Name: chromatin immunoprecipitation assay for the identification of arabidopsis protein-dna interactions in vivo
Uploaded: 2016-01-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo at JoVE.com

The authors would like to acknowledge The Plant Cell for allowing the use of some data published in this journal to elaborate the representative results described here in Figure 4. This work was supported by the EU 7FP Marie Curie-Initial Training Network EpiTRAITS (Grant Agreement 316965), and by the Spanish Ministerio de Econom&#236;a y Competitividad (grants BIO2010-15589 and BIO2013-43098-R).

식물 재료 1. 가교 (1 시간) <ol><li> 애기 실험에 사용 된 선 성장 (- WT - 야생형 돌연변이 대를, 및 / 또는 태그를 표현하는 라인 대 관심의 단백질의 태그 버전을 표현하는 라인은 어떤 단백질에 융합되지 않음) 큰 페트리 접시에 12-18일에 대한 (150mm) MS 한천 배지 (1 L : 무라 시게 및 1X 스쿡 염, 10g의 수 크로스, 0.5 g의 MES, pH가 5.7 (KOH), 1 % 아가)와. 토양과 지렁이의 1 혼합 : 또는 3을 포함하는 화분에 식물을 재배한다. 주의! 포름 알데히드는 피부 접촉 및 삼키면, 흡입 독성, 그리고 적절한 개인 보호 장비를 착용 화학 후드에서 처리되어야합니다. 1.2 단계 - 1.6 흄 후드에서 수행되어야한다. </li><li> 실험실 버너 가열 바늘 50 ㎖ 튜브의 뚜껑에 작은 구멍을 확인합니다. 1 %의 최종 농도로 1X PBS 40 ml를 첨가하고 완충 포름 알데히드 1.08 ㎖ (스톡 37 %의olution). 그 50 ㎖ 튜브에 식물 재료의 1.5 G를 수집합니다. 가교 동안 얼음에 튜브를 유지합니다. </li><li> 뚜껑 50 ml의 튜브를 닫습니다. 데시 케이 터에 튜브를 삽입하고 진공을 적용합니다. 진공 상태를 10 분 동안 조직을 침투 용액을 휘젓는 않도록 조심스럽게 진공을 해제. 샘플을 섞는다. 두 번 반복합니다. 함침 후, 식물 재료를 관찰하고 약간 반투명하게 확인 및 튜브 (도 2)의 바닥에 가라하는 경향이있다. </li><li> 5 분 동안 진공을 적용 M. 0.125의 최종 농도를 달성하기 위해 2 M 글리신 2.5를 가하여. 글리신은 포름 알데히드 가교 결합의 경쟁 억제제 역할을합니다. </li><li> 뚜껑에 구멍이 폐쇄 된 50ml 튜브를 반전시킴으로써 PBS 알데히드 글리신 용액을 버린다. </li><li> 단계 1.5에 기재된 바와 같이 물이 세정액을 버리고 1X PBS로 두 번으로 한번 묘목을 헹군다. 종이 수건을 건조 및 액체 nitroge에 동결엔. 참고 : 냉동 조직 주 동안 -80 ° C에서 유지 될 수있다. </li></ol> 항체 2. 준비 (1 일) 참고 : 면역 들어, 단백질 G 또는 단백질 항체 중쇄의 불변 도메인에 대한 높은 선호도와 링커를 통해 항체가 결합 자석 구슬의 사용이 권장됩니다. DNA - 단백질 복합체가 비드 - 항체 복합체의 표면에 비특이적으로 부착 할 수있다. 그 때문에, 결합 비특이적 백그라운드를 정량화하는 특이 항체없이 제어를 수행 할 필요가있다. <ol><li> 각각의 면역 들어, 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 자석 구슬의 15 μl를 준비합니다. 비즈의 양은, 면역 침강과 같은 항체에 사용될 염색질의 양에 달려있다. </li><li> TU를 구슬로 염색질 면역 침전 (칩) 희석액 1 ㎖를 추가 회전에 의해 혼합하여 1.5 ml의 마이크로 원심을 배치, 세탁자기 랙에. 구슬 자석에 부착 있도록 약 1 분을 기다립니다. 랙에 여전히 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브, 피펫으로 상층 액을 제거합니다. 두 번 반복합니다. 참고 : 구슬과 항체 (AB) 및 제없이 항체 만 자기 구슬 (무 AB) 제어 한 두 가지 면역 세트가 필요한 각 공장 라인. </li><li> 칩 희석액 200 μL의 비드를 재현 탁. (정확한 희석은 각 Ab의 다릅니다 실험적으로 최적화되어야하거나, 상업 항체의 경우에, 제조업 자의 지시에 따라) 각각의 식물 라인으로 작성된 두 개의 튜브 중 하나에 특정 Ab의 필요한 양을 추가한다. 면역이 샘플을 사용하십시오. 음성 대조군으로서 사용될 다른 튜브에 비특이적 IgG의 동일한 양을 추가한다. </li><li> 항체가 구슬에 연결할 수 있도록 4 ° C에서 회전 바퀴에 O / N을 품어. </li></ol> 3. 염색질 추출 (4 시간) </p&gt; <ol><li> 분말이 균일하고 밝은 녹색이 될 때까지 박격포와 유 봉을 사용하여 철저하게 액체 질소에 냉동 식물 재료를 갈기. 새로운 50 ML 튜브에 분말을 전송합니다. </li><li> 흄 후드에서 3.6, 작업 - 단계 3.2. 추출 버퍼 (1) 30 ㎖ (E × B 형 1)를 추가하고, 조직 분말을 담가 잘 섞는다. 이 단계에서 항상 4 ° C에서 샘플을 유지. 냉동 조직과 액체 질소 먹다 남은 음식은 버퍼가 정지하게됩니다. 튜브를 4 ~ 5 번 매 2 분을 반전시켜 완전히 고정 된 조직을 해동해야합니다. </li><li> 4 ° C에서 20 분 동안 1,000 XG에서 새로운 50 ML 튜브와 원심 분리기를에 22 ~ 25 μm의 기공 크기를 갖는 여과 조직을 통해 전달하여 슬러리의 선택을 취소합니다. 주 :이 단계에서, 모든 핵 소기관 펠렛 것이다. E × B 형 (1)는 높은 밀도를 제공하고 소기관 구조의 붕괴를 방지하기에 충분한 수 크로즈를 포함한다. </li><li> 부드럽게 경사 분리하여 상층 액을 제거합니다. 이 역에서GE는, 약 2 ML의 녹색 펠렛을 관찰합니다. </li><li> E × B 형 5ml에 펠렛을 재현 탁 펠릿 2. 부유이 시점에서 어렵다. 4 ℃에서 10 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기. 참고 : E × B 형이 1 % 트리톤 X-100이 열려 엽록체 버스트와 엽록소를 제거하는 데 도움이 포함되어 있습니다. </li><li> 추출 버퍼 3 (E × B 형 3) 300 μL에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 깨끗한의 microfuge 관에서, E × B 형 3. 600 ㎕의 단계 3.6에서 재현 탁 펠렛을 가지고 신중하게 깨끗한 E × B 형 3의 상단에 레이어 추가합니다. </li><li> 4 ° C에서 16,000 XG에 1 시간 동안 스핀. 참고 :이 단계는 샘플에서 세제를 제거하는 데 도움이됩니다. </li><li> 피펫으로 흡입하여 상층 액을 제거합니다. 천천히 초음파 효율에 영향을 미칠 수있는 기포 형성을 방지하기 위해 위아래로 피펫 팅에 의해 초음파 처리 완충액 300 μL의 핵 펠렛을 재현 탁. 조심스럽게 모든 서스펜션을 피펫 깨끗한 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 전송합니다. 참고 :이버퍼는 핵을 용균과 염색질을 해제, SDS가 포함되어 있습니다. </li><li> 핵을 용균 무작위로 작은 조각으로 염색질을 전단 할 수있는 현탁액을 초음파 처리. (자료 / 시약의 표에 설명 사용할 수있는 초음파 장치에 대해 4 ° C에서 설정 30 초 ON / 30 초 OFF로 20 ~ 30 회)를 200-800 BP 사이의 조각이 풍부한 염색질을 렌더링 초음파 조건을 사용합니다. 초음파 염색질의 2 μL (그림 3)로드, 아가 로스 겔 (13)에 얻어진 DNA 단편의 전기 영동 분리에 의한 초음파의 효율성을 확인합니다. 주의! 초음파 장치가 방음 캐비닛에 포함되지 않은 경우 초음파 단계에서 귀 보호 장비를 착용해야합니다. 중요한 단계는! 염색질의 분열은 주로 초음파 장비에 따라 달라집니다. 초음파 처리 조건은 적절한 크기의 DNA 농축을 달성하도록 조정되어야한다. 만나다염색질 단편화를 최적화하는 방법의 예를 들면도 3. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 12,000 XG에 한 번 용액을 스핀. 깨끗한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 피펫으로 상층 액을 전송합니다. 펠렛을 폐기하십시오. 새로운 1.5 ㎖의 마이크로 원심 튜브에 상청 1/10을 -20 ° C에서 입력 및 동결로 표시. </li><li> 0.1 %의 최종 농도 SDS를 희석 칩 희석 버퍼 염색질 10 배 희석. 참고 : 시료는 냉동 및 몇 주 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol> 관심의 단백질과 DNA의 구조 4. 면역 침전 (1 일, 3 시간) <ol><li> 단계 2.2에 기재된 바와 같이 항체의 잉여를 제거하는 칩 희석액의 1 ml의 단계에서 2.4 세 번 구간 코팅 비드를 세척 하였다. 칩 희석액 200 μL에 재현 탁. 고립 된 염색질의 50 μl를 추가합니다. 4 ° C에서 회전하는 바퀴에 O / N을 품어. 주 : concentrati 확인microvolume UV - 마주 분광 광도계에서 염색질의에. 고립 된 염색질의 50 μL은 DNA의 10 μg의를 포함해야합니다. </li><li> 4 ° C가 단계 4.2-4.5 작업. 단계 2.2에 설명 된대로 낮은 소금 세척 버퍼 1 ㎖에 두 번 구슬을 씻으십시오. </li><li> 높은 소금 세척 버퍼 1 ㎖에 한 번 구슬을 씻으십시오. </li><li> LiCl을 세척 버퍼 1 ㎖에 한 번 구슬을 씻으십시오. </li><li> TE 버퍼 1 ㎖에 두 번 구슬을 씻으십시오. 마지막 세척 후, 완전히 피펫으로 흡입하여 튜브에 남아있는 TE 버퍼를 제거해야합니다. </li><li> 입력 샘플 (단계 3.9)를 꺼냅니다. 새로운 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 전송 입력의 5 μl를하고 칩 샘플로 계속합니다. 5 %의 킬 레이팅, 이온 교환 수지의 200 μl를 첨가하여 가교 역마다 2-3 분간 진탕 95 ° C에서 10 분 동안 배양한다. 30 초 동안 16,000 XG에 스핀 다운 조심스럽게 피펫 팅하여 새로운 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송합니다. 참고 : TRA 동안반전 가교 ditional 방법 그러므로 프로토콜 일일 짧게 만드는 효율적인 decrosslinking 10 분간에 DNA 용출 허용 염화나트륨, 95 ° C에서 킬레이트 이온 수지와의 인큐베이션과 O / N 항온 처리를 포함한다. </li><li> 프로 테이나 제 K의 2 μL (10 ㎎ / ㎖)를 첨가하고, 30 분간 단백질을 소화와 DNA를 분리하기 위해, 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 10 분 동안 95 ℃에서 배양하여 반응을 정지. </li><li> 빠르게 30 초 동안 16,000 XG에 스핀과 피펫 팅하여 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. </li><li> DNA는 표준 DNA 단편을 정제 키트를 사용하여 분리 청소. 참고 : 제조업체의 지침에 따라 진행합니다. </li><li> 새로운 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 키트에서 DNA 결합 열을 전송합니다. 컬럼의 중심으로의 DNase없는 물 20 μl를 첨가하고 60 초 동안 16,000 XG에서 회전시켜 DNA를 정제하여 용리. 포인트를 중지 샘플 몇 주 동안 -80 ° C에 저장 될 수있다. </li></OL&gt; 5. qPCR에 의한 면역 DNA에 결합 부위의 풍요를 측정 (4 시간) 참고 : 침전 된 염색질에서 분리 된 DNA는 인해 관심의 단백질에 결합으로, 총 염색질에서 칩 에드되었습니다하는 DNA 단편을 결정하기 위해 분석되어야한다. <ol><li> 60 ° C의 융점 (Tm)이 ​​30 % -80 %의 GC 함량을 갖는 관심 영역 게놈 디자인 프라이머. 염색질은 초음파 처리에 의해 단편화 된 바와 같이, 증폭 된 서열의 길이는 150-200 뉴클레오티드 (표 1) 이상이어야한다. 참고 : 프라이머 디자인을위한 유용한 도구가 프라이머 3 프로그램 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). 프라이머 디자인에 대한 추가 가이드 라인은 14, 15, 이전 보고서 8에서 사용할 수 있습니다. </li><li> 프라이머가 특정되어 있는지 확인하기 위해 BLAST 프로그램을 사용하여 (특히 프로모터 시퀀스 결합 비슷한 TF를 공유 할 수 있습니다) 및 프라이머 효율 날기를 테스트g 입력 DNA (단계 4.9)의 1:10 희석 물. 게놈의 특정 영역은 다른 사람보다 더 정제 될 것입니다. 이는 PCR 프라이머를 설계하고, 입력 희석 DNA 그들을 체크하는 것이 중요하다. </li><li> 각 PCR 반응 용 튜브에 피펫으로 물과 희석 DNA 5 μl를 정제 된 DNA 1:10 희석. 주 : DNA는 1.5 ml의 마이크로 원심 관의 벽에 부착 할 수로서, 필요한 양만 희석. 여러 동결 해동 사이클 부착 DNA 분자의 수를 증가시킨다. 입력의 각 프라이머 쌍, 증폭를 들어, AB-칩과 무 Ab의 칩을 분석해야한다. </li><li> PCR 믹스를 완료하기 위해, 1X의 최종 농도 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스를 추가하고, 각 프라이머의 0.5 μM. DNase의없는 물 20 μL까지 채 웁니다. </li><li> SYBR 녹색 PCR 마스터 믹스 제조업체의 지침에 따라 qPCR에 반응을 수행합니다. </li></ol> 6. 데이터 분석 참고 : 전 중칩 데이터를 분석하는 방법을 isting, 두 사람은 가장 일반적으로 사용된다. 그 중 첫 번째는 &#39;노 항체 컨트롤을 기준으로&#39; &#39;상대 농축&#39;, &#39;배경 위에 신호&#39;또는로 명명 배 농축 방법이다. 두 번째 방법은 &quot;입력 %&quot;로 지정됩니다. <ol><li> 배 농축 방식에 의한 데이터 분석. <ol><li> qPCR의 반응 후의 된 샘플의 이름과 원시 코네티컷 값으로 스프레드 시트를 작성합니다. </li><li> 각 샘플에 대해, 원시 형 Ct 값에서 대응하는 AB 급 제어 얻어진 원료 코네티컷 값을 뺀다. 참고 :이 수학 연산 한 후, 노 구간 샘플에 대한 코네티컷 값이 0과 동일합니다. </li><li> 기본 2 단계 6.1.2 (표 2)에서 얻은 부정적인 나머지 동일한 지수 (전원)와 지수의 조작에 의해 배 농축을 계산합니다. 농축 배 = 2 - (CT (샘플) - 코네티컷 (무 AB)) 참고 :이 운전 방식에서D 칩 에드 샘플에서 특정 DNA 단편의 풍부가 더-Ab의 제어에서이 조각의 풍요 로움과 비교된다. 이 방법의 가정은 배경 신호의 레벨이 다른 프라이머 세트, 샘플 및 복제 실험 간 재현성이라는 것이다. 그러나,이 &#39;noise&#39; 신호 레벨은 프라이머 세트, 샘플 및 실험 사이에서 변할 않는다. </li></ol></li><li> 입력 방법의 %의 데이터 분석. <ol><li> 샘플 이름과 qPCR에 반응 후에 얻어 된 원료 코네티컷 값으로 스프레드 시트를 작성합니다. </li><li> 입력으로 하였다 염색질의 총 추출 분획으로부터 대수베이스 (2)의 값을 감산하여 입력 샘플들에 대한 원시 형 Ct 값을 조정한다. 참고 : 전체 염색질의 10 %가이 프로토콜의 입력으로 하였다으로 감산 값이 3.32에 해당이 프로토콜에서. 로그인 2 (10) 3.32 같습니다. </li><li> B (100)와 지수 연산의 값을 승산함으로써 입력의 %를 계산ASE (2) 및 시료 (표 3)의 원료 코네티컷 값으로부터 감산 조정 된 입력 값들의 나머지와 동일한 지수 (전력). 입력의 % = 100 * 2 (조정 입력 - 코네티컷 (샘플)) 참고 :이 절차로, 총 격리 된 염색질 (입력 샘플)에 칩 에드 샘플의 특정 DNA 풍부 사이의 관계가 계산됩니다. 칩 데이터 분석에 대한 더 자세한 사항은 해링 등. 8에서 찾을 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation.">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41 (6), 694-698 (2006).</li><li>Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+assay.">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> Biotechniques. 37 (6), 961-969 (2004).</li><li>Kaufmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+genes+of+the+MADS+transcription+factor+SEPALLATA3:+integration+of+developmental+and+hormonal+pathways+in+the+Arabidopsis+flower.">Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower.</a> PLoS Biol. 7 (4), e1000090 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

여기에 설명 된 칩 프로토콜은 아라비돕시스 식물의 생체 내에서 단백질과 특정 DNA 서열 사이의 상호 작용을 분석 재현성 강력한 기술이다. 관심의 단백질 결합 부위의 성공적인 식별 관련 상호 작용이 실제로 일어나고있는 식물 기관 또는 발달 단계의 적절한 선택이 필요합니다. 또, 식물 재료의 적절한 고정 및 초음파 처리에 의해 최적의 염색질의 전단을 수득하는 것이 중요하다. 선택?...

최근 몇 년 동안, 분자 적 유전자 및 게놈 툴의 다양한 모델 종 애기 장대에서 개발되어왔다. 이 기술은 식물 개발을 규제하는 방법을 이해하는 엄청난 발전을 촉진했다. 모델로 애기 장대를 이용하여 연구 개발 과정 중, 꽃이 피는 시간의 유전 적 제어가 광범위하게 분석하고있다. 이 연구는 식물은 호르몬과 식물의 나이 내생 단서에 대한 응답으로 꽃을 매우 정밀하게 시간을 조절하는 것으로 나타났습니다, 또한 시즌 1의 자연주기와 시간을 꽃 동기화 등 광주 및 온도 등의 환경 신호에, 2. 개화시기의 변화와 애기 돌연변이의 분리 및 특성 규명은 내인성 및 환경 인자에 응답하여 개화시기를 조절하는 유전자의 복잡한 네트워크를 공개에서 결정되었다. 이 유전자 회로는꽃의 스위치로서 작용 몇 마스터 유전자 수준에서 통합 및 꽃 개시의 정확한 타이밍은 개화 촉진 및 꽃 적분기 유전자 1,3 상류 작업 활동을 억압의 균형에 의존한다. 게놈 접근의 최근 사용에 의해 원조 꽃 개시의 제어에서의 역할에 대해 확인 된 유전자의 기능적 특성은, 꽃이 피는 시간의 변조에 전사 조절의 중심 역할을 계시했다. 사실, 꽃 인코딩 전사 마스터 유전자의 대부분은 4 요인. 또한, 크로 마틴 리모델링 단백질 복합체의 수는 개화 마스터 유전자의 발현에 영향을 미친다. 자신의 변경된 꽃 시간 동안 고립 된 애기 장대 돌연변이 체의 수는 염색질 수정의 다양한 암호화하는 유전자의 돌연변이를 가지고 밝혀졌다. 히스톤의 번역 후 변형을 소개 다른 염색질 remodelers전자 꼬리는 DNA에 비해 뉴 클레오의 위치를 변경하거나 애기 5,6에서 꽃의 적절한 규제 히스톤 변형에 의해 필요한 표준 히스톤을하고 있습니다 교환한다. 이 크로 마틴 리모델링 활동 중 일부는 증착 또는 특정 히스톤 잔류 물에 아세틸 또는 메틸화와 같은 공유 수정의 제거를 촉진. 이러한 히스톤 마크는 특히 꽃 유전자의 전사 활성을 조절하는 다른 크로 마틴 리모델링 복합체, 전사 인자 또는 전사 기계의 구성 요소를 모집 전문 이펙터에 의해 인식됩니다. 염색질 면역 침전 (칩)는 생체 내 DNA 결합 관심의 단백질 사이트를 (그림 1)의 확인을 할 수 있습니다. 이 절차는 DNA에 크로스 링크에 특정 화학 물질의 기능의 단백질을 이용한다. 얻어진 DNA 단백질 복합체는 다음 AGA 특정 항체를 이용하여 면역 침전 될 수있다이달 전사 인자, 염색질 - 결합 단백질, 또는 특정 변형 및 이종 에피토프는 원하는 단백질을 부착 (일반적으로 &quot;태그&quot;라 함). 이러한 immunoprecipitates로부터 정제 DNA는 관심있는 특정 서열의 엔리치 평가하기 위해 정량적 PCR (qPCR에) 반응에서 주형으로서 사용될 수있다. 이러한 방식으로, 전사 인자의 결합 부위 또는 특정 유전자 히스톤 마크들의 분포는 7,8를 설립 할 수있다. 또한, 대규모 병렬 시퀀싱을 가능 차세대 시퀀싱 (NGS)와 결합 칩 기술은 전사 인자의 결합 부위뿐만 아니라 히스톤 변형 공개 에피 지노믹스 풍경 게놈 전체의 식별을 가능하게하고있다. 또한, 유전자 발현의 동시 분석을 전사 조절기의 결합 또는 특정 히스톤 마크 증착 activi 전사와 상관 관계가 어떻게 모니터링 허용유전자 (9)의 타이. 애기 장대의 칩 프로토콜의 사용은 전사 레귤레이터 다양한 염색질 개화 마스터 유전자의 조직 및 방법이 구조적 변화는 유전자 발현에 영향을 5,6에 미치는 영향을 평가할 수있다. 이전 결과 짧은 일 애기 궤적 조기 BOLTING (EBS)이이 유전자 쇼에서 꽃과 꽃 FT의 마스터 유전자의 상향 조절의 가속도를 꽃과 돌연변이의 억제 자 역할을 것을 보여 주었다. 또한, FT의 기능 상실 돌연변이는 완전히 FT는 EBS 돌연변이 조기 개화과 EBS 10 꽃이 마스터 유전자의 억제에 필요한 것으로 요구 된 것을 나타내는, EBS 돌연변이 식물의 개화 표현형을 억제 , 11. EBS는 특히 히스톤 H3의 디 바인딩과 일에 트라이 메틸화 수있는 PHD-포함하는 단백질을 암호화FT (12)의 크로 마틴 매개 억압에서 EBS의 역할을 제안하는 전자 라이신 4 잔류 물 (/ 3 H3K4me2). 칩 방식의 사용은 애기 PHD 함유 단백질 EBS 10,11는 식 (12)을 억제하는 꽃 적분기 FT 유전자의 조절 영역을 결합하는 것을 보여 주었다. 칩 기술을 이용하여 만들어진 추가의 데이터는이 단백질이 애기 개발의 초기 단계에서 꽃이 마스터 유전자의 크로 마틴의 히스톤 아세틸 화, 활성화 된 전사의 특징 인 낮은 수준을 유지하기 위해 요구되는 것으로 나타났다. 함께 유전자 및 유전자 발현 데이터와 이러한 관찰은이 애기 PHD - 함유 단백질이 꽃 적분기 (12)의 FT 유전자 발현을 변조시킴으로써 개화시기의 미세 조정에 중심적인 역할을 가지고 있음을 보여준다. 여기에 제시된 작품은 히스톤의 분석뿐만 아니라 다른 용뿐만 아니라 유용한 최적화 된 방법을 제공염색질은 단백질 관련, 증가 된 효율 및 실험 시간을 단축. 또한,이 보고서 칩 프로토콜의 사용은 애기 장대의 개화의 발병에 유전자 발현 제어 충격이 염색질 - 중재 메커니즘 염색질 변형의 변화 및 ​​식물 유전자의 전사 상태 사이의 관계에 새로운 통찰력을 제공하는 방법과 어떻게 나타낸다.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture)</td><td>Sigma</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde 37%&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F8775-25</td><td>Use under the fume hood</td></tr><tr><td>Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack</td><td>Roche</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Standard sonication device</td><td>Diagenode</td><td>B01010002 (UCD200TO)</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads magnetic beads coupled with protein A or protein G</td><td>Life Technologies</td><td>10003D/10001D</td><td>Check manufacturer&amp;rsquo;s manual for antibody affinity</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Merck Millipore</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 Surfact-Amps Detergent Solution</td><td>Life Technologies</td><td>85112</td><td></td></tr><tr><td>(mouse, rat, rabbit&amp;hellip;)-IgG</td><td>Diagenode</td><td>C15400001, C15420001, C15410206</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic rack - DynaMag-2</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>H3K9/14ac polyclonal antibody - Premium&amp;nbsp;</td><td>Diagenode</td><td>C15410200-10</td><td></td></tr><tr><td>Chelex 100 Resin</td><td>Bio-Rad</td><td>142-2832</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Life Technologies</td><td>17916</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6</td><td>Millipore</td><td>05-724</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation assay for the identification of arabidopsis protein-dna interactions in vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

여덟 가지 주요 단계는 성장하고 식물 재료, 염색질의 가교, 염색질 격리, 염색질의 분열, DNA와의 복합체의 선택적 분리의 수확을 포함 생체 내 단백질 DNA 상호 작용의 식별을 위해이 칩 프로토콜에 선출 될 수있다 면역 침전, 단백질 분해, DNA 정제와 qPCR의 분석 (도 1)에 의해 관심있는 단백질. 칩 프로토콜에서 중요한 단계는 가교 결합 반응에서 DNA - 단백질 상호 작용의 정착이?...

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Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

염색질 면역 침전은 DNA가 생체 내에서 애기 단백질의 결합 부위의 식별을위한 강력한 기술이다. 이 절차는 염색질 가교과 분열, 관심의 단백질에 선택적 항체와 면역과 결합 된 DNA의 qPCR에 분석을 포함한다. 우리는 애기 장대 식물에 최적화 된 간단한 칩 분석에 대해 설명합니다.

애기 장대 단백질 DNA 상호 작용의 식별을위한 염색질 면역 침전 분석<em&gt; 생체</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

chromatin-immunoprecipitation-assay-for-identification-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

20.3K 조회수.  Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA)-Universidad Politécnica de Madrid.  염색질 면역 침전은 DNA가 생체 내에서 애기 단백질의 결합 부위의 식별을위한 강력한 기술이다. 이 절차는 염색질 가교과 분열, 관심의 단백질에 선택적 항체와 면역과 결합 된 DNA의 qPCR에 분석을 포함한다. 우리는 애기 장대 식물에 최적화 된 간단한 칩 분석에 대해 설명합니다. 

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A Protein Preparation Method for the High-throughput Identification of Proteins Interacting with a Nuclear Cofactor Using LC-MS/MS Analysis

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in regulating transcription. These include the direct interaction with transcription factors, the covalent modification of histones and other proteins, and the occasional chromatin conformation alteration. Accordingly, establishing relatively quick methods for identifying proteins that interact within this network is crucial to enhancing our understanding of the underlying regulatory mechanisms. LC-MS/MS-mediated protein binding partner identification is a validated technique used to analyze protein-protein interactions. By immunoprecipitating a previously-identified member of a protein complex with an antibody (occasionally with an antibody for a tagged protein), it is possible to identify its unknown protein interactions via mass spectrometry analysis. Here, we present a method of protein preparation for the LC-MS/MS-mediated high-throughput identification of protein interactions involving nuclear cofactors and their binding partners. This method allows for a better understanding of the transcriptional regulatory mechanisms of the targeted nuclear factors.

We have established a method for the purification of coregulatory interaction proteins using the LC-MS/MS system.

LC-MS / MS 분석을 이용하여 핵 공동 인자와 상호 작용 단백질의 높은 처리량 식별 단백질 제조 방법

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in ...

연구

생화학

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional gene regulation (PTGR) of messenger RNAs (mRNAs). In the past few years, a number of mRNA-bound proteomes from yeast and mammalian cell lines have been successfully isolated through the use of a novel method called &#34;mRNA interactome capture,&#34; which allows for the identification of mRNA-binding proteins (mRBPs) directly from a physiological environment. The method is composed of in vivo ultraviolet (UV) crosslinking, pull-down and purification of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) by oligo(dT) beads, and the subsequent identification of the crosslinked proteins by mass spectrometry (MS). Very recently, by applying the same method, several plant mRNA-bound proteomes have been reported simultaneously from different Arabidopsis tissue sources: etiolated seedlings, leaf tissue, leaf mesophyll protoplasts, and cultured root cells. Here, we present the optimized mRNA interactome capture method for Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts, a cell type that serves as a versatile tool for experiments that include various cellular assays. The conditions for optimal protein yield include the amount of starting tissue and the duration of UV irradiation. In the mRNA-bound proteome obtained from a medium-scale experiment (107 cells), RBPs noted to have RNA-binding capacity were found to be overrepresented, and many novel RBPs were identified. The experiment can be scaled up (109 cells), and the optimized method can be applied to other plant cell types and species to broadly isolate, catalog, and compare mRNA-bound proteomes in plants.

Here, we present an interactome capture protocol applied to Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts. This method critically relies on in vivo UV crosslinking and allows for the isolation and identification of plant mRNA-binding proteins from a physiological environment.

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent modifications on the amino-terminal tails of histones H3 and H4 play essential roles1-2. H3 and H4 histone modifications include methylation of lysine and arginine, acetylation of lysine, and phosphorylation of serine residues1-2. These modifications are associated either with gene activation, repression, or a primed state of gene that supports more rapid and robust activation of expression after perception of appropriate signals (microbe-associated molecular patterns, light, hormones, etc.)3-7. 
Here, we present a method for the reliable and sensitive detection of specific chromatin modifications on selected plant genes. The technique is based on the crosslinking of (modified) histones and DNA with formaldehyde8,9, extraction and sonication of chromatin, chromatin immunoprecipitation (ChIP) with modification-specific antibodies9,10, de-crosslinking of histone-DNA complexes, and gene-specific real-time quantitative PCR. The approach has proven useful for detecting specific histone modifications associated with C4 photosynthesis in maize5,11 and systemic immunity in Arabidopsis3.

A reliable and useful approach to detect histone modifications on specific plant genes is described. The approach combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) and real-time quantitative PCR. It allows detection of histone modifications on specific genes with a role in diverse physiological processes.

식물 잎에서 히스톤 수정을 감지

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

생물학

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been successfully used for identification of protein-protein interactions (PPIs) in mammalian cells. However, requirements of toxic hydrogen peroxide (H2O2) in APEX-based PL, longer incubation time with biotin (16&#8211;24 h), and higher incubation temperature (37 &#176;C) in BioID-based PL severely limit their applications in plants. The recently described TurboID-based PL addresses many limitations of BioID and APEX. TurboID allows rapid proximity labeling of proteins in just 10&#8201;min under room temperature (RT) conditions. Although the utility of TurboID has been demonstrated in animal models, we recently showed that TurboID-based PL performs better in plants compared to BioID for labeling of proteins that are proximal to a protein of interest. Provided here is a step-by-step protocol for the identification of protein interaction partners using the N-terminal Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain of the nucleotide-binding leucine-rich repeat (NLR) protein family as a model. The method describes vector construction, agroinfiltration of protein expression constructs, biotin treatment, protein extraction and desalting, quantification, and enrichment of the biotinylated proteins by affinity purification. The protocol described here can be easily adapted to study other proteins of interest in Nicotiana and other plant species.

Described here is a proximity labeling method for identification of interaction partners of the TIR domain of the NLR immune receptor in Nicotiana benthamiana leaf tissue. Also provided is a detailed protocol for the identification of interactions between other proteins of interest using this technique in Nicotiana and other plant species.

단백질-단백질 상호 작용 네트워크의 질라 식별을 위한 터보ID 기반 근접 라벨링

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been ...

면역학 및 감염병학

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

식물 단백질 복합체의 번역 후 변형의 확인

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

전체 마운트 난자에있는 염색질 수정 및 핵 구조의 정량, 단일 세포 분석을위한 효율적인 방법<em&gt; 애기 장대</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Luciferase 보완성 이미징 분석 결과 Nicotiana benthamiana 잎 뚜렷이 결정 단백질 단백질 상호 작용 역동성에 대 한

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

AirID-Based Proximity Labeling for Protein-Protein Interaction in Plants

In mammalian cells and plants, proximity labeling (PL) approaches using modified ascorbate peroxidase (APEX) or the Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have proven successful in identifying protein-protein interactions (PPIs). APEX, BioID, and TurboID, a revised version of BioID have some restrictions in addition to being valuable technologies. The recently developed AirID, a novel version of BioID for proximity identification in protein-protein interactions, overcame these restrictions. Previously, AirID has been used in animal models, while the current study demonstrates the use of AirID in plants, and the results confirmed that AirID performs better in plant systems as compared to other PL enzymes such as BioID and TurboID for protein labeling that are proximal to the target proteins. Here is a step-by-step protocol for identifying protein interaction partners using AT4G18020 (APRR2) protein as a model. The methods describe the construction of vector, the transformation of construct through agroinfiltration, biotin transformation, extraction of proteins, and enrichment of biotin-labeled proteins through affinity purification technique. The results conclude that AirID is a novel and ideal enzyme for analyzing PPIs in plants. The method can be applied to study other proteins in plants.

Here, we present a step-by-step protocol for performing the proximity labeling (PL) experiment in cucumber (Cucumis sativus L.) using AT4G18020 (APRR2)-AirID protein as a model. The method describes the construction of a vector, the transformation of a construct through agroinfiltration, biotin infiltration, protein extraction, and purification of biotin-labeled proteins through affinity purification technique.

식물의 단백질-단백질 상호작용을 위한 AirID 기반 근접 라벨링

In mammalian cells and plants, proximity labeling (PL) approaches using modified ascorbate peroxidase (APEX) or the Escherichia coli biotin ligase BirA ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay: A Technique to Study Protein-DNA Interactions in Cells

Source: Fuchs, A. R.,et al. <a href="https://www.jove.com/t/58270">A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video describes protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, which is a classic technique to demonstrate protein-DNA interactions.This technique is used to identify target genes in human chronic lymphocytic leukemia cells.

염색질 면역침전 분석법: 세포에서 단백질-DNA 상호 작용을 연구하는 기술

Source: Fuchs, A. R.,et al. A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia. J. Vis. Exp. ...

애기 장대 단백질 DNA 상호 작용의 식별을위한 염색질 면역 침전 분석

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