우리는 박사 Arieh Shalhav에 의해 주도 비뇨기과 시카고 섹션의 대학 및 Urologic의 연구 박사 캐리 스케이트 타는 사람 - 쉐퍼가 상대역과 베드신의 이사의 지원을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 박사 미셸 르 보에 의해 주도 시카고 종합 암 센터 (UCCCC) 대학의 지원을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 박사 마크 린겐에 의해 주도 인체 조직 자원 센터의 핵심 시설, 레슬리 마틴과 메리 조 Fekete의 도움으로 전문적인 기술 지원을 감사하는 데. 우리는 또한 테리 리에서 운영하는 면역 핵심 시설을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 외과 시카고 교실, 비뇨기과 섹션의 대학에 의해 투자되었다; 미국 암 협회 (American Cancer Society) 기관 연구비 (ACS-IRG, # IRG-58-004), 암 센터 지원 그랜트 (P30 CA14599) Brinson 재단 앨빈 바움 가족 기금, 시카고 암 연구 재단 여성위원회의 대학, S. Kregel이 HHMI에 의해 지원됩니다 : 메드 -에 - 졸업생 휄로우엉덩이 (56006772)와 암 생물학 교육 그랜트 (T32-CA09594). 마지막으로, 우리는 원고의 비판적 평가를 위해 로버트 클라크, 박사 VenkateshKrishnan, 나단 Stadick에게 감사의 말씀을 전합니다.

이 연구는 건강의 국립 연구소의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서의 권장 사항에 따라 엄격 수행 하였다. 프로토콜은 시카고의 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 대학 (IACUC 프로토콜 번호 72066 및 72231)에 의해 승인되었다. 모든 수술은 마취하에 수행되었으며, 모든 노력은 고통을 최소화하기 위해 만들어졌다. 인간 배아 줄기 세포주 WA01 (H1, NIH 등록 # 0043)를 mTeSR1 미디어를 사용하여 장치에 독립적 인 프로토콜을 사용하여 WiCell (매디슨, WI) 배양에서 획득 된 (세포 기술을 줄기, 밴쿠버, BC). ES 세포는 해동 10 구절에서 사용되었다. 1. 마우스 또는 쥐 배아에서 비뇨 부비동의 분리 <ol><li> 5 분 동안 CO 2의 흡입에 의해 시간 초과 임신 한 쥐 (일 17.5) 또는 쥐 (일 18.5)를 안락사. 죽음 쥐의 생체 신호의 중단에 의해 확인된다. 다음 인도적의 목을 부러. R시는이 시점에서 안락사 있습니다. 복부 피부와 측면을 소독하기 위해 70 % 에탄올을 스프레이. 복부 피부와 근육 레이어를 절단하고, 자궁을 잘라 양막 낭에서 쥐의 배아를 분리하고, 탯줄을 잘라. 얼음처럼 차가운 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)를 포함하는 50 ML 팔콘 튜브에 배아를 전송하고 얼음에 보관하십시오. 태아 수술 가위로 잘린 안락사 있습니다. </li><li> 100mm 페트리 접시에 배아를 놓습니다. 배꼽 (그림 1A)의 수준에서 가위로 배아를 양분. 위장과 소장을 제거합니다. 남성 배아 (그림 1B 및 1C)에서 여성의 배아와 고환의 난소를 알 수있다. (난소 신장의 꼬리 극에 있습니다. 고환은 약 방광의 수준이다). 이 발달 단계에서 UGSM는 남성과 여성 모두 배아 호스트의 면전에서 전립선 상피 혈통을 유도 할 수있다으로부터 격리남성 호르몬 인 테스토스테론을 생산합니다. 4이 발달 시점 후, 그러나, 전립선 싹이 UGSM에 형성 시작하고 순수한 UGSM의 분리는 매우 도전 4. </li><li> 해부 현미경, 방광과 복부의 뒤쪽 벽을 노출하는 Vannas 가위로 중간 선에있는 복벽을 잘라. 첨부 파일에서 무료로 상부 생식기는 (남성 배아, 요관, Wolffian 덕트 뮬러 덕트를 잘라, 여성 태아에서, 요관 및 뮬러 덕트를 잘라.) 탯줄에서 방광을 해제. 치골과 뒤몽 좋은 팁 집게로 비뇨 생식기 부비동의 앞쪽 벽에서 퉁명스럽게 분리를 잘라. 마지막으로, 직장에서 비뇨 생식기 부비동의 후벽을 분리합니다. 하단 (요도)에서 방광과 비뇨 생식기 부비동을 차단하고 얼음 차가운 HBSS에 비뇨 생식기 공동 욕실 블록을 (방광) 저장합니다. </li></ol> 2. 비뇨 부비동 간엽의 분리 <ol><li&gt; 해부 현미경 (그림 1D)에서 비뇨 동에서 방광을 제거합니다. </li><li> 1 %의 칼슘 트립신 (칼슘 2 +)과 마그네슘 (MG 2 +) 무료 HBSS를 포함 팔콘 튜브에 비뇨 동을 전송합니다. 75 분 동안 4 ° C에서 냉장고에 튜브를 놓습니다. </li><li> 트립신을 제거하고 DMEM/F12 배지에서 10 %의 태아 Bovin 혈청 (FBS)와 트립신을 중화. </li><li> 이것은 줄기 세포에서 파생 된 인간과 함께 형성하는 쥐의 땀샘이 발생할 수 있으며, 조심스럽게 바늘 또는 뒤몽 좋은 팁 포셉 (그대로 상피 관 간엽의 상피 세포 오염의 가능성을 줄일 수 유지와 상피 튜브에서 끈적 끈적한 중간 엽 슬리브를 애타게 선의 상피 세포) (그림 1D) 12. </li><li> DMEM/F12 배지 + 포함하는 새로운 팔콘 튜브에 UGSM을 전송 10 % FBS + 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (펜 / Strep의, 0.5 MG / ML) + 1 % 비 필수 아미노산 (NEAA)과 1NM R1881. 경기 수에이스 37 ° C에서 인큐베이터에있는 관 5 % CO 2 밤새 함께. </li><li> 200 XG에서 조직을 원심 분리하고 상층 액을 버린다. 인산 버퍼 식염수 (PBS) (조직 펠렛을 방해하지 않습니다)로 씻으십시오. </li><li> 다시 일시 중지합니다 조직에 0.2 % 콜라게나을 (DMEM/F12)에 추가합니다. 1 시간 동안 부드럽게 흔들 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 적극적으로 소용돌이 소화 조직을 세 번이 균일 한 단일 셀 혼합되고 DMEM/F12 배지 + 추가 할 때까지 10 % FBS + 1 % P / S + 1 % NEAA + 콜라게나 제를 중화하는 1NM R1881. </li><li> 200 XG에 원심 분리기 후 HBSS에 UGSM 세포를 다시 중단으로 세척, 완전히 UGSM을 씻어 세 번 반복합니다. 마지막으로 DMEM/F12에서 중간 엽 세포를 중지하고 혈구 또는 셀 카운팅 장치를 사용하여 셀을 계산합니다. </li><li> Accutase 소화 (, 빌리 카, 매사추세츠 밀리 포아)를 사용하여, HES 세포에게 mTeSR1 미디어 (밴쿠버, BC 줄기 세포 기술)와 함께 배양하여 급지없는 프로토콜을 떼어 놓다. HES 세포를 씻으십시오따뜻한 DMEM/F12 미디어 그들의 성장의 로그 단계에서 다음 따뜻한 1X Accutase 솔루션을 추가하고, 하나의 세포가 식민지에서 균일하게 해리 될 때까지 15 ~ 20 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. Accutase을 중화하고 부드럽게 피펫 아래 세포 덩어리를 혼합하고 분쇄​​하기 위하여는, 1X 정의 트립신 억제제 (그랜드 아일랜드, NY Invitrogen 사)의 동일한 금액을 추가합니다. 원심 분리 관 3 200 XG에 분 및 DMEM/F12 미디어 다시 일시 중지 세포 펠렛을위한 원심 분리기 피펫 세포. 200 다시 XG에서 3 분 튜브를 원심 분리하고 상층 액을 제거한 다음 원하는 볼륨 차가운 HBSS이나 DMEM/F12에 다시 일시 중지합니다. </li><li> HES / 중간 엽 세포의 1:2.5 비율로 HES 세포를 추가합니다. 3이 10 ㎖ 주입 당 4E 4 hESCs는 (하나의 쥐 2E 6 중간 엽 세포에 대한 일반적으로 수율을 UGS)와 1E 5 UGSM 세포의 세포 구성 될 것입니다. 5 분 200 XG에 원심 한 후 상층 액을 버린다. 75 % 마트 리젤 (BD Biosciences의로 다시 일시 중지합니다,산호세, 캘리포니아, 쉬운 취급을위한 25 %의 차가운 HBSS와 혼합)와 하위 신장 캡슐 주입 얼음에 튜브를 놓습니다. </li></ol> 3. 신장 캡슐 밑에 재조합 조직의 이식 <ol><li> 무균 수술 영역을 준비합니다. </li><li> xylazine / 케타민 IP와 남성 athymic 누드 마우스를 마취, 마취제의 1시 1분 8초 비율을 포함하는 신선한 혼합 사용 xylazine : 생리 식염수를. 투약은 100 ㎎ / kg 케타민을 및 2.5 ㎎ / kg Xylazine 될 것입니다. 발가락 핀치에 응답 동물은 완전히 20-30 분 미만이어야합니다. </li><li> 수술 베타 딘 용액 다음 70 % 알코올의 세 가지 교류 잎사귀와 클렌징 외과 드레이프를 적용, 수술 사이트 (누드 마우스를 사용하지 않는 경우) 면도 마우스를 준비합니다. </li><li> 마취 동안 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 눈 습기 연고를 (Altalube 눈 연고) 넣습니다. </li><li> 수술하는 동안, 생쥐의 호흡 속도와 체온이 모니터링됩니다. 호흡률 소ULD 꾸준한 40-90 심호흡 / 분 내로 유지해야합니다. 체온은 점막의 색상과 다리의 핑크 발바닥의 관찰과 모니터링됩니다. </li><li> 뒷면에 1.0 cm 긴 길이의 피부 절개를합니다. 0.5 cm 세로 절개의 복벽을 삭감하는 것을 계속한다. </li><li> 조심스럽게 복부에서 신장을 짜 멸균 생리 식염수 방울을 사용하여 신장 표면의 수분을 유지합니다. </li><li> 조심스럽게 구멍 빈 27 게이지 주사 바늘을 사용하여 신장 캡슐. 매우 얕은 구멍은 충분합니다. 당신의 세포 혼합물을 주입하기 위해 무딘 바늘을 삽입하는 곳이 될 것입니다. </li><li> 휴대 혼합물의 10 μL와 28 게이지 무딘 주사기 바늘을 입력합니다. 천천히 구멍 사이트를 삽입하고 신장 캡슐 아래 영역에 도달하기 위해 신장 실질을 관통. 신장 캡슐 아래 신장에 알약을 형성하는 세포 혼합물 10 μl를 주입한다. 철수 바늘을. </li><li> ABDO에 신장을 반환VIDEO 케이블 구멍. 4-0 나일론 봉합사와 복막의 근육 층을 확보하고 있습니다. </li><li> 봉합 또는 스테이플 하나와 함께 피부를 닫습니다. </li><li> 멸균 생리 식염수를 사용하여 피부의 혈액을 청소합니다. </li></ol> 4. 수술 후 진통제 및 모니터링 <ol><li> 수술 후 통증, 및 37의 1 ML 동물을 온난 한 유지하기 위하여 ° C 염분 IP를 관리하는 부 프레 노르 핀 (0.1 ㎎ / ㎏ 매 12 시간) 또는 케토 프로 펜 (생리 식염수 매 12 시간에서 3-5 ㎎ / ㎏)와 함께 동물을 주사 탈수를 방지합니다. </li><li> 깨끗한 새장에 동물을 넣고 약한 가열 패드에 놓습니다. </li><li> 그들은 의식을 되찾고 케이지 내에서 이동되면 동물 방으로 동물을 보낼 수 있습니다. </li><li> 다음과 같은 세 가지 일 질병 및 감염의 예상치 못한 징후를 매일 동물을 관찰합니다. 마우스 접근과 음식과 물을 후 수술 일일 포함 새장에있는 활동의 관찰과 모니터링됩니다. 마우스가 적은 활동을 표시하는 경우, 케토 프로 펜은 복강 광고입니다하루에 한 번 다시 사역. </li><li> 피부 스테이플 또는 봉합 이주 수술 후 제거합니다. </li><li> 이종 조직은 팔주 수술 후 빨리 수확 할 수 있습니다. 이종 이식은 작은 동물 초음파 (그림 2A) 및 고정 된 조직은 단면과 면역 (그림 3)를 사용하여 다양한 단백질에 대한 염색 할 수를 사용하여 생체 내 이미징 할 수 있습니다. </li></ol>

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저자는 작품 발표와 이익에 대한 갈등이 없습니다.

UGSM를 사용하여 조직 재조합 전립선의 개발과 전립선 암의 개시에 이르는 분자 사건을 조사하기 위해 매우 유용한 기술입니다. UGSM의 유도 가능성은 전립선 연구에 많은 응용 프로그램에 사용되어왔다, 이러한 강화 종양 기질 - 상피 상호 작용을 공부하고, 종간 전립선 재조합을 형성, 전립선 세포 라인과 종양 걸릴 포함 UGSM의 7,17-20 적절한 준비. 그러나, 설치류 상피 세포를 오염하는 선?...

전립선 암의 더 나은 인간의 모델 시스템에 대한 엄청난 필요가있다. 특히, 유전자 직접 전립선 암의 개시에 특정 유전자의 역할을 식별하는 조작 할 수있는 일반적인, 비 악성 전립선 조직의 관련 인간의 모델 시스템은 매우 유익한 것입니다. 게놈 시대의 도래는 암 형성에 역할을 할 수 많은 유전자를 발견했다. 실험 인간의 모델 시스템의 부족은, 그러나, 심각한 기능적 테스트 후보 전립선 암 감수성 유전자를 특성화하는 능력을 손상. 이상적인 모델 시스템은 적절한 형질 전환 설치류 모델 시스템과 함께 암 감수성 유전자의 신속하고 더 빠른 기능 분석을 용이하게한다. 또한, 이러한 인간의 모델 시스템에 대한 새로운 치료법의 발견 및 검증을 향해 발암 전립선의 신호 메커니즘을 분자 특성을 가능하게 할전립선 암의 형성을 방지합니다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs에) 이종 이식으로 인간의 전립선 조직을 형성 할 수있다. 2006 년 테일러 등은. hESCs는이 8-12주의 기간 내에 설치류 비뇨 동 간엽 (UGSM)와 다시 결합 될 때 생체 내에서 전립선 상피 세포를 형성하도록 유도 될 수 있음을보고 하였다. 1이 연구에 의해 이전 작업을 기반으로 한 그 쥐 배아 UGSM을 보여주는 쿤하의 연구소는 2,3 전립선은 비뇨 생식기 동 (UGS)라고 배아 ANLAGEN에서 개발하고 있습니다. 줄기 세포 및 생체 내에서 배아 상피 세포 인구의 전립선 분화를 촉진하고, 이전의 배아 일 17 (마우스 E17 수 있습니다 , 쥐의 하루 E18) UGS를 제거하고 물리적으로 분할 상피 세포 (UGSE)에와 간엽 (UGSM 4)이 조직 재조합 방식은 크게 전립선 개발 및 발암, 특히 우리의 이해를 강화했다 할 수 있습니다.LY 성장 인자와 호르몬 신호 전달 경로와 전립선 기질과 상피 세포 사이의 분자 관계. 5-8이 방법은 줄기 동일하거나 서로 다른 종에서 상피 세포와 UGSM의 생체 조합을 포함하고 이러한 세포 / 조직 재조합는 이식 재배 마우스 호스트에서 이종 이식. 4.9은 생체 내 성장의 기간 후에, 이식 각막 조직에 포함 된 전립선 상피 선의 구조를 포함하고 있습니다. 또한 염색 같은 구조 진정 전립선과 인간의 기원 여부를 확인하기 위해 실시 할 수있다. 10,11

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>14170</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMEM/F12</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>11330</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>R1881</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>965-93-5</td>
 <td>Mix to 1 ug/ml in Ethanol (1,000x stock)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NEAA</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>11140</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pen-Strep Solution</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>15070</td>
 <td>100x stock</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Matrigel</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>354230</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KETASET (ketamine hydrochloride) </td>
 <td>Fort Dodge Animal Health</td>
 <td>NDC 0856-2013-01</td>
 <td>100 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>AnaSed (xylazine) </td>
 <td>VET-A-MIX, Inc.</td>
 <td>NADA 139-236</td>
 <td>20 mg/ml; dilute 1:10 in sterile saline</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>215240</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase </td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C2014</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ketoprofen </td>
 <td>Fort Dodge</td>
 <td>NDC 0856-4396-01</td>
 <td>100 mg/ml; dilute 1:1,000 in sterile saline</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Altalube eye ointment </td>
 <td>Altaire Pharmaceuticals, Inc.</td>
 <td>NLC 56641-19850</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Leica MZ16 F Stereomicroscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td></td>
 <td>Any good dissecting scope can be used.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vannas spring scissors</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>15001-08</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>84855</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hamilton Needle, Small RN, 28 gauge, 0.5inches, Point Style #3 (Blunt)</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7803-02 </td>
 <td>Custom Needle </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol Prep Pads</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>06-669-62 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile Gauze Pads</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>22-415-469 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethicon Vicryl Suture (4-0 FS-2)</td>
 <td>MedVet International</td>
 <td>J392H </td>
 <td>Needle-in, dissolvable suture </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Autoclip 9 mm Wound Clips</td>
 <td>Becton Dickenson</td>
 <td>427631</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PVP Iodine Prep Pads</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>06-669-98 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissector scissor with blunt end</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>14072-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dumont fine tip forceps</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11252-50</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needle holder with Scissor</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>12002-14</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

formation of human prostate epithelium using tissue recombination of rodent urogenital sinus mesenchyme and human stem cells

전립선 암 연구의 발전에 심각한 전립선 질환의 개시를 기본 유전 및 분자 이벤트를 이해하는 우리의 능력을 제한하는 인간의 유래와 호르몬 순진 모델 시스템의 가용성에 의해 제한됩니다. 발암 인간의 전립선을 공부하고 더 나은 모델 시스템을 개발을 목표로, 우리와 다른 배아 쥐 전립선 기질의 고유 한 프로 전립선 유도 가능성의 장점을 가지고 비뇨 동 간엽 (UGSM을)라고했다. 이러한 배아 줄기 세포와 같은 특정 만능 세포 인구와 재결합 할 때, UGSM은 남성 호르몬 의존적으로 정상적인 인간의 전립선 상피의 형성을 유도합니다. 이러한 인간의 모델 시스템을 조사하고 실험적으로 일반적인 설치류 형질 전환 연구에 비해 가속 속도로 후보 전립선 암 감수성 유전자의 능력을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 인간 배아 줄기 세포 (hESCs는) 유전자의 문화저기서에서 수정 될 수 있기 때문에조직 재조합하기 전에 G의 유도 유전자 발현 또는 siRNA를 노크 다운 벡터, 같은 모델은 유전자의 기능 결과를 테스트 용이하게하거나 촉진하거나 발암 방지하기 위해 생각되는 유전자의 조합. UGSM 세포의 순수한 인구를 분리하는 기술은, 그러나, 도전과 자주 학습 이전의 전문 지식을 갖춘 사람이 개인적으로 가르 칠 수 있어야합니다. 또한, 면역 호스트의 신장 캡슐 아래 세포 혼합물의 접종은 기술적으로 도전 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 개요와 쥐의 배아와 인간의 전립선 상피 세포를 형성하는 조직 혼합물의 신장 캡슐 주입에서 UGSM의 적절한 차단을 보여줍니다. 이러한 접근 방식은 현재 단계에서 배아 줄기 세포의 xenografting 생체 내에서 필요하며 미래의 응용 프로그램은 잠재적 생체 선 형성 또는 유도 된 pluripotent 줄기 세포 인구 (유도 만능)의 사용을 포함 할 수 있습니다.

테일러, 외.에 의해 흥미로운 보고서에 건물, 우리의 실험실은 일반적으로 사용되는 H1 (NIH 지정한 WA01, 유 전적으로 남성) 인간 배아 줄기 세포주 1.이 라인은 엄격한 품질 관리를위한 시험되고 사용 engrafting 프로토콜을 개발했습니다 karyotypically 정상 13 적절하게 배양 할 때, HES 세포가 확장, 유지 및 피더 무료 문화 방법 (줄기 세포 기술을 통해 상업적으로 이용 가능한 장치?...

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Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

전립선 암의 개시, 소설과 혁신적인 인체 모델 시스템과 방법을 기본 최초의 분자 메커니즘이 절실히 필요 해명합니다. 인간의 전립선 상피 세포를 형성하는 만능 줄기 세포 인구를 유도하는 사전 전립선 비뇨 동 간엽 (UGSM)의 가능성이 전립선 연구에 강력한 실험 도구입니다.

설치류 비뇨 부비동 간엽 및 인간 줄기 세포의 조직 재조합을 사용하여 인간의 전립선 상피의 형성

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

formation-human-prostate-epithelium-using-tissue-recombination-rodent

Research

JoVE Journal

Medicine

13.6K 조회수.  University of Chicago. 전립선 암의 개시, 소설과 혁신적인 인체 모델 시스템과 방법을 기본 최초의 분자 메커니즘이 절실히 필요 해명합니다. 인간의 전립선 상피 세포를 형성하는 만능 줄기 세포 인구를 유도하는 사전 전립선 비뇨 동 간엽 (UGSM)의 가능성이 전립선 연구에 강력한 실험 도구입니다.

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Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and finding new sources for implantable cells are the focus of recent research4,5. Investigating the effectiveness of cell therapies is not an easy task and new tools are needed to investigate the mechanisms involved in the treatment process6. We designed an experimental protocol of ischemia/reperfusion in order to allow the observation of cellular connections and even subcellular mechanisms during ischemia/reperfusion injury and after stem cell transplantation and to evaluate the efficacy of cell therapy. H9c2 cardiomyoblast cells were placed onto cell culture plates7,8. Ischemia was simulated with 150 minutes in a glucose free medium with oxygen level below 0.5%. Then, normal media and oxygen levels were reintroduced to simulate reperfusion. After oxygen glucose deprivation, the damaged cells were treated with transplantation of labeled human bone marrow derived mesenchymal stem cells by adding them to the culture. Mesenchymal stem cells are preferred in clinical trials because they are easily accessible with minimal invasive surgery, easily expandable and autologous. After 24 hours of co-cultivation, cells were stained with calcein and ethidium-homodimer to differentiate between live and dead cells. This setup allowed us to investigate the intercellular connections using confocal fluorescent microscopy and to quantify the survival rate of postischemic cells by flow cytometry. Confocal microscopy showed the interactions of the two cell populations such as cell fusion and formation of intercellular nanotubes. Flow cytometry analysis revealed 3 clusters of damaged cells which can be plotted on a graph and analyzed statistically. These populations can be investigated separately and conclusions can be drawn on these data on the effectiveness of the simulated therapeutical approach.

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

We demonstrate how to set up an in vitro ischemia/reperfusion model and how to evaluate the effect of stem cell therapy on postischemic cardiac cells.

에서 간세포 이식 체외에서 시뮬레이션 국소 빈혈 / Reperfusion 모델

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

연구

의학

Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy and stem cell transplantations have become key therapeutic tools for treating blindness resulting from retinal degenerative diseases. Several forms of autologous transplantation for age-related macular degeneration (AMD), such as iris pigment epithelial cell transplantation, have generated encouraging results, and human clinical trials have begun for other forms of gene and stem cell therapies.2 These include RPE65 gene replacement therapy in patients with Leber's congenital amaurosis and an RPE cell transplantation using human embryonic stem (ES) cells in Stargardt's disease.3-4 Now that there are gene therapy vectors and stem cells available for treating patients with retinal diseases, it is important to verify these potential therapies in animal models before applying them in human studies. The mouse has become an important scientific model for testing the therapeutic efficacy of gene therapy vectors and stem cell transplantation in the eye.5-8 In this video article, we present a technique to inject gene therapy vectors or stem cells into the subretinal space of the mouse eye while minimizing damage to the surrounding tissue.

This surgical technique illustrates the injection of gene therapy vectors and stem cells into the subretinal space of the mouse eye.

마우스 눈에 유전자 치료 벡터와 줄기 세포의 Subretinal 주입

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

인간의 전립선 암 전이의 동소 쥐과 모델

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

인간의 전립선 암 샘플에서 암 줄기 세포의 분리

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

RNA 분석을위한 인간의 전립선 상피 세포의 레이저 캡처 이외에 Microdissection

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

인간의 전립선 암의 전 임상 동소 이식 쥐 모델

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

인간 간 줄기 세포를 이용한 인간형 마우스 간 세대

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. It is hypothesized that pro-atherogenic mediators released from fat tissues particularly in association with central/visceral adiposity may promote pathogenic vascular changes locally and systemically, and the notion that cardiovascular disease may be the consequence of adipose tissue dysfunction continues to evolve. Here, we describe a unique method of videomicroscopy that involves analysis of vasodilator and vasoconstrictor responses of intact small human arterioles removed from the adipose depot of living human subjects. Videomicroscopy is used to examine functional properties of isolated microvessels in response to pharmacological or physiological stimuli using a pressured system that mimics in vivo conditions. The technique is a useful approach to gain understanding of the pathophysiology and molecular mechanisms that contribute to vascular dysfunction locally within the adipose tissue milieu. Moreover, abnormalities in the adipose tissue microvasculature have also been linked with systemic diseases. We applied this technique to examine depot-specific vascular responses in obese subjects. We assessed endothelium-dependent vasodilation to both increased flow and acetylcholine in adipose arterioles (50 - 350 &#181;m internal diameter, 2 - 3 mm in length) isolated from two different adipose depots during bariatric surgery from the same individual. We demonstrated that arterioles from visceral fat exhibit impaired endothelium-dependent vasodilation compared to vessels isolated from the subcutaneous depot. The findings suggest that the visceral microenvironment is associated with vascular endothelial dysfunction which may be relevant to clinical observation linking increased visceral adiposity to systemic disease mechanisms. The videomicroscopy technique can be used to examine vascular phenotypes from different fat depots as well as compare findings across individuals with different degrees of obesity and metabolic dysfunction. The method can also be used to examine vascular responses longitudinally in response to clinical interventions.

Videomicroscopy systems are used to examine functional properties of isolated adipose tissue arterioles in response to physiological and pharmacological stimuli. This technique can be used to examine microvascular phenotypes in different adipose tissue domains in obese humans.

인간 지방 조직 Microvascular 함수 Videomicroscopy를 사용 하 여 평가

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the development of obesity-associated complications such as type 2 diabetes. To quantitatively and qualitatively investigate the immune cell subsets in human AT deposits, we have developed a flow cytometry approach. The stromal vascular fraction (SVF), containing the immune cells, is isolated from subcutaneous and visceral AT biopsies by collagenase digestion. Adipocytes are removed after centrifugation. The SVF cells are stained for multiple membrane-bound markers selected to differentiate between immune cell subsets and analyzed using flow cytometry. As a result of this approach, pro- and anti-inflammatory macrophage subsets, dendritic cells (DCs), B-cells, CD4+ and CD8+ T-cells, and NK cells can be detected and quantified. This method gives detailed information about immune cells in AT and the amount of each specific subset. Since there are numerous fluorescent antibodies available, our flow cytometry approach can be adjusted to measure various other cellular and intracellular markers of interest.

This article describes a method to analyze immune cell content of adipose tissue by isolation of immune cells from adipose tissue and subsequent analysis using flow cytometry.