노산) 11 펩티. 성공적인 감염을 확립하기 위해 어떤 특별한 병원체가 세포 내 또는 세포 내 공간으로 비밀 독성 이펙터 단백질하는 능력을 진화, 결과적 MTI을 억제하고 이펙터 트리거 감수성 (ETS) (12, 13)를 실행 하였다. 예를 들어, 독성 이펙터가 감염된 조직 내의 14-16 질병 발달을 유도하는 MTI의 유사 분열 촉진 인자 - 활성화 단백질 키나제 (MAPK) 케스케이드 인산화를 비활성화 할 수있다. 호스트 및 병원체의 동적 공진화 동안 식물도 이펙터 단백질을 인식하고 병원체 병원성 17 분자 감쇠 역습 전략을 개발했다. 이 직간접 효과기 인식은 질병 저항 (R) 단백질 (18)에 의해 매개된다. T의 대부분밑단은 NB-LRR의 구성원 (염기 바인딩과 류신이 풍부한 반복) 가족 (19)이다. R 단백질에 의해 avirulent 이펙터의 인식은 이펙터 트리거 면역 (ETI) (20) 특징 강력하고 광범위한 면역 반응을 유도한다. 방위 유전자 21의 발현과 방위의 대사 (22)의 생산을 유도하는 것 외에도, ETI는 종종 인접 조직 (3) 내로 확산되는 병원균을 제한 과민 반응 (HR)라고도 급속한 국부 프로그래밍 된 세포 사멸을 이끈다. 프로그램 된 세포 사멸 국부 (23)에 더하여, 플랜트 (SAR) 4 전신 후천성 내성이라 장기 및 시스템 전체에 대한 면역 반응을 개시 할 수있다. biotrophic 병원체 공격시에, 식물 세포는 지방 조직과 조직 (24) 모두에서 내인성 phytohormone 살리실산 (SA)와 PR 단백질의 생합성과 축적을 발생시킨다. T를 통해그 공정은, 준비의 높아진 상태 병원균 (24)의 넓은 스펙트럼에 의해 후속 감염 동안 빠른 응답을 수비 장착 가능 비감염 나뭇잎에 달성된다. SA와 같은 합성 유사체 벤조 (1,2,3) 티아 디아 졸 -7- 카르 보 티오 S의 산 메틸 에스테르 (BTH) 및 2,6- dichloroisonicotinic 산 (INA) 살리실산 화학적으로 유도 할 수있다 (SA) 외부 응용 프로그램 24시 -Triggered 내성 (STI). 병원성 관련 유전자 1 (NPR1)의 Nonexpressor 로컬 전신 조직 21,25,26 모두 SA 매개 방어 반응 동안 중요한 전사 조절로서 SA 수용체 및 기능 중 하나가 될 것으로 제안된다. 그것은 결정적 NPR1은 SAR 확립에 필요하며 NPR1의 손실 슈도모나스 syringae 25 향해 극적인 감수성에 이르게하는 것이 입증되었다. 광범위 식물의 분자량 기여를 특성화식물 병원체 상호 작용 구성 요소들은 여러 생물 검정은 ROS 27 버스트를 포함한 특정 방위를 측정하는 이벤트들은 단백질 제품 (21)의 증착 callose 28 방어 유전자 발현 및 축적이 개발되어왔다. 이러한 개별 분석은 식물 면역 반응의 특정 형태에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 그들 중 누구도하지만, 전체 공장의 수준에서 완전한 방어 반응을 나타낼 수 없습니다. 반대로, 감염 후 병원균 성장의 정량화는 유기체 수준에서 면역 반응의 전반적인 평가를 제공합니다. 따라서, 정확하고 높은 표준화 병원균 접종 분석법의 개발 및 최적화는 애기 면역 반응에 대한 연구 및 발견을 연료로 중요하다. 슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae), 그람 음성 세균, Arabidops 포함한 공장 호스트의 범위에서 질병을 일으킬 수있는 것으로 확인되었다 phytopathogen(29)이다. 피 - 모델 식물 병원균 시스템, 애기 장대로 syringae 상호 널리 분자 메커니즘을 기초 식물 방어 반응 (29)을 이해하기 위해 적용되어왔다. 지금까지 50여 P. syringae의 pathovars는 다른 종의 식물 (30)을 감염시킬 능력을 근거로 확인되었다 . P. syringae 태양 광 발전. 토마토 DC3000 (PST DC3000) (31)와 P. syringae 태양 광 발전. maculicola ES4326 (PSM ES4326) (32)는 두 개의 가장 널리 사용되는 광범위 특징 병원성 균주이다. 이외에도 식물에 의해 인식 및 MTI 응답을 트리거링되는 태평양 표준시 DC3000와 PSM ES4326은 MTI을 억제하고 병원균의 성장을 유리하게 31, 33 ETS를 트리거 이펙터 병원성 단백질을 분비 할 수있다. 기능적으로 애기 장대와 경찰 사이의 상호 작용을 해부하다 syringae, 여러0; 병원체 감염 방법은 병원체 전달 방식에 기초하여 개발되었다. 토양 재배 식물, 병원균은 주사기 침투, 진공 침투, 딥 접종 및 분무 접종 29,34에 의해 전달 될 ​​수있다. 최근 모 홍수 접종 분석이 조직 문화에 대형 스크린을 수행하기 위해 개발 된 젊은 애기 장대 식물 (35) 플레이트 성장. 주사기 침투는, 가장 일반적으로 사용되는 방법 중 하나로서, 기공 (29)를 수동으로 불리는 천연 잎의 틈 사이로 apoplast으로 병원체를 제공한다. 경찰의 이러한 접근 방식을 통해, 동일한 양 syringae 감염된 잎 침투 할 수 있고, 식물 면역 반응의 강도는 반비례 병원균 성장 수준으로 상관된다. 따라서, 병원균의 성장의 정량화는 전체 공장 수준에서 면역 기능을 평가하기위한 최적의 방법 역할을합니다. 또한, 주사​​기의 침윤이 로컬 및 전신 조직을 구별 할 수있는 ㄴ 수SAR (36)의 기초가되는 분자 메커니즘의 특성에 해당하는 전자. 다음 프로토콜에서, 우리는 강화 된 질병 감수성 (EDS)에 대한 애기 장대 돌연변이 체를 선별 PSM ES4326에 최적화 된 주사기 침투 분석에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 두 애기 유전자형을 사용합니다 야생형 생태형 컬럼비아 - 0 (골-0) 식물 (제어) 및 npr1-1 기능 상실 돌연변이를 (hypersusceptible) 즉 병원성 균주 PSM ES4326 (37)에 감염됩니다. The npr1-1 돌연변이 티로신에 고도로 보존 된 히스티딘을 변경하고 25 비 기능 단백질을 렌더링하는 NPR1 분자의 ankyrin 반복 합의 시퀀스 내에서 점 돌연변이를 전달합니다. 또한, 주사​​기 침윤 분석의 변형의 수는 MTI 및 STI를 포함한 면역 반응의 특정 층에서의 결함의 정량화를 허용하는지 설명된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MetroMix 360&#160;</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>SNGMM360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large pots</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>TEKUVCC10TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12x6 Inserts</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>LM1206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11x21 Flats with no holes</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>LM1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11x21 Flats with holes</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>LM1020H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl propagation domes</td>
			<td>Grosouth</td>
			<td>CW-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose Peptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0122-17-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate&#160;</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>151946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A360-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin sulfate</td>
			<td>Bio Basic Inc</td>
			<td>SB0494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x15mm Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150x15mm Petri dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R80150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-450&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 Hexahydrate</td>
			<td>Bio Basic Inc</td>
			<td>MB0328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Bio Basic Inc</td>
			<td>GB0232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#160;</td>
			<td>Bio Basic Inc</td>
			<td>MN1988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9992493&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding tubes&#160;</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>B1257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caps for grinding tubes</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>B1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grinding ball</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-556-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Salicylate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>s3007-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA)</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>Made to order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td>
			<td>Genescript</td>
			<td>Made to order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hole puncher</td>
			<td>Staples</td>
			<td>146308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biophotometer plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>952000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerGen High-Throughput Homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accu spin micro centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette (10-100 &#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3122 000.043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette (30-300&#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3122 000.060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette (20&#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120 000.038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3552-HR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharpie permanent marker</td>
			<td>Staples</td>
			<td>507130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-890</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the arabidopsis thaliana-pseudomonas syringae pathosystem

전문 모바일 면역 세포의 부재에서, 식물은 현지화 프로그램 된 세포의 죽음과 전신 획득 저항성이 병원균의 공격으로부터 자신을 방어하기 위해 사용한다. 전체 식물 면역 반응 애기 특정 유전자의 기여는 구체적 정량적으로 감염된 조직 내의 병원균의 성장을 분석하여 평가할 수있다. 지난 3 년 동안의 hemibiotrophic 세균은 슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae) 태양 광 발전. maculicola ES4326 (PSM의 ES4326)는 널리 애기 면역 반응의 기초가되는 분자 메커니즘을 조사하기 모델 병원체로 적용되었습니다. 잎 조직으로 병원균을 제공하는, 다중 접종 방법이 확립되어, 예를 들면, 주사기 침윤 접종 딥, 스프레이, 진공 침윤, 홍수 접종. 다음 프로토콜은 성인의 잎으로 병원성 PSM ES4326를 전달하도록 최적화 된 주사기 침투 방법을 설명하는데애기 장대 식물을 토양에서 재배하고 정확하게이 병원균으로 강화 된 질병 감수성 (EDS)을 선별. 또한,이 프로토콜은 상기 살리실산 (SA) -Triggered 내성 (STI)와 MAMP 트리거 내성 (MTI)를 포함한 식물 방어 다른 층 내의 특정 결함 면역 해부 여러 전처리를 보충 할 수있다.

우리가 여기서 설명하는 프로토콜 최적화 (P)를 나타냅니다 syringae 주사기 침투 분석은 정량적으로 애기 장대 식물의 면역 반응을 알아보고자 하였다. 도 1에 도시 된 바와 같이, PSM ES4326 주사기의 침윤은 연속 희석 콜로니 열거 통해 병원균 추출 및 정량 따른다. 프로토콜 텍스트 내에서 3 단계에서 설명 된 바와 같이, ES4326 PSM에 ?...

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Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem | Immunology and Infection | Video

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

을 사용해서 식물 방어 응답의 미세 특성에 대한 세균성 잎 침투 분석<em&gt; 애기 장대-슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae)</em&gt; Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

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Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

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21.5K 조회수.  University of Alabama at Birmingham. Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

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Assay for Pathogen-Associated Molecular Pattern (PAMP)-Triggered Immunity (PTI) in Plants

To perceive potential pathogens in their environment, plants use pattern recognition receptors (PRRs) present on their plasma membranes. PRRs recognize conserved microbial features called pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) and this detection leads to PAMP-triggered immunity (PTI), which effectively prevents colonization of plant tissues by non-pathogens1,2. The most well studied system in PTI is the FLS2-dependent pathway3. FLS2 recognizes the PAMP flg22 that is a component of bacterial flagellin. 
Successful pathogens possess virulence factors or effectors that can suppress PTI and allow the pathogen to cause disease1. Some plants in turn possess resistance genes that detect effectors or their activity, which leads to effector-triggered immunity (ETI)2.
We describe a cell death-based assay for PTI modified from Oh and Collmer4. The assay was standardized in N. benthamiana, which is being used increasingly as a model system for the study of plant-pathogen interactions5. PTI is induced by infiltration of a non-pathogenic bacterial strain into leaves. Seven hours later, a bacterial strain that either causes disease or which activates ETI is infiltrated into an area overlapping the original infiltration zone. PTI induced by the first infiltration is able to delay or prevent the appearance of cell death due to the second challenge infiltration. Conversely, the appearance of cell death in the overlapping area of inoculation indicates a breakdown of PTI. 
Four different combinations of inducers of PTI and challenge inoculations were standardized (Table 1). The assay was tested on non-silenced N. benthamiana plants that served as the control and plants silenced for FLS2 that were predicted to be compromised in their ability to develop PTI.

Assay for Pathogen-Associated Molecular Pattern PAMP-Triggered Immunity PTI in Plants

A cell death-based assay for PTI in Nicotiana benthamiana plants is described.

병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMP) 트리거된 식물의 내성 (PTI)에 대한 분석

To perceive potential pathogens in their environment, plants use pattern recognition receptors (PRRs) present on their plasma membranes. PRRs recognize ...

연구

면역학 및 감염병학

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

전체 리프 이미징을 사용하여 박테리아 세포를 라이브 Stomatal 응답을 평가

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

전자 레인지 전송 전자 현미경으로 식물 바이러스 질병의 신속한 진단을 도와

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

감염된 마우스에 세균 하중과 면역 응답 측정 리스테리아 monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

라이브 세포 형광 현미경을 사용하여 박테리아 독소 유도 응답의 시각화

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of innate immunity are conserved between insects and mammals, and since Drosophila can readily be genetically and experimentally manipulated, they are powerful for studying immune system function and the physiological consequences of disease. The procedure demonstrated here allows infection of flies by introduction of bacteria directly into the body cavity, bypassing epithelial barriers and more passive forms of defense and allowing focus on systemic infection. The procedure includes protocols for the measuring rates of host mortality, systemic pathogen load, and degree of induction of the host immune system. This infection procedure is inexpensive, robust and quantitatively repeatable, and can be used in studies of functional genetics, evolutionary life history, and physiology.

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster is an outstanding model organism for studying innate immune systems and the physiological consequences of infection and disease. This protocol describes how to deliver robust and quantitatively repeatable bacterial infections to D. melanogaster, and how to subsequently measure infection severity and quantify the host immune response.

전신 세균 감염 및 면역 방어 표현형에<em&gt; 초파리 melanogaster의</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

소에 이펙터 및 메모리 T 세포 반응을 평가하기위한 장기 배양 인터페론-γ 효소 링크 된 Immunospot 분석의 응용 프로그램

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

Thymus 종속 및 독립 Thymus 면역 글로불린 Isotype 반응 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 사용 하 여 마우스의 특성

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

셀룰러 및 Organismic 수준 호스트 응답 세균성 병원 체 프로브를 사용 하 여

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic 살해 분석 결과 세균성 병원 체에 대 한 면역학 응답을 평가 하

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...