The authors would like to acknowledge The Plant Cell for allowing the use of some data published in this journal to elaborate the representative results described here in Figure 4. This work was supported by the EU 7FP Marie Curie-Initial Training Network EpiTRAITS (Grant Agreement 316965), and by the Spanish Ministerio de Econom&#236;a y Competitividad (grants BIO2010-15589 and BIO2013-43098-R).

식물 재료 1. 가교 (1 시간) <ol><li> 애기 실험에 사용 된 선 성장 (- WT - 야생형 돌연변이 대를, 및 / 또는 태그를 표현하는 라인 대 관심의 단백질의 태그 버전을 표현하는 라인은 어떤 단백질에 융합되지 않음) 큰 페트리 접시에 12-18일에 대한 (150mm) MS 한천 배지 (1 L : 무라 시게 및 1X 스쿡 염, 10g의 수 크로스, 0.5 g의 MES, pH가 5.7 (KOH), 1 % 아가)와. 토양과 지렁이의 1 혼합 : 또는 3을 포함하는 화분에 식물을 재배한다. 주의! 포름 알데히드는 피부 접촉 및 삼키면, 흡입 독성, 그리고 적절한 개인 보호 장비를 착용 화학 후드에서 처리되어야합니다. 1.2 단계 - 1.6 흄 후드에서 수행되어야한다. </li><li> 실험실 버너 가열 바늘 50 ㎖ 튜브의 뚜껑에 작은 구멍을 확인합니다. 1 %의 최종 농도로 1X PBS 40 ml를 첨가하고 완충 포름 알데히드 1.08 ㎖ (스톡 37 %의olution). 그 50 ㎖ 튜브에 식물 재료의 1.5 G를 수집합니다. 가교 동안 얼음에 튜브를 유지합니다. </li><li> 뚜껑 50 ml의 튜브를 닫습니다. 데시 케이 터에 튜브를 삽입하고 진공을 적용합니다. 진공 상태를 10 분 동안 조직을 침투 용액을 휘젓는 않도록 조심스럽게 진공을 해제. 샘플을 섞는다. 두 번 반복합니다. 함침 후, 식물 재료를 관찰하고 약간 반투명하게 확인 및 튜브 (도 2)의 바닥에 가라하는 경향이있다. </li><li> 5 분 동안 진공을 적용 M. 0.125의 최종 농도를 달성하기 위해 2 M 글리신 2.5를 가하여. 글리신은 포름 알데히드 가교 결합의 경쟁 억제제 역할을합니다. </li><li> 뚜껑에 구멍이 폐쇄 된 50ml 튜브를 반전시킴으로써 PBS 알데히드 글리신 용액을 버린다. </li><li> 단계 1.5에 기재된 바와 같이 물이 세정액을 버리고 1X PBS로 두 번으로 한번 묘목을 헹군다. 종이 수건을 건조 및 액체 nitroge에 동결엔. 참고 : 냉동 조직 주 동안 -80 ° C에서 유지 될 수있다. </li></ol> 항체 2. 준비 (1 일) 참고 : 면역 들어, 단백질 G 또는 단백질 항체 중쇄의 불변 도메인에 대한 높은 선호도와 링커를 통해 항체가 결합 자석 구슬의 사용이 권장됩니다. DNA - 단백질 복합체가 비드 - 항체 복합체의 표면에 비특이적으로 부착 할 수있다. 그 때문에, 결합 비특이적 백그라운드를 정량화하는 특이 항체없이 제어를 수행 할 필요가있다. <ol><li> 각각의 면역 들어, 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 자석 구슬의 15 μl를 준비합니다. 비즈의 양은, 면역 침강과 같은 항체에 사용될 염색질의 양에 달려있다. </li><li> TU를 구슬로 염색질 면역 침전 (칩) 희석액 1 ㎖를 추가 회전에 의해 혼합하여 1.5 ml의 마이크로 원심을 배치, 세탁자기 랙에. 구슬 자석에 부착 있도록 약 1 분을 기다립니다. 랙에 여전히 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브, 피펫으로 상층 액을 제거합니다. 두 번 반복합니다. 참고 : 구슬과 항체 (AB) 및 제없이 항체 만 자기 구슬 (무 AB) 제어 한 두 가지 면역 세트가 필요한 각 공장 라인. </li><li> 칩 희석액 200 μL의 비드를 재현 탁. (정확한 희석은 각 Ab의 다릅니다 실험적으로 최적화되어야하거나, 상업 항체의 경우에, 제조업 자의 지시에 따라) 각각의 식물 라인으로 작성된 두 개의 튜브 중 하나에 특정 Ab의 필요한 양을 추가한다. 면역이 샘플을 사용하십시오. 음성 대조군으로서 사용될 다른 튜브에 비특이적 IgG의 동일한 양을 추가한다. </li><li> 항체가 구슬에 연결할 수 있도록 4 ° C에서 회전 바퀴에 O / N을 품어. </li></ol> 3. 염색질 추출 (4 시간) </p&gt; <ol><li> 분말이 균일하고 밝은 녹색이 될 때까지 박격포와 유 봉을 사용하여 철저하게 액체 질소에 냉동 식물 재료를 갈기. 새로운 50 ML 튜브에 분말을 전송합니다. </li><li> 흄 후드에서 3.6, 작업 - 단계 3.2. 추출 버퍼 (1) 30 ㎖ (E × B 형 1)를 추가하고, 조직 분말을 담가 잘 섞는다. 이 단계에서 항상 4 ° C에서 샘플을 유지. 냉동 조직과 액체 질소 먹다 남은 음식은 버퍼가 정지하게됩니다. 튜브를 4 ~ 5 번 매 2 분을 반전시켜 완전히 고정 된 조직을 해동해야합니다. </li><li> 4 ° C에서 20 분 동안 1,000 XG에서 새로운 50 ML 튜브와 원심 분리기를에 22 ~ 25 μm의 기공 크기를 갖는 여과 조직을 통해 전달하여 슬러리의 선택을 취소합니다. 주 :이 단계에서, 모든 핵 소기관 펠렛 것이다. E × B 형 (1)는 높은 밀도를 제공하고 소기관 구조의 붕괴를 방지하기에 충분한 수 크로즈를 포함한다. </li><li> 부드럽게 경사 분리하여 상층 액을 제거합니다. 이 역에서GE는, 약 2 ML의 녹색 펠렛을 관찰합니다. </li><li> E × B 형 5ml에 펠렛을 재현 탁 펠릿 2. 부유이 시점에서 어렵다. 4 ℃에서 10 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기. 참고 : E × B 형이 1 % 트리톤 X-100이 열려 엽록체 버스트와 엽록소를 제거하는 데 도움이 포함되어 있습니다. </li><li> 추출 버퍼 3 (E × B 형 3) 300 μL에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 깨끗한의 microfuge 관에서, E × B 형 3. 600 ㎕의 단계 3.6에서 재현 탁 펠렛을 가지고 신중하게 깨끗한 E × B 형 3의 상단에 레이어 추가합니다. </li><li> 4 ° C에서 16,000 XG에 1 시간 동안 스핀. 참고 :이 단계는 샘플에서 세제를 제거하는 데 도움이됩니다. </li><li> 피펫으로 흡입하여 상층 액을 제거합니다. 천천히 초음파 효율에 영향을 미칠 수있는 기포 형성을 방지하기 위해 위아래로 피펫 팅에 의해 초음파 처리 완충액 300 μL의 핵 펠렛을 재현 탁. 조심스럽게 모든 서스펜션을 피펫 깨끗한 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 전송합니다. 참고 :이버퍼는 핵을 용균과 염색질을 해제, SDS가 포함되어 있습니다. </li><li> 핵을 용균 무작위로 작은 조각으로 염색질을 전단 할 수있는 현탁액을 초음파 처리. (자료 / 시약의 표에 설명 사용할 수있는 초음파 장치에 대해 4 ° C에서 설정 30 초 ON / 30 초 OFF로 20 ~ 30 회)를 200-800 BP 사이의 조각이 풍부한 염색질을 렌더링 초음파 조건을 사용합니다. 초음파 염색질의 2 μL (그림 3)로드, 아가 로스 겔 (13)에 얻어진 DNA 단편의 전기 영동 분리에 의한 초음파의 효율성을 확인합니다. 주의! 초음파 장치가 방음 캐비닛에 포함되지 않은 경우 초음파 단계에서 귀 보호 장비를 착용해야합니다. 중요한 단계는! 염색질의 분열은 주로 초음파 장비에 따라 달라집니다. 초음파 처리 조건은 적절한 크기의 DNA 농축을 달성하도록 조정되어야한다. 만나다염색질 단편화를 최적화하는 방법의 예를 들면도 3. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 12,000 XG에 한 번 용액을 스핀. 깨끗한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 피펫으로 상층 액을 전송합니다. 펠렛을 폐기하십시오. 새로운 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 상청 1/10을 -20 ° C에서 입력 및 동결로 표시. </li><li> 0.1 %의 최종 농도 SDS를 희석 칩 희석 버퍼 염색질 10 배 희석. 참고 : 시료는 냉동 및 몇 주 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol> 관심의 단백질과 DNA의 구조 4. 면역 침전 (1 일, 3 시간) <ol><li> 단계 2.2에 기재된 바와 같이 항체의 잉여를 제거하는 칩 희석액의 1 ml의 단계에서 2.4 세 번 구간 코팅 비드를 세척 하였다. 칩 희석액 200 μL에 재현 탁. 고립 된 염색질의 50 μl를 추가합니다. 4 ° C에서 회전하는 바퀴에 O / N을 품어. 주 : concentrati 확인microvolume UV - 마주 분광 광도계에서 염색질의에. 고립 된 염색질의 50 μL은 DNA의 10 μg의를 포함해야합니다. </li><li> 4 ° C가 단계 4.2-4.5 작업. 단계 2.2에 설명 된대로 낮은 소금 세척 버퍼 1 ㎖에 두 번 구슬을 씻으십시오. </li><li> 높은 소금 세척 버퍼 1 ㎖에 한 번 구슬을 씻으십시오. </li><li> LiCl을 세척 버퍼 1 ㎖에 한 번 구슬을 씻으십시오. </li><li> TE 버퍼 1 ㎖에 두 번 구슬을 씻으십시오. 마지막 세척 후, 완전히 피펫으로 흡입하여 튜브에 남아있는 TE 버퍼를 제거해야합니다. </li><li> 입력 샘플 (단계 3.9)를 꺼냅니다. 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 전송 입력의 5 μl를하고 칩 샘플로 계속합니다. 5 %의 킬 레이팅, 이온 교환 수지의 200 μl를 첨가하여 가교 역마다 2-3 분간 진탕 95 ° C에서 10 분 동안 배양한다. 30 초 동안 16,000 XG에 스핀 다운 조심스럽게 피펫 팅하여 새로운 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송합니다. 참고 : TRA 동안반전 가교 ditional 방법 그러므로 프로토콜 일일 짧게 만드는 효율적인 decrosslinking 10 분간에 DNA 용출 허용 염화나트륨, 95 ° C에서 킬레이트 이온 수지와의 인큐베이션과 O / N 항온 처리를 포함한다. </li><li> 프로 테이나 제 K의 2 μL (10 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, 30 분간 단백질을 소화와 DNA를 분리하기 위해, 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 10 분 동안 95 ℃에서 배양하여 반응을 정지. </li><li> 빠르게 30 초 동안 16,000 XG에 스핀과 피펫 팅하여 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. </li><li> DNA는 표준 DNA 단편을 정제 키트를 사용하여 분리 청소. 참고 : 제조업체의 지침에 따라 진행합니다. </li><li> 새로운 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 키트에서 DNA 결합 열을 전송합니다. 컬럼의 중심으로의 DNase없는 물 20 μl를 첨가하고 60 초 동안 16,000 XG에서 회전시켜 DNA를 정제하여 용리. 포인트를 중지 샘플 몇 주 동안 -80 ° C에 저장 될 수있다. </li></OL&gt; 5. qPCR에 의한 면역 DNA에 결합 부위의 풍요를 측정 (4 시간) 참고 : 침전 된 염색질에서 분리 된 DNA는 인해 관심의 단백질에 결합으로, 총 염색질에서 칩 에드되었습니다하는 DNA 단편을 결정하기 위해 분석되어야한다. <ol><li> 60 ° C의 융점 (Tm)이 ​​30 % -80 %의 GC 함량을 갖는 관심 영역 게놈 디자인 프라이머. 염색질은 초음파 처리에 의해 단편화 된 바와 같이, 증폭 된 서열의 길이는 150-200 뉴클레오티드 (표 1) 이상이어야한다. 참고 : 프라이머 디자인을위한 유용한 도구가 프라이머 3 프로그램 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). 프라이머 디자인에 대한 추가 가이드 라인은 14, 15, 이전 보고서 8에서 사용할 수 있습니다. </li><li> 프라이머가 특정되어 있는지 확인하기 위해 BLAST 프로그램을 사용하여 (특히 프로모터 시퀀스 결합 비슷한 TF를 공유 할 수 있습니다) 및 프라이머 효율 날기를 테스트g 입력 DNA (단계 4.9)의 1:10 희석 물. 게놈의 특정 영역은 다른 사람보다 더 정제 될 것입니다. 이는 PCR 프라이머를 설계하고, 입력 희석 DNA 그들을 체크하는 것이 중요하다. </li><li> 각 PCR 반응 용 튜브에 피펫으로 물과 희석 DNA 5 μl를 정제 된 DNA 1:10 희석. 주 : DNA는 1.5 ml의 마이크로 원심 관의 벽에 부착 할 수로서, 필요한 양만 희석. 여러 동결 해동 사이클 부착 DNA 분자의 수를 증가시킨다. 입력의 각 프라이머 쌍, 증폭를 들어, AB-칩과 무 Ab의 칩을 분석해야한다. </li><li> PCR 믹스를 완료하기 위해, 1X의 최종 농도 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스를 추가하고, 각 프라이머의 0.5 μM. DNase의없는 물 20 μL까지 채 웁니다. </li><li> SYBR 녹색 PCR 마스터 믹스 제조업체의 지침에 따라 qPCR에 반응을 수행합니다. </li></ol> 6. 데이터 분석 참고 : 전 중칩 데이터를 분석하는 방법을 isting, 두 사람은 가장 일반적으로 사용된다. 그 중 첫 번째는 &#39;노 항체 컨트롤을 기준으로&#39; &#39;상대 농축&#39;, &#39;배경 위에 신호&#39;또는로 명명 배 농축 방법이다. 두 번째 방법은 &quot;입력 %&quot;로 지정됩니다. <ol><li> 배 농축 방식에 의한 데이터 분석. <ol><li> qPCR의 반응 후의 된 샘플의 이름과 원시 코네티컷 값으로 스프레드 시트를 작성합니다. </li><li> 각 샘플에 대해, 원시 형 Ct 값에서 대응하는 AB 급 제어 얻어진 원료 코네티컷 값을 뺀다. 참고 :이 수학 연산 한 후, 노 구간 샘플에 대한 코네티컷 값이 0과 동일합니다. </li><li> 기본 2 단계 6.1.2 (표 2)에서 얻은 부정적인 나머지 동일한 지수 (전원)와 지수의 조작에 의해 배 농축을 계산합니다. 농축 배 = 2 - (CT (샘플) - 코네티컷 (무 AB)) 참고 :이 운전 방식에서D 칩 에드 샘플에서 특정 DNA 단편의 풍부가 더-Ab의 제어에서이 조각의 풍요 로움과 비교된다. 이 방법의 가정은 배경 신호의 레벨이 다른 프라이머 세트, 샘플 및 복제 실험 간 재현성이라는 것이다. 그러나,이 &#39;noise&#39; 신호 레벨은 프라이머 세트, 샘플 및 실험 사이에서 변할 않는다. </li></ol></li><li> 입력 방법의 %의 데이터 분석. <ol><li> 샘플 이름과 qPCR에 반응 후에 얻어 된 원료 코네티컷 값으로 스프레드 시트를 작성합니다. </li><li> 입력으로 하였다 염색질의 총 추출 분획으로부터 대수베이스 (2)의 값을 감산하여 입력 샘플들에 대한 원시 형 Ct 값을 조정한다. 참고 : 전체 염색질의 10 %가이 프로토콜의 입력으로 하였다으로 감산 값이 3.32에 해당이 프로토콜에서. 로그인 2 (10) 3.32 같습니다. </li><li> B (100)와 지수 연산의 값을 승산함으로써 입력의 %를 계산ASE (2) 및 시료 (표 3)의 원료 코네티컷 값으로부터 감산 조정 된 입력 값들의 나머지와 동일한 지수 (전력). 입력의 % = 100 * 2 (조정 입력 - 코네티컷 (샘플)) 참고 :이 절차로, 총 격리 된 염색질 (입력 샘플)에 칩 에드 샘플의 특정 DNA 풍부 사이의 관계가 계산됩니다. 칩 데이터 분석에 대한 더 자세한 사항은 해링 등. 8에서 찾을 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

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M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+assay.">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> Biotechniques. 37 (6), 961-969 (2004).</li><li>Kaufmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+genes+of+the+MADS+transcription+factor+SEPALLATA3:+integration+of+developmental+and+hormonal+pathways+in+the+Arabidopsis+flower.">Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower.</a> PLoS Biol. 7 (4), e1000090 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

여기에 설명 된 칩 프로토콜은 아라비돕시스 식물의 생체 내에서 단백질과 특정 DNA 서열 사이의 상호 작용을 분석 재현성 강력한 기술이다. 관심의 단백질 결합 부위의 성공적인 식별 관련 상호 작용이 실제로 일어나고있는 식물 기관 또는 발달 단계의 적절한 선택이 필요합니다. 또, 식물 재료의 적절한 고정 및 초음파 처리에 의해 최적의 염색질의 전단을 수득하는 것이 중요하다. 선택?...

최근 몇 년 동안, 분자 적 유전자 및 게놈 툴의 다양한 모델 종 애기 장대에서 개발되어왔다. 이 기술은 식물 개발을 규제하는 방법을 이해하는 엄청난 발전을 촉진했다. 모델로 애기 장대를 이용하여 연구 개발 과정 중, 꽃이 피는 시간의 유전 적 제어가 광범위하게 분석하고있다. 이 연구는 식물은 호르몬과 식물의 나이 내생 단서에 대한 응답으로 꽃을 매우 정밀하게 시간을 조절하는 것으로 나타났습니다, 또한 시즌 1의 자연주기와 시간을 꽃 동기화 등 광주 및 온도 등의 환경 신호에, 2. 개화시기의 변화와 애기 돌연변이의 분리 및 특성 규명은 내인성 및 환경 인자에 응답하여 개화시기를 조절하는 유전자의 복잡한 네트워크를 공개에서 결정되었다. 이 유전자 회로는꽃의 스위치로서 작용 몇 마스터 유전자 수준에서 통합 및 꽃 개시의 정확한 타이밍은 개화 촉진 및 꽃 적분기 유전자 1,3 상류 작업 활동을 억압의 균형에 의존한다. 게놈 접근의 최근 사용에 의해 원조 꽃 개시의 제어에서의 역할에 대해 확인 된 유전자의 기능적 특성은, 꽃이 피는 시간의 변조에 전사 조절의 중심 역할을 계시했다. 사실, 꽃 인코딩 전사 마스터 유전자의 대부분은 4 요인. 또한, 크로 마틴 리모델링 단백질 복합체의 수는 개화 마스터 유전자의 발현에 영향을 미친다. 자신의 변경된 꽃 시간 동안 고립 된 애기 장대 돌연변이 체의 수는 염색질 수정의 다양한 암호화하는 유전자의 돌연변이를 가지고 밝혀졌다. 히스톤의 번역 후 변형을 소개 다른 염색질 remodelers전자 꼬리는 DNA에 비해 뉴 클레오의 위치를 변경하거나 애기 5,6에서 꽃의 적절한 규제 히스톤 변형에 의해 필요한 표준 히스톤을하고 있습니다 교환한다. 이 크로 마틴 리모델링 활동 중 일부는 증착 또는 특정 히스톤 잔류 물에 아세틸 또는 메틸화와 같은 공유 수정의 제거를 촉진. 이러한 히스톤 마크는 특히 꽃 유전자의 전사 활성을 조절하는 다른 크로 마틴 리모델링 복합체, 전사 인자 또는 전사 기계의 구성 요소를 모집 전문 이펙터에 의해 인식됩니다. 염색질 면역 침전 (칩)는 생체 내 DNA 결합 관심의 단백질 사이트를 (그림 1)의 확인을 할 수 있습니다. 이 절차는 DNA에 크로스 링크에 특정 화학 물질의 기능의 단백질을 이용한다. 얻어진 DNA 단백질 복합체는 다음 AGA 특정 항체를 이용하여 면역 침전 될 수있다이달 전사 인자, 염색질 - 결합 단백질, 또는 특정 변형 및 이종 에피토프는 원하는 단백질을 부착 (일반적으로 &quot;태그&quot;라 함). 이러한 immunoprecipitates로부터 정제 DNA는 관심있는 특정 서열의 엔리치 평가하기 위해 정량적 PCR (qPCR에) 반응에서 주형으로서 사용될 수있다. 이러한 방식으로, 전사 인자의 결합 부위 또는 특정 유전자 히스톤 마크들의 분포는 7,8를 설립 할 수있다. 또한, 대규모 병렬 시퀀싱을 가능 차세대 시퀀싱 (NGS)와 결합 칩 기술은 전사 인자의 결합 부위뿐만 아니라 히스톤 변형 공개 에피 지노믹스 풍경 게놈 전체의 식별을 가능하게하고있다. 또한, 유전자 발현의 동시 분석을 전사 조절기의 결합 또는 특정 히스톤 마크 증착 activi 전사와 상관 관계가 어떻게 모니터링 허용유전자 (9)의 타이. 애기 장대의 칩 프로토콜의 사용은 전사 레귤레이터 다양한 염색질 개화 마스터 유전자의 조직 및 방법이 구조적 변화는 유전자 발현에 영향을 5,6에 미치는 영향을 평가할 수있다. 이전 결과 짧은 일 애기 궤적 조기 BOLTING (EBS)이이 유전자 쇼에서 꽃과 꽃 FT의 마스터 유전자의 상향 조절의 가속도를 꽃과 돌연변이의 억제 자 역할을 것을 보여 주었다. 또한, FT의 기능 상실 돌연변이는 완전히 FT는 EBS 돌연변이 조기 개화과 EBS 10 꽃이 마스터 유전자의 억제에 필요한 것으로 요구 된 것을 나타내는, EBS 돌연변이 식물의 개화 표현형을 억제 , 11. EBS는 특히 히스톤 H3의 디 바인딩과 일에 트라이 메틸화 수있는 PHD-포함하는 단백질을 암호화FT (12)의 크로 마틴 매개 억압에서 EBS의 역할을 제안하는 전자 라이신 4 잔류 물 (/ 3 H3K4me2). 칩 방식의 사용은 애기 PHD 함유 단백질 EBS 10,11는 식 (12)을 억제하는 꽃 적분기 FT 유전자의 조절 영역을 결합하는 것을 보여 주었다. 칩 기술을 이용하여 만들어진 추가의 데이터는이 단백질이 애기 개발의 초기 단계에서 꽃이 마스터 유전자의 크로 마틴의 히스톤 아세틸 화, 활성화 된 전사의 특징 인 낮은 수준을 유지하기 위해 요구되는 것으로 나타났다. 함께 유전자 및 유전자 발현 데이터와 이러한 관찰은이 애기 PHD - 함유 단백질이 꽃 적분기 (12)의 FT 유전자 발현을 변조시킴으로써 개화시기의 미세 조정에 중심적인 역할을 가지고 있음을 보여준다. 여기에 제시된 작품은 히스톤의 분석뿐만 아니라 다른 용뿐만 아니라 유용한 최적화 된 방법을 제공염색질은 단백질 관련, 증가 된 효율 및 실험 시간을 단축. 또한,이 보고서 칩 프로토콜의 사용은 애기 장대의 개화의 발병에 유전자 발현 제어 충격이 염색질 - 중재 메커니즘 염색질 변형의 변화 및 ​​식물 유전자의 전사 상태 사이의 관계에 새로운 통찰력을 제공하는 방법과 어떻게 나타낸다.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 37%&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775-25</td>
			<td>Use under the fume hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5892791001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioruptor Standard sonication device</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01010002 (UCD200TO)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads&#174; magnetic beads coupled with protein A or protein G</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10003D/10001D</td>
			<td>Check manufacturer&#8217;s manual for antibody affinity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracloth</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>475855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#8482; X-100 Surfact-Amps&#8482; Detergent Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>85112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(mouse, rat, rabbit&#8230;)-IgG</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15400001, C15420001, C15410206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack - DynaMag&#8482;-2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K9/14ac polyclonal antibody - Premium&#160;</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>C15410200-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex&#174; 100 Resin</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>142-2832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler&#174; 480 SYBR Green I Master</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4707516001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chromatin immunoprecipitation assay for the identification of arabidopsis protein-dna interactions in vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

여덟 가지 주요 단계는 성장하고 식물 재료, 염색질의 가교, 염색질 격리, 염색질의 분열, DNA와의 복합체의 선택적 분리의 수확을 포함 생체 내 단백질 DNA 상호 작용의 식별을 위해이 칩 프로토콜에 선출 될 수있다 면역 침전, 단백질 분해, DNA 정제와 qPCR의 분석 (도 1)에 의해 관심있는 단백질. 칩 프로토콜에서 중요한 단계는 가교 결합 반응에서 DNA - 단백질 상호 작용의 정착이?...

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Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

염색질 면역 침전은 DNA가 생체 내에서 애기 단백질의 결합 부위의 식별을위한 강력한 기술이다. 이 절차는 염색질 가교과 분열, 관심의 단백질에 선택적 항체와 면역과 결합 된 DNA의 qPCR에 분석을 포함한다. 우리는 애기 장대 식물에 최적화 된 간단한 칩 분석에 대해 설명합니다.

애기 장대 단백질 DNA 상호 작용의 식별을위한 염색질 면역 침전 분석<em&gt; 생체</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

chromatin-immunoprecipitation-assay-for-identification-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

20.3K 조회수.  Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA)-Universidad Politécnica de Madrid.  염색질 면역 침전은 DNA가 생체 내에서 애기 단백질의 결합 부위의 식별을위한 강력한 기술이다. 이 절차는 염색질 가교과 분열, 관심의 단백질에 선택적 항체와 면역과 결합 된 DNA의 qPCR에 분석을 포함한다. 우리는 애기 장대 식물에 최적화 된 간단한 칩 분석에 대해 설명합니다. 

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A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental factors that might result in epigenetic alterations of gene expression and other molecular pathology. Traditionally, however, expression studies in postmortem brain were confined to quantification of mRNA or protein. The limitations encountered in postmortem brain research   such as variabilities in autolysis time and tissue integrities   are also likely to impact any studies of higher order chromatin structures. However, the nucleosomal organization of genomic DNA   including DNA:core histone binding - appears to be largely preserved in representative samples provided by various brain banks. Therefore, it is possible to study the methylation pattern and other covalent modifications of the core histones at defined genomic loci in postmortem brain. Here, we present a simplified native chromatin immunoprecipitation (NChIP) protocol for frozen (never-fixed) human brain specimens. Starting with micrococcal nuclease digestion of brain homogenates, NChIP followed by qPCR can be completed within three days. The methodology presented here should be useful to elucidate epigenetic mechanisms of gene expression in normal and diseased human brain.

Until recently, expression studies on human brain were limited to quantification of RNA or protein. With the chromatin immunoprecipitation techniques described in this paper, it will be possible to map histone methylation and other epigenetic regulators of gene expression in postmortem brain.

인간 두뇌 조직에 대한 염색질 어세이

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

연구

생물학

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

인간 배아 줄기 세포에서 염색질의 Immunoprecipitation

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

인간의 세포에서 활성 유전자 발현의 어세 동적 히스톤 수정을 염색질 Immunoprecipitation (칩)

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

사용 염색질 Immunoprecipitation (CHIP) Drosophila 조직

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

을 바탕으로 단백질 - 단백질 상호 작용의 확인에 프로토콜<sup&gt; 15</sup&gt; N 신진 대사 라벨링, Immunoprecipitation, 수량 질량 분석법 및 선호도 변조

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

바이오 매스의 제한 금액을 사용하여 효율적으로 염색질 immunoprecipitation의

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

특정 게놈 지역과 enChIP으로 관련 분자의 식별의 분리

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

애기 장대 단백질 DNA 상호 작용의 식별을위한 염색질 면역 침전 분석

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