AirID는 단백질-단백질 상호 작용에 유용한 효소이며, 다른 근접 표지 효소보다 시간이 걸리는 공정에서 독성과 오류가 적습니다. APRR2-AirID 단백질을 모델로 사용하여 오이 또는 Cucumis sativus에서 근접 표지 실험AT4G18020 수행하기 위한 단계별 프로토콜이 제시됩니다. 제 연구실의 Ahmad Zada, Imran Khan, Yuting Cheng 및 Min Zhang이 절차를 시연할 것입니다.
Cucumis sativus 또는 오이 씨앗을 물에 옮기고 섭씨 50도에서 20 분 동안 배양 한 다음 12-16 시간 동안 페트리 플레이트의 여과지에 씨앗을 놓습니다. 나중에, 씨앗을 흙이 들어있는 화분에 옮기고 섭씨 23도의 기후 챔버에서 16 시간 빛과 18 시간 어두운 사진 촬영 기간 동안 3-4 주 동안 자랍니다. 2.5 마이크로리터의 플라스미드 EarleyGate 100을 agrobacterium tumefaciens GV3101 균주의 유능한 세포로 옮깁니다.
튜브를 얼음 위에서 30분 동안 배양한 후 액체 질소로 3분 동안 옮깁니다. 열 충격을 주려면 튜브를 섭씨 37도의 인큐베이터로 5분 동안 옮깁니다. 그런 다음 튜브를 얼음 위에 2분 동안 올려 놓습니다.
1개, Luria Bertani LB 매체의 000 마이크로리터를 열에 충격을 가한 agrobacterium 세포에 추가하십시오. 세포를 섭씨 30도, 118RPM에서 1시간 동안 배양한 후 섭씨 4도에서 2분 동안 3000G로 원심분리합니다. 그런 다음 800 마이크로 리터 상층액을 버리고 나머지 용액을 혼합하십시오.
카나마이신과 겐타마이신을 각각 밀리리터당 50마이크로그램, 리팜피신 밀리리터당 25마이크로그램을 보충한 LB 배지에 접시에 담습니다. 접시를 섭씨 30도에서 48시간 동안 배양합니다. 접시에서 박테리아 군집을 집어 올리십시오.
적절한 항생제를 보충한 LB 액체 배지에 넣고 섭씨 30도, 218RPM에서 36-48시간 동안 액체 LB를 배양합니다. 3, 4 섭씨 온도에 000 G에 원심분리의 2 분 후에, 600 나노미터 파장에 것에 광학 조밀도를 조정하기 위하여 agroinfiltration 완충기에 있는 펠릿을 재현탁시키십시오. 1 밀리리터의 바늘 없는 주사기를 사용하여 1.5 밀리리터의 재현탁 농균 접종물을 복축표면의 표피 전체에 침투시킵니다.
8 시간 동안 어두운 조건에서 16 시간 동안 초당 제곱 미터 당 75 마이크로 몰 빛으로 섭씨 23 도의 기후 챔버에서 식물을 유지하십시오 36 시간 후, 이미 여과 된 잎에 5 마이크로 그램의 비오틴 1 밀리리터를 침투시킵니다. 4-12시간 동안 비오틴이 침투한 후 잎을 자르고 액체 질소로 빠르게 옮겨 단백질 분해를 방지하십시오. 유봉과 절구를 사용하여 잎을 갈고 pH 7.4의 PBS BSA 2ml를 빠르게 첨가한 다음 천천히 분쇄합니다.
샘플 혼합물을 그 위에 놓인 빠른 여과 재료 필터를 통해 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 튜브를 얼음 위에 유지합니다. 샘플을 2밀리리터 튜브로 옮깁니다. 1% 단백질 억제제 칵테일을 넣고 원심분리하기 전에 튜브를 위아래로 7-8번 돌려 내용물을 섞습니다.
완료되면 상층액을 새 2밀리리터 튜브에 옮기고 10% 베타-D-말토사이드를 추가합니다. 20, 4 섭씨 온도에 10 분 동안 000 G에 분리하기 전에 5 분 동안 얼음에 관을 두십시오. 탈염 컬럼의 평형을 맞추려면 컬럼의 한쪽 면을 표시하고 표시된 면이 바깥쪽을 향하도록 원심분리합니다.
란의 정상과 밑바닥 덮개를 제거하고 4 섭씨 온도에 1, 000 G에 2 분 동안 다시 분리기를 분리하십시오. 컬럼의 수집 튜브에서 액체 용액을 버리고 이전에 시연된 대로 원심분리를 통해 5mL의 PBS 완충액으로 튜브를 최소 5회 세척합니다. 1.5밀리리터 튜브에 있는 50마이크로리터의 스트렙타비딘-C1 복합 마그네틱 비드에 PBS BSA 1밀리리터를 넣고 잘 섞습니다.
튜브를 자석 스탠드에 3분 동안 올려 튜브의 한쪽 쪽으로 비드를 흡수시킵니다. 반대쪽의 상층액을 버리고 이 PBS BSA 세척을 세 번 반복합니다. 비오틴화된 단백질을 농축하려면 컬럼에 2mL의 샘플을 추가합니다.
섭씨 4도에서 8분 동안 1000G에서 컬럼을 원심분리한 후 1mL의 탈염 단백질 추출물을 50마이크로리터의 Streptavidin-C1 복합 마그네틱 비드에 추가합니다. 자성 비드가 들어있는 튜브를 정상 속도와 실온에서 30분 동안 회전기에 올려 용액을 완전히 혼합합니다. 그런 다음 실온에서 3분 동안 또는 튜브의 한쪽에 모일 때까지 마그네틱 랙에 비드를 놓습니다.
상층액을 부드럽게 제거하고 세척 완충액 1 1 밀리리터를 추가합니다. 로테이터에서 튜브를 2분 동안 회전시키고 마그네틱 랙에서 수행한 단계를 반복하여 상층액을 제거합니다. 마찬가지로, 이전에 설명한 대로 1밀리리터의 세척 버퍼 2와 3으로 세척을 수행합니다.
다음으로, 1.7 밀리 몰 트리스 하이드로 클로라이드 50 밀리리터를 추가하고 마그네틱 랙에서 수행 된 단계를 반복하여 세척 버퍼에서 세제를 제거합니다. 50 밀리몰 암모늄 중탄산염 완충액 1 밀리리터를 사용하여 각각 2 분씩 6 회 세척하십시오. 다 익으면 염산삼중염산염 50밀리몰, 수크로스 12%, 라우릴리튬 황산염 2, 디티오트레이톨 1.5%가 함유된 단백질 추출물 50마이크로리터를 비드에 넣고 튜브를 섭씨 100도의 인큐베이터에 5분간 넣어 열충격을 줍니다.
마그네틱 랙에서 단계를 반복한 후 LCMS/MS 분석을 위해 상층액을 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 추출된 단백질의 웨스턴 블롯 분석은 침윤된 오이 잎에서 성공적인 단백질 발현 및 비오틴화를 보여주었습니다. 대조군에 비해 표지된 단백질과 추가 밴드의 발현 수준이 높을수록 AirID에 의한 관심 유전자의 표적 단백질의 성공적인 태깅이 확인되었습니다.
결과는 모든 형질전환된 샘플에서 Anti-Flag 항체가 있는 표적 밴드를 보여주는 Anti-Flag 및 Anti-Mass 항체를 사용하여 확인되었습니다. 스트렙타비딘-C1 접합 마그네틱 비드로 비오틴화된 단백질을 농축한 후 크기가 다른 여러 단백질을 관찰했습니다. 모든 결과에서 AirID는 식물의 단백질-단백질 상호 작용을 분석하기 위한 새롭고 이상적인 효소라는 결론을 내렸습니다.
근접 표지 실험 중에는 5마이크로몰 비오틴과 HR 지속 시간이 이상적이라는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 잎 샘플 준비, 프리비오틴 제거, 추출물 단백질 정량화 및 비오틴화 단백질 농축을 포함하여 식물에서 AirID 기반 근접 라벨링의 단계별 설정을 간략하게 설명합니다. AirID는 PPI 독립적 비오틴화 정확도를 함께 향상시킬 것으로 예상됩니다.
AirID는 식물의 PPI 분석에 이상적이라는 결론을 내렸습니다.
