이 높은 처리량 프로토콜은 야생 접근에서 세균성 병원체 슈도모나스 시링가에 토마토 묘목을 신속하게 선별할 수 있게 합니다. 모종 홍수 분석법은 식물 의 성장 시간과 성장 챔버 요구를 최소화하고 식물의 빠른 회전율을 허용하며 큰 샘플 크기를 테스트 할 수 있습니다. 이 분석은 야생 접근 및 복잡한 유전 적 배경을 가진 다른 라인에서 저항을 선별하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다.
이 프로토콜은 두 개의 슈도모나스 주사기 균주의 홍수 접종에 대한 구체적인 방향을 제공합니다. 그러나, 그것은 다재다능하고 다른 세균성 병원체에 호스트 저항을 검출하기 위하여 수정될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 연구 전문가 인 야나 하산 (Yana Hasan)이 될 것입니다.
토마토 묘목을 성장시켜 시작하십시오. 토마토 씨앗을 2.2 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에 넣고 50 % 표백제 용액의 2 밀리리터를 추가하십시오. 튜브를 25분 간 흔들어 서 파이펫으로 표백제 용액을 제거합니다.
초순수 2밀리리터를 넣고 튜브를 5번 반전시켜 씨앗을 씻습니다. 튜브에서 액체를 흡입하고 4 번 더 씻어 내십시오. 마지막 세척 후, 초순수 한양의 밀리리터 2개를 넣고 씨앗을 멸균 페트리 접시에 붓습니다.
에탄올에서 그들을 불타는 하여 집게를 살균한 다음 0.5 XMS 플러스 0.8 %의 천가 매체와 100 x 25 밀리리터 플레이트에 5 ~7 개의 씨앗을 전송하는 데 사용합니다. 수술 용 테이프로 접시의 가장자리를 밀봉하십시오. 플레이트가 평평하게 쌓여 있고 얼굴을 위로 향하게 합니다.
발아를 동기화하기 위해 적어도 3 일 동안 어둠 속에서 섭씨 4도에서 멸균 된 씨앗을 계층화하십시오. 3 일 후, 수직으로 뿌리가 접시의 표면을 따라 아래로 성장하고 씨앗의 라인이 수평으로 지향되도록 기울어진다. 씨앗을 섭씨 22도로 설정하고 16시간 의 빛, 8시간 암울한 주기로 옮기세요.
챔버에서 10 일 동안 묘목을 성장, 어느 시점에서 그들은 일반적으로 완전히 등장 하고 확장 된 cotyledons 및 신흥 첫 번째 진정한 잎을 표시합니다. 평평한 멸균 이쑤시개를 사용하여 적절한 KB 한고에 신선한 박테리아를 줄입니다. PstT1의 경우, 홍수 실험에서 박테리아를 사용하기 전에 48시간 동안 섭씨 28도에서 플레이트를 배양한다.
접종을 준비하기 위해, 무균으로 박테리아를 무균으로, 10 밀리머 마그네슘염화는 0.1의 광학 밀도로 재보종한다. 그런 다음 0075의 OD600을 사용하여 작업 농도를 얻기 위해 두 개의 직렬 희석을 합니다. 또한 10 밀리알 마그네슘 염화 마그네슘에 비이온 유기 실리콘 계면활성제 중합체의 1~10희석을 준비한다.
그것을 소용돌이와 혼합 튜브를 소용돌이, 박테리아에 추가. 성장 챔버에서 생물 안전 캐비닛에 10 일 된 묘목으로 접시를 전송하고 수술 테이프를 제거합니다. 그런 다음 각 플레이트에 6 밀리리터의 접종을 옮김합니다.
피펫 끝으로 모종을 무접종으로 부드럽게 밀어 넣고 3분간 타이머를 시작합니다. 각 손에 한 접시를 잡고 접시 의 전면을 기울여 모종의 코틸레톤과 잎을 잠급합니다. 접종을 5~7번 나란히 휘저은 다음 플레이트를 다시 팁하여 뿌리를 부추기는 무분비로 덮습니다.
접시를 다시 기울여 총 3분 동안 주기를 반복합니다. 플레이트에서 접종을 붓고 평평한 표면에 내려 놓고 잔류 접종을 두 번째로 부어 냅니다. 판을 다시 감싸고 성장 챔버에 다시 놓습니다.
머니메이커-프토르와 머니메이커-PtoS 품종은 PSTDC3000으로 넘쳐났고 홍수 후 7~10일 후에 표현되었습니다. 머니메이커-PtoR 모종은 PtoPRF 유전자 클러스터를 운반하고 PSTDC3000에 저항했다. PSTDC3000 이펙터 AVRPto 또는 AVRPto-B를 인식할 수 없는 거의 동종 머니메이커-PtoS 묘목이 홍수 후 7일 이내에 빠르게 사망했다.
10일 된 묘목은 PstT1로 넘쳐났고 홍수 후 적어도 10일 후에 표현되었다. 취약한 접근은 죽었고, 갈색 의기질의 메리줄기를 가지고 있으며, 새로운 성장이 부족했습니다. 대조적으로, 저항하는 모종은 새로운 녹색 성장의 높은 수준을 표시하고 PstT1로 감염을 살아남았다.
세균성장 분석법은 PstT1 저항성 및 솔라눔 네오리치 LA1329를 정량적으로 확인하기 위해 수행되었다. 저항성과 취약한 LA1329 사이의 세균 성장에 1.7 로그 차이가 있었고, 내성 LA1329와 머니메이커-PtoS 사이의 1.6 로그 차이가 있었는데, 이는 현상결과와 상관관계가 있었다. 이 분석법을 수행 할 때, 기억해야 할 가장 중요한 것은 프로토콜 전반에 걸쳐 무균 기술에주의를 기울이고 접시의 모든 묘목이 철저히 침수되도록하는 것입니다.
감염된 식물 조직과 박테리아를 자동화하고 적절한 규정에 따라 물질을 폐기하십시오.
