MN-S는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 지원을 인정, 루이 저자는 감사 써모 피셔 과학 LTQ Orbitrap XL 질량 분석기의 사용을 위해 그린 즈 버러 노스 캐롤라이나 대학의 인조 질량 분석 시설을 인정 CHE 1011859.을 부여합니다. 저자는이 작품에 대한 유용한 제안과 의견을 그린 즈 버러 노스 캐롤라이나 대학의 다니엘 토드, 빈센트 시카 및 Brandie Erhmann 감사합니다.

참고 : 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하시기 바랍니다. 염화 수은은 독성 화학 물질이다. IT와 관련된 모든 솔루션을 전달하는 경우 개인 보호 장비 (장갑, 보안경 및 실험실 코트)를 착용해야합니다. 중금속 지정된 명확하게 표시 화학 폐기물 병에 솔루션을 폐기하십시오. 1. 준비 5 mM의 탈기 암모늄 편대 버퍼, pH가 7.5 <ol><li> HPLC 등급의 물 450 ㎖에 포름산 암모늄 완충액 0.1576 g을 녹인다. 1 M 포름산 7.5에 1 M 수산화 암모늄으로 상기 용액의 pH를 조정한다. 500㎖의 메스 플라스크에이 용액을 전송 및 5mM의 포름산 암모늄 용액을 만들기 위해 검량선을 HPLC 물을 추가한다. </li><li> 아르곤으로 10 분, 퍼지 용 진공 하에서 5mM의 포름산 암모늄 버퍼를 탈기. 두 번 반복 아르곤하에 저장 솔루션입니다. 사용 당일에, 0.2 마이크론 필터 befor를 통해 완충액을 필터E 사용. </li></ol> 수은 (II) 염화물 솔루션 2. 준비 <ol><li> 0.2375 g의 수은 (II) 클로라이드를 달다. 0.035 M 수은 (II) 클로라이드 용액을 제조 5 mM의 포름산 암모늄 완충액 25 ㎖에 용해. </li><li> 7.5 X 10-4 M 용액을 만들 9.785 ㎖의 5 mM로 포름산 암모늄 버퍼에 0.214 ㎖의 0.035 M 수은 (II) 클로라이드 용액을 첨가한다. 아르곤 가스로 7.5 X 10-4 M 수은 (II) 용액 담요. </li></ol> CGGC 원액 3. 준비 <ol><li> HPLC 등급 아세토 니트릴 0.118 ㎖ 중의 dicysteinyl의 테트라, CGGC 2.0 밀리그램을 용해하고 1.0647 ​​㎖의 5 mM의 암모늄 포르 메이트, pH를 5 mM의 CGGC 스톡 용액을 수득 아르곤으로 탈기 한 7.5 완충액 추가. </li><li> 5 mM의 암모늄 형성의 pH 1,275 μL에 7.5 × 10 -4 M CGGC 솔루션을 제공하는 7.5 버퍼를 5 밀리미터 CGGC 주식 솔루션의 225 μl를 추가합니다. </li></ol> 4. 준비수은 (II) 및 CGGC 다양한 반응 혼합물 <ol><li> (1)의 제조 : 0.5 비율의 수은 (II) 용액 CGGC <ol><li> 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 5 밀리미터 포름산 암모늄, pH가 7.5 버퍼의 255 μl를 놓습니다. 포름산 암모늄 완충액 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 7.5 X10 -4 M 수은 (II) 클로라이드 용액 30 μL를 추가한다. </li><li> 10 초에 대한 솔루션을 소용돌이. 그런 다음 1.5 ml의 마이크로 원심에 7.5 × 10 -4 M CGGC 솔루션의 15 μl를 추가합니다. 10 초에 대한 솔루션을 소용돌이. 용액은 질량 분석기로 주입 전에 10 분 동안 방치하자. </li></ol></li><li> 수은의 비율이 1 (II) : 1의 제조 CGGC 용액 <ol><li> 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 5 밀리미터 포름산 암모늄, pH가 7.5 버퍼의 240 μl를 놓습니다. 포름산 암모늄 완충액 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 7.5 X10 -4 M 수은 (II) 클로라이드 용액 30 μL를 추가한다. </li><li> 10 초에 대한 솔루션을 소용돌이. 그때1.5 ml의 microcentrifuge 관에 7.5 × 10 -4 M CGGC 솔루션의 30 μl를 추가합니다. 섹션 4.1에 기재된 바와 같이 유사한 방식으로 반복한다. </li></ol></li><li> 수은의 비율이 2 (II) : 1의 제조 CGGC 용액 <ol><li> 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 5 밀리미터 포름산 암모늄, pH가 7.5 버퍼의 210 μl를 놓습니다. 포름산 암모늄 완충액 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 7.5 X10 -4 M 수은 (II) 클로라이드 용액 30 μL를 추가한다. </li><li> 10 초에 대한 솔루션을 소용돌이. 그런 다음 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 7.5 × 10 -4 M CGGC 솔루션의 60 μl를 추가합니다. 섹션 4.1에 기재된 바와 같이 유사한 방식으로 반복한다. </li></ol></li></ol> CEEC 원액 5. 준비 <ol><li> 펩티드를 용해 HPLC 등급 아세토 니트릴 0.145 ㎖ 중의 dicysteinyl의 테트라, CEEC 3.5 밀리그램을 용해. 이어서 13.067 ㎖의 5 mM의 암모늄 포르 메이트의 추가, pH는 아르곤으로 탈기 된 완충액 7.5 0.5 m를 제조M CEEC 솔루션입니다. </li><li> 모든 펩타이드가 용해 될 때까지 용액을 소용돌이. 7.5 × 10 -5 M CEEC 솔루션을 제공하는 1.5 ml의 microcentrifuge 관에, pH가 7.5 버퍼를 CEEC 솔루션 1.125 ml의 0.5 mm의 추가 0.375 ml의 5 ㎜의 포름산 암모늄. 소용돌이 혼합 때까지. </li></ol> 수은 (II) 및 CEEC 솔루션의 다양한 반응 혼합물의 제조 6 <ol><li> (1)의 제조 : 수은 (II)의 비율이 0.5 : CEEC 용액 <ol><li> 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 5 밀리미터 포름산 암모늄, pH가 7.5 버퍼의 255 μl를 놓습니다. 포름산 암모늄 완충액 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 7.5 X10 -4 M 수은 (II) 클로라이드 용액 30 μL를 추가한다. </li><li> 10 초에 대한 솔루션을 소용돌이. 그런 다음 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 7.5 × 10 -4 M CEEC 솔루션의 15 μl를 추가합니다. 섹션 4.1에 기재된 바와 같이 유사한 방식으로 반복한다. </li></ol></li><li> 수은 (II)의 1의 비율 : 1의 제조 CEEC 솔루션 <ol><li> (240)를 배치81; 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 5 mM의 암모늄 포르 메이트, pH가 7.5 완충액 L. 포름산 암모늄 완충액 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 7.5 X10 -4 M 수은 (II) 클로라이드 용액 30 μL를 추가한다. </li><li> 10 초에 대한 솔루션을 소용돌이. 그런 다음 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 7.5 × 10 -4 M CEEC 솔루션의 30 μl를 추가합니다. 섹션 4.1에 기재된 바와 같이 유사한 방식으로 반복한다. </li></ol></li><li> 수은 (II)의 비율이 2 : 1의 제조 CEEC 용액 <ol><li> 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 5 밀리미터 포름산 암모늄, pH가 7.5 버퍼의 210 μl를 놓습니다. 포름산 암모늄 완충액 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 7.5 X10 -4 M 수은 (II) 클로라이드 용액 30 μL를 추가한다. </li><li> 10 초에 대한 솔루션을 소용돌이. 그런 다음 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 7.5 × 10 -4 M CEEC 솔루션의 60 μl를 추가합니다. 섹션 4.1에 기재된 바와 같이 유사한 방식으로 반복한다. </li></ol></li></ol> 7. AnalyOrbitrap ESI 질량 분광기 수은 (II) 및 CGGC 샘플의 반응 혼합물 쌩쌩 <ol><li> ESI 질량 분석기 (16)을 준비 <ol><li> 500 μL 유리 주사기로 교정 표준 100 μL를 그린다. </li><li> , MS 펌프의 주사기 크래들에 주사기를 놓고 튜브를 부착하고, 질량 분광 광도계에 주입. </li><li> 파일 아이콘을 선택하고, 파일 이름을 입력하여 실행을 위해 파일 이름을 설정한다. </li><li> 데이터 수집 모듈에서 획득 데이터 버튼을 선택하고 150 스캔을 수집합니다. </li><li> 소프트웨어의 데이터 처리 모듈을 열어 교정 기준을 확인하기 위해 크로마토 그램을 분석한다. 모듈을 열고 메뉴를 파일로 이동하여 &quot;열기&quot;를 선택하고 대화 상자에서 파일을 선택합니다. 크로마토 그램의 피크가 표준 비율을 충전 질량에 상관 관계가 있는지 확인합니다. </li><li> 500 μL를 HPLC 등급 메탄올을 그려 500 μL 유리 주사기를 청소하고 다음 m를 분배비이커에 에탄올. </li><li> 유리 주사기에 HPLC 등급 메탄올 500 μL를 그려 단계 7.1.2에 따라 시스템을 세척하십시오. </li><li> 매개 변수를 설정하기위한 방법의 소프트웨어 설정 모듈을 선택한다. 스캔 모드 메뉴를 선택하고 FTMS와 분석기를 식별 한 후 &quot;확인&quot;을 클릭합니다. 시스 가스 유량 : 10, 소스 온도 : 0, 모세관 전압 : 37 V 튜브 렌즈 : 95 V, 분무 전압 : 4.20 kV로 다음 실시간보기 스펙트럼 페이지에 다양한 아이콘을 클릭하면, 다음과 같은 파라미터를 설정할 , 흐름은 10.00 μL / 분, 분석 평가 : FTMS, 검색 수 : 150. </li></ol></li><li> ESI 질량 분석기에 CGGC 샘플 러닝 <ol><li> 5 mM의 포름산 암모늄의 pH 7.5 버퍼를 실행합니다. <ol><li> , 500 μL 유리 주사기에 5 mM의 포름산 암모늄 버퍼의 500 μl를 놓고 MS 펌프의 주사기 크래들에 배치하고, 튜브를 연결합니다. </li><li> 1 ~ 2 분 동안 튜브를 통해 버퍼를 실행합니다. </li><li> 실행의 파일 이름을 설정파일 아이콘을 선택하고, 파일 이름을 입력하여. </li><li> 모듈에서 획득 데이터 버튼을 선택하고 150 스캔을 수집합니다. </li><li> 150 스캔이 수집 한 후 수집을 중지하려면 실행 버튼을 클릭합니다. </li><li> 데이터 브라우저 모듈을 연 다음 파일 (File) 메뉴로 이동하여 &quot;열기&quot;를 선택하고 대화 상자에서 파일을 선택합니다. 483, 683, 1163 및 1,363m / Z에서 더 피크가 펩타이드 또는 수은 (II) -peptide 단지를 닮은 그 존재하지 않는 것을 확인합니다. </li></ol></li><li> 0.5 수은 (II) : CGGC 비율 솔루션 (1)을 실행합니다. <ol><li> 0.5 수은 (II) : 주사기로 시료의 CGGC 비율 1의 250 μl를 놓습니다. </li><li> 튜브 및 주요 장치를 부착, MS 펌프의 주사기 크래들에 주사기를 놓습니다. </li><li> 파일 아이콘을 선택하고 파일 이름을 입력하여 실행 파일 이름을 선택합니다. </li><li> 데이터 수집 모듈에서 획득 데이터 버튼을 눌러 150 스캔을 수집하고 수집을 중지하려면 실행 버튼을 클릭합니다. </li><li> 모듈을 열고 메뉴를 파일로 이동하여 &quot;열기&quot;를 선택하고 대화 상자에서 파일을 선택합니다. 크로마토 그램 혼자 CGGC 펩타이드에 대한 것을 포함하여 피크가 포함되어 있는지 확인합니다. </li><li> 500 μL 포름산 암모늄 완충액으로 흡인하고 비이커에 포름산 암모늄 버퍼를 분배하여 주사기 씻는다. </li><li> MS의 폐기물 버튼을 선택하고 튜브 500 μL 포름산 암모늄 버퍼로 3 회 세척하십시오. </li><li> 비이커에 메탄올을 분배 한 후 500 ㎕를 메탄올로 흡입에 의해 주사기를 씻으십시오. </li><li> 500 μL 메탄올 튜브를 한 번 플래시합니다. </li><li> MS에로드를 선택 검출기 버튼을 누릅니다. </li><li> 주사기에 포름산 암모늄 버퍼의 500 μl를 추가합니다. </li><li> 튜브 및 주요 장치를 부착, MS 펌프의 주사기 크래들에 주사기를 놓습니다. </li><li> 파일 아이콘을 선택하고, 파일 이름을 입력하여 실행하는 상기 버퍼의 파일 이름을 선택한다. </li><li> 프레스취득 데이터 버튼을 누르고 150 스캔을 수집 한 다음 정지 실행 버튼을 클릭합니다. </li><li> 데이터 브라우저 모듈을 열고 메뉴를 파일로 이동하여 &quot;열기&quot;를 선택하고 대화 상자에서 파일을 선택합니다. CGGC 실행 : 크로마토 그램 이전 수은에서 피크의 무효 확인합니다. </li></ol></li><li> 1 수은 (II) : CGGC 비율 솔루션 (1)을 실행합니다. <ol><li> 주사기에 CGGC 비율 샘플 : 1 수은 (II) : 1 250 μl를 놓습니다. </li><li> 7.2.2.15 스텝 7.2.2.2에 기재 한 것과 유사한 방식으로 반복한다. </li></ol></li><li> 2 수은 (II) : 1을 실행 CGGC 비율 솔루션 <ol><li> 주사기에 CGGC 농도 샘플 : 2 수은 (II) : 1 250 μl를 놓습니다. </li><li> 7.2.2.15 스텝 7.2.2.2에 기재 한 것과 유사한 방식으로 반복한다. </li></ol></li></ol></li></ol> 8. Orbitrap ESI 질량 분석에 의해 반응 혼합물 및 수성 CEEC 샘플 분석 <ol><li> ESI 질량 분석기에 시료를 실행 CEEC <ol><li> 반복 분석 절차 (단계 7.1-7.2) CEEC 샘플 및 다양한 화학 양론 비로 수은 (II) 및 CEEC의 반응 혼합물을 사용. </li></ol></li></ol>

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There is no disclosure for the work reported.

소수성 dicysteinyl의 테트라 CGGC (C 10 H 18 N 4 O 5 S 2; MW는 = 338) (도 1), 수은과 복합체를 형성한다 (II)도 2에 도시되고 표 1 또한, 펩티드 이량 체 및 삼량 체를 형성하고있다.이 점진적 반응 혼합물 중의 펩티드의 양이 증가 등. m / z에 연결된 이량 체의 값 [(2M + H) + = 677] 및 삼량 체에 의해 도시 된 바와 같이 [(3M + H)은 + = 1,015] CGGC의 티올 그룹은 실험 조건 하에서 다이 설파이드를 형성하도록 산화 않았다 . 이러한 관련 CGGC 종의 형성은이 테트라의 소수성으로 인해이 될 수 있습니다. 1 수은 (II) : 펩티드 및 1 : (II) :( 펩티드 2 수은) 이전 dicysteinyl의 트리 펩티드 7보고 2 착물 CGGC 1에 대응하는 수은 단지 두 가지 유형을 형성한다. 그러나, 초과 또는 동등 수은 (II)의 존재 하에서, 또한, FORMS 2 : 2 수은 (II)] 2 : (펩티드) 2 착물. 카르 dicysteinyl의 테트라 CEEC (C 16 H 26 N 4 O 9 S 2, MW = 482) 수은 (그림 1) 양식 단지 (II) 그림 3과 표 1 그것은으로 쉽게으로 CEEC 이량 체를 형성하지 않았다있다. 즉, 소수성 CGGC에 대한 관찰. 1 수은 (II) : 펩티드 및 1 : 2 수은 (II) :( 펩티드) 2 착물 CGGC 필적, 그것은 수은 1로 대응하는 복합체를 형성한다. 2 수은 (II)] 2 : (펩티드) 2 착체보다 용이하지만, 보조 카복실 기와, 상기 2를 형성한다. 1 수은 (II)] 2 : 펩티드 복합체와 4 : 또한, 과량의 수은, 그것은 2 형성 2 수은 (II)] 4 : CGGC 관찰되지 않았다 (펩티드) 2 펩티드 복합체. 단지 F에 대한 관찰 된 신호의 요약ORMED m / z 값은 표 1에 도시 된 바와 같다. <img alt="표 1" src="/files/ftp_upload/53536/53536table1.jpg" /> 표 수은 펩타이드 복합체 신호 1. 개요. 포름산 암모늄 버퍼, 산도 7.5의 LTQ / Orbitrap MS 크로마토 그램의 수은 펩타이드 복합체 신호. 펩티드뿐만 아니라 dicysteinyl의 테트라 보조 결합 기의 존재 : 우리는 수은 (II)과의 두 dicysteinyl tetrapeptides의 반응은 수은 (II)의 비율이 초기에 종속 된 복합체를 형성하는 것을 보여 주었다. 또한, 특정 전기 분사 이온화 조건 하에서 형성된 복합체 수은 및 펩티드의 정확한 화학량 별개 수은 동위 원소 분포 패턴에 따라 고분해능 ESI 질량 분석법을 사용하여 결정될 수있다. 시스 테닐 pept 반응에서수은 (II)와 IDE는, 예방 조치는 이황화 결합을 형성하는 시스 테닐 티올 기의 산화를 방지하기 위해주의해야한다. 설명 프로토콜 내 완충액 신중 탈기시키고 아르곤하에 저장된다. 또한, 모든 샘플은 반응 즉시 ESI 질량 분광기 분석 전에 제조된다. 두 tetrapeptides, CEEC CGGC 및 용해도 사이의 차이에 의해, 다른 농도의 스톡 용액을 제조 하였다. CGGC 펩타이드 냉동실 스톡 아세토 니트릴 습윤시키고 쉽게 5mM의 포름산 암모늄 완충액, 7.5 X 10-4 M CGGC 용액을 제조하여 pH 7.5 다음에 용해시켰다. CEEC는 낮은 농도로 제조 한 7.5 × 10 -5 M, 이전에 수은 (II) 때문에 낮은 용해성 펩티드 반응 혼합물 단계. 수은 분석을위한 최적의 희석 (II) 단지 때문에 펩티드의 허용에 대한 용해도 10 -5 M 것으로 간주되었다질량 분석기에서 잔류 물을 제거합니다. CGGC 솔루션 계약에서 CEEC 잔류 물은 가끔 튜브 교체를 필요로 튜브, 준수합니다. 수은 - 펩타이드 복합체의 분석 ESI 질량 분광법을 이용한 분석의 중요성은 부드러운 이온화에있다. 이것은 무시할 조각화 분자 이온의 분석을 용이하게한다. 이 연구에서 나타난 바와 같이, 이것은 서명 수은 동위 원소 분포 패턴에 따라 수은 - 펩타이드 복합체의 화학 양론을 특성화하는데 사용될 수있다. 그러나, 휘발성 버퍼 시스템은 ESI 질량 분광법에 의한 분석을 위해 필요하다. 이 용해 적은 휘발성 용매 또는 버퍼링 매체를 필요로 분석을 식별하기위한 실용적인 사용을 제한 할 수 있습니다. 우리는 이전에 언급 된 바와 같이 7,8, ESI 질량 분광법은 수은 pept의 화학량 론의 정확한 측정을위한 민감성 분석 도구를 제공한다특정 전기 분사 이온화 조건 하에서 수은 - 펩타이드 복합체의 IDE. 그러나, 추가의 방법을 사용할 필요가있다 (예를 들면, 1 H, 13 C는 199 수은 NMR 스펙트럼 확장, X 선 흡수 미세 구조, 또는 전위차 17-18) 착물의 함유량의 더욱 정확한 결정을 제공하는 해결책. 우리 orbitrap ESI 질량 분석기가 수은 - 펩타이드 복합체를 분석하는데 사용될 수 있다는 것을 보여 주었다. 우리는이 기술은 다른 금속 이온과 다양한 작은 화합물과의 착체의 분석을 향해인가 될 수 있음을 예상한다. 이것은 다른 동위 원소 형태로 존재할 수있는 다른 금속 이온에 의해 형성된 복합체를 분석에 특히 유용 할 것이다.

Current clinical drugs prescribed for chelation therapy of mercury poisoning1 contain thiol group(s), which is/are responsible for binding and sequestering mercury ions2,3. However, studies have shown that these small thiol compounds [dimercaptosuccinic acid (DMSA) and dimercaptopropane-sulfonic acid (DMPS)] are not optimal for mercury chelation therapy4-6. Therefore, there is a need to understand the association and complex formation tendencies of mercury with thiols to enhance the rational drug design of thiol compounds for mercury chelation. Recently, we reported that n-alkyl and aryl dicysteinyl tripeptides with dithiol groups can serve as effective "double anchors" to accommodate the coordination sites of mercury(II) to form 1:1 mercury(II):peptide and 1:2 mercury(II):(peptide)2 complexes7. Additionally, we studied the effect of increasing cysteinyl residues on complex type formations8. In this study, we investigate the association of mercury(II) with two dicysteinyl tetrapeptides, where the cysteinyl residues are separated by two amino acid residues. In order to evaluate the effect of auxiliary binding groups for mercury, the intervening amino acids are either two glycine (unsubstituted) residues or two glutamic acid (gamma-carboxylated) residues. 
The reaction of cysteinyl peptide with mercury(II) requires conditions that will prevent the oxidation of the cysteinyl thiol groups to form disulfide bonds9. Moreover, the association of mercury(II) with cysteinyl peptides to form various types of mercury-peptide complexes is dependent on the initial ratio of mercury(II): peptide in the reaction mixture7,8. The types of mercury-peptide complexes formed in these reaction mixtures can be analyzed by soft-ionization mass spectroscopy, which is a sensitive analytical tool for determining species interactions between metal ions and peptides10-14. Accordingly, it will provide a profile of the various types of mercuriated peptide adducts that are formed under a specified electrospray ionization condition. Here, we will show how cysteinyl peptides and mercury(II) chloride solutions can be prepared in degassed ammonium formate buffer solution blanketed with argon to minimize oxidation. By reacting varying mole equivalents of mercury(II) with dicysteinyl tetrapeptides, we will show how the initial ratio of mercury(II):peptide has an effect on the types of complexes formed. We will also show how electrospray ionization (ESI) mass spectrometry can be used as a characterization tool to provide an accurate stoichiometry of mercury to peptide in the complexes formed. The associated video protocol will demonstrate the experimental conditions for preparing the mercury complexes, the procedure for analyzing the reaction mixtures under specified electrospray ionization conditions, and the characterization of the stoichiometries of mercury(II)-dicysteinyl tetrapeptide complexes, based on the distinct mercury isotope distribution patterns, by using the ChemCal program15. It is intended to assist those who are interested in using ESI orbitrap mass spectrometry to analyze various complexes formed by metal ions that exist in different isotopic forms.

<table><tbody><tr><td>Mercury(II) chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>429724</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>Ammonium formate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516961</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide</td><td>Fisher</td><td>A512-P500</td><td></td></tr><tr><td>HPLC water</td><td>Fisher</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Acetonitrile</td><td>Fisher</td><td>BP2405-1</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Methanol</td><td>Fisher</td><td>A452-4</td><td></td></tr></tbody></table>

a study of the complexation of mercury(ii) with dicysteinyl tetrapeptides by electrospray ionization mass spectrometry

In this study we evaluated a method for the characterization of complexes, formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptide, by electrospray ionization orbitrap mass spectrometry. This strategy is based on previous successful characterization of mercury-dicysteinyl complexes involving tripeptides by utilizing mass spectrometry among other techniques. Mercury(II) chloride and a dicysteinyl tetrapeptide were incubated in a degassed buffered medium at varying stoichiometric ratios. The complexes formed were subsequently analyzed on an electrospray mass spectrometer consisting of a hybrid linear ion- and orbi- trap mass analyzer. The electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) spectra were acquired in the positive mode and the observed peaks were then analyzed for distinct mercury isotopic distribution patterns and associated monoisotopic peak. This work demonstrates that an accurate stoichiometry of mercury and peptide in the complexes formed under specified electrospray ionization conditions can be determined by using high resolution ESI MS based on distinct mercury isotopic distribution patterns.

<html> 연구는 ESI 질량 분석에 의해 두 tetrapeptides, CGGC 및 CEEC (그림 1)에 사용할 수있는 수은 펩타이드 복합 성분의 특성을 실시 하였다. CGGC 또는 CEEC 수은 (II) 착물은 수은의 혼합물의 반응에 의해 조사 하였다 (II) 및 세 개의 다른 몰비에서 펩티드 용액 : 1 : 0.5, 1 : 1 및 1 : 2 ((II) 수은 : 펩티드) . 수은의 농도 (II)는 7.5 × 10 -6 M이고 펩티드 농도는 그에 따라 변할. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53536/53536fig1.jpg" /> 그림 1. Dicysteinyl 펩타이드 구조. dicysteinyl의 tetrapeptides, CGGC 및 CEEC의 화학 구조. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53536/53536fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 1 &quot;&gt; :&quot;유지 - together.within 페이지 = FO &quot;천만에 <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53536/53536fig2.jpg" /> 수은도 2 ESI MS (II)와, 포름산 암모늄 완충액 2+ 수은 변화 함유 pH를 7.5 7.5 X 10-6 M 수은 2+ 함유 용액으로부터 CGGC 전자 분무 이온화 orbitrap 질량 스펙트럼 : CGGC 화학량 론적 비율 :. (A ) 1 : 0.5 비율, (B) 1 : 1의 비율, 및 (C) 1 : 2의 비율. 세트가 지정된 수은 펩타이드 복합체의 수은 동위 원소 패턴을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53536/53536fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53536/53536fig3.jpg" /> 그림 3. ESI 수은의 MS (II) 및 CEEC. 에서 전기 분무 이온화 orbitrap 질량 스펙트럼포름산 암모늄 버퍼 pH가 2+ 수은 가변 함유 7.5 7.5 X 10-6 M 수은 2+ 함유 용액 : CEEC 화학량 론적 비율 : (A) 1 : 0.5 비율, (B) 1 : 1의 비율, 및 (C) (1) : 2 비율. 세트가 지정된 수은 펩타이드 복합체의 수은 동위 원소 패턴을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53536/53536fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 전기 분무 이온화 orbitrap 질량 크로마토 그램 (II) 화학 양론 비 펩티드 다양한 머큐리 CGGC (도 2)과 CEEC 수은 (II) 착물 (도 3)를 위해 수집 하였다 (1 : 0.5, 1 : 1 및 1 : 2). 관찰 수은 펩티드 복잡한 유형은 복잡한 수은 이온의 개수뿐만 아니라 depro의 수를 결정하는데 사용되는 별개의 동위 원소 수은 피크 (세트)를 보여tonations. 예를 들어, 그림 1b 인세는 수은의 일곱 주요 자연적으로 발생하는 동위 원소에 해당하는 펩타이드 수은 부가 물에 수은 동위 원소의 서명을 보여줍니다 196 수은 (0.146 %), 198 수은 (10.02 %), 199 수은을 (16.84 %) , 괄호 안의 %의 자연 존재비 200 수은 (23.13 %), (201) 수은 (13.22 %), (202) 수은 (29.80 %), (204) 수은 (6.85 %). 두 가지 동위 원소 200 수은, 202 수은은 2.3 별개의 상대 강도 비율을 보여 3. 따라서 이와 수은 동위체 클러스터의 가장 강한 피크가 동위 부가 (m / z = 539)를위한 모노 이소 ​​토픽 질량을 구성한다. 그것은 두 개의 좌표 형성하는 두 시스 테닐 티올의 탈 양성자 화에 의해 형성되는 착체 [(CGGC-2H +에 Hg) + H] + 부가 물과 상관. 이는 다음과 같이 해석된다 : [(CGGC-2H + 수은) + H] +에 대한 M / Z 값은 EQU입니다(- 2 + 202 + 1 338) = 539에 알. 도 1a의 인셋은 [(2CGGC-4H + 2Hg) + H] + (도 4)에 대한 ChemCal 프로그램을 사용하여 계산 된 두 수은 착체에 해당 펩티드 - 수은 부가 물에 수은 동위 원소 기호를 나타낸다. 이론적 양성자 화 된 모노 이소 토픽 질량이 계산 동위 클러스터 아홉째 동위 피크는 1077.061의 m / z 값에 대응한다.도 1a 인세는 아홉 번째 피크 1077.1의 m / z 값에 대응하는 동위 원소의 피크를 나타낸다 관찰 된 동위 원소 클러스터. 따라서,이 동위 원소 클러스터에 대한 발신 부가 물 [(2CGGC-4H + 2Hg) + H] +에 대해 할당 될 수있다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53536/53536fig4.jpg" /> [(2CGGC-4H + 2Hg) + H] 그림 4. 이론 동위 원소 패턴 + </SUP&gt;. (2CGGC-4H + 2Hg) + H] +에 대한 이론적 인 동위 원소 패턴 ChemCal 프로그램을 사용하여 계산. 화살표는 모노 이소 토픽 피크를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53536/53536fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53536/53536fig5.jpg" /> 그림 5. 양이온 부가 물. 수은 펩타이드 복합체와 관련된 일부 양이온 나트륨과 칼륨 부가 물. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53536/53536fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 도 5는 CGGC 형성 수은 - 펩타이드 복합체와 관련된 일부 양이온 화 나트륨 및 칼륨 부가 물을 나타낸다. Sodiated 부가 물 22 질량 단위 큰 T입니다한강은 칼륨 부가 물 38 질량 단위가 큰 반면, 양성자 수은 CGGC 단지 해당. 지배적 인 양성자 CGGC 이량 체 (M / Z = 677)도 양이온 나트륨과 종 (M / Z = 699)과 칼륨 이온을 형성한다 (M / Z = 715). 이것은 상기 양성자 화 또는 양이온 화 된 부가 물을위한 두 질량 단위 감소 이어질 것이다 이황화물을 형성 시스 테닐 티올 기의 산화없이 CGGC 이합체의 형성을 확인한다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53536/53536fig6.jpg" /> 그림 6. 중복 +1이 충전 상태. 수은 펩타이드 이온 [(CEEC-4H + 2Hg) + H]와 + 1 및 2 충전 상태에 관련된 중복 봉우리. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53536/53536fig6large.jpg" target="_blank">더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의.</a> <img alT = &quot;그림 7&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 53536 / 53536fig7.jpg&quot;/&gt; [(CEEC-4H + 2Hg) + H] +. [(CEEC-4H + 2Hg) + H]에 대한 이론적 인 동위 원소 패턴을도 7 이론적 동위 원소 패턴 + ChemCal 프로그램을 사용하여 계산. 화살표는 모노 이소 토픽 피크를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53536/53536fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 1과 2 담당 수은 CEEC 부가 물과 관련된 피크를 겹쳐 6은 그림. 그것은 계산으로 두 수은 복잡와 일치한다 수은 펩타이드 이온 [(CEEC-4H + 2Hg) + H]와 + 1 충전 및 883이의 M / Z 값에 연관되어 동위 원소 피크를 보여줍니다 [(CEEC-4H + 2Hg) + H] ChemCal 프로그램 (도 7)를 사용하여 +. 이론적 양성자 모노 이소 ​​토픽질량은 883.032의 M / Z 값에 해당합니다. 883.03의 모노 아이소 토픽 피크와 상기 관찰 [(CEEC-4H + 2Hg) + H] + 부가 물 0.5 질량 부가 단위를 나타내는 대응하는 피크를 포함하는 다른 부가 물과 중첩. orbitrap 질량 분석 기기에 의해 달성되는 매우 높은 해상도로, 이들 겹치는 피크 +2의 전하로 부가 물에 대응한다고 가정 할 수있다. 따라서, 모노 이소 토픽 질량의 복잡한 중첩 다음과 같이 계산 될 수있다 이온화된다. 8 동위 피크 사이의 m / z 차는 0.5이고, 그들 사이의 질량의 차이는 1 AMU임을 보여준다. 그러므로, 충전 상태가 +2이다. 수은 - 펩타이드 복합체의 질량을 계산하는, 모노 아이소 토픽 피크에 대한 m / z는 충전 상태를 곱한 값, 및 양전하를 띤 이온 착물을 만든 두 양성자의 질량으로부터 감산된다. &quot;1&quot;&gt;이 부가 물에 대한 계산 : 동위 원소 피크 사이의 M / Z의 차이는 0.5 동위 피크 사이의 질량 차이 인 1 AMU (1 중성자) 0.5 = 2에 의해 Z는 = 1 분할 양성자 모노 이소 토픽 피크에 대한 M / Z는 (883.53 × 2)입니다 - 2 = 1765.06 양성자 화 된 모노 이소 토픽 피크 [(2CEEC-8H 4Hg +) + H] +에 대한 상기 m / z 값은 1765.056 (도 8)로 ChemCal 프로그램에 의해 계산 된 이론 값과 일치한다. <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/53536/53536fig8.jpg" /> 그림 8. 이론적ChemCal 프로그램을 사용하여 계산 된 [(2CEEC-8H 4Hg +) + H] +. [(2CEEC-8H 4Hg +) + H]에 대한 이론적 인 동위 원소 패턴 +에 대한 동위 원소 패턴. 화살표는 모노 이소 토픽 피크를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53536/53536fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> ESI 질량 분광계 orbitrap 수은 - 펩타이드 복합체를 분석의 장점은 전술 한 바와 같이 각 이온의 전하가 용이하게 할당 될 수 있다는 것이다. 기본 아미노 - 말단을 포함하는 펩타이드 쉽게 양전하를 안정화 할 수 있습니다. 이러한 orbitrap 이상, +1 전하를 가진 펩타이드 이온의 전하 상태로 전기 분무 이온화, 고분해능 질량 분석기를 사용하여 측정하면 더욱 용이 질량 분석기 iontrap 낮은 해상도에 비교 될 수있다. (도 3a 및도 6)과 연관된 중복 피크는 탠덤 MS로 분석 하였다. 이 얻어진 신호는 상술 한 바와 같이 기대 화합물에 속하는, 수은 대 비율보다 높은 펩티드 농도에서 형성된 생성물 클러스터되지 않은 것으로 표시된 임의의 MS-MS 단편화를 나타내지 않았다.

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A Study of the Complexation of MercuryII with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

The characterization of complexes formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptides by electrospray ionization orbitrap mass spectrometry is presented.

전자 분무 이온화 질량 분석에 의해 Dicysteinyl Tetrapeptides와 수은 (II)의 복합체 형성에 관한 연구

In this study we evaluated a method for the characterization of complexes, formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptide, ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

A Study of the Complexation of Mercury(II) with Dicysteinyl Tetrapeptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry

7.8K 조회수.  University of North Carolina at Greensboro. The characterization of complexes formed in different relative ratios of mercury(II) to dicysteinyl tetrapeptides by electrospray ionization orbitrap mass spectrometry is presented.

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Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Physical interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane protein complexes and in dynamic processes such as transmembrane (TM) signaling and regulation of cell-surface protein levels. Understanding the structural features driving the association of particular sequences requires sophisticated biophysical and biochemical analyses of TM peptide complexes. However, the extreme hydrophobicity of TM domains makes them very difficult to manipulate using standard peptide chemistry techniques, and production of suitable study material often proves prohibitively challenging. Identifying conditions under which peptides can adopt stable helical conformations and form complexes spontaneously adds a further level of difficulty. Here we present a procedure for the production of homo- or hetero-dimeric TM peptide complexes from materials that are expressed in E. coli, thus allowing incorporation of stable isotope labels for nuclear magnetic resonance (NMR) or non-natural amino acids for other applications relatively inexpensively. The key innovation in this method is that TM complexes are produced and purified as covalently associated (disulfide-crosslinked) assemblies that can form stable, stoichiometric and homogeneous structures when reconstituted into detergent, lipid or other membrane-mimetic materials. We also present carefully optimized procedures for expression and purification that are equally applicable whether producing single TM domains or crosslinked complexes and provide advice for adapting these methods to new TM sequences.

Biophysical and biochemical studies of interactions among membrane-embedded protein domains face many technical challenges, the first of which is obtaining appropriate study material. This article describes a protocol for producing and purifying disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes that are suitable for structural analysis by solution nuclear magnetic resonance (NMR) and other analytical applications.

구조 연구 생산 이황화 - 안정화 Transmembrane의 펩타이드 단지

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

연구

화학

Compact Quantum Dots for Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging is an important tool for understanding the mechanisms of biomolecular function and for visualizing the spatial and temporal heterogeneity of molecular behaviors that underlie cellular biology 1-4. To image an individual molecule of interest, it is typically conjugated to a fluorescent tag (dye, protein, bead, or quantum dot) and observed with epifluorescence or total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. While dyes and fluorescent proteins have been the mainstay of fluorescence imaging for decades, their fluorescence is unstable under high photon fluxes necessary to observe individual molecules, yielding only a few seconds of observation before complete loss of signal. Latex beads and dye-labeled beads provide improved signal stability but at the expense of drastically larger hydrodynamic size, which can deleteriously alter the diffusion and behavior of the molecule under study.
Quantum dots (QDs) offer a balance between these two problematic regimes. These nanoparticles are composed of semiconductor materials and can be engineered with a hydrodynamically compact size with exceptional resistance to photodegradation 5. Thus in recent years QDs have been instrumental in enabling long-term observation of complex macromolecular behavior on the single molecule level. However these particles have still been found to exhibit impaired diffusion in crowded molecular environments such as the cellular cytoplasm and the neuronal synaptic cleft, where their sizes are still too large 4,6,7.
Recently we have engineered the cores and surface coatings of QDs for minimized hydrodynamic size, while balancing offsets to colloidal stability, photostability, brightness, and nonspecific binding that have hindered the utility of compact QDs in the past 8,9. The goal of this article is to demonstrate the synthesis, modification, and characterization of these optimized nanocrystals, composed of an alloyed HgxCd1-xSe core coated with an insulating CdyZn1-yS shell, further coated with a multidentate polymer ligand modified with short polyethylene glycol (PEG) chains (Figure 1). Compared with conventional CdSe nanocrystals, HgxCd1-xSe alloys offer greater quantum yields of fluorescence, fluorescence at red and near-infrared wavelengths for enhanced signal-to-noise in cells, and excitation at non-cytotoxic visible wavelengths. Multidentate polymer coatings bind to the nanocrystal surface in a closed and flat conformation to minimize hydrodynamic size, and PEG neutralizes the surface charge to minimize nonspecific binding to cells and biomolecules. The end result is a brightly fluorescent nanocrystal with emission between 550-800 nm and a total hydrodynamic size near 12 nm. This is in the same size range as many soluble globular proteins in cells, and substantially smaller than conventional PEGylated QDs (25-35 nm).

We describe the preparation of colloidal quantum dots with minimized hydrodynamic size for single-molecule fluorescence imaging. Compared to conventional quantum dots, these nanoparticles are similar in size to globular proteins and are optimized for single-molecule brightness, stability against photodegradation, and resistance to nonspecific binding to proteins and cells.

단일 분자 이미징을위한 소형 양자 점

Single-molecule imaging is an important tool for  understanding the mechanisms of biomolecular function and for visualizing the  spatial and temporal ...

공학

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

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Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) measured at rapid time scales is uniquely suited to detect structures and hydrogen bonding networks that are briefly populated, allowing for the characterization of transient conformers in native ensembles. Coupling of HDX to mass spectrometry offers several key advantages, including high sensitivity, low sample consumption and no restriction on protein size. This technique has advanced greatly in the last several decades, including the ability to monitor HDX labeling times on the millisecond time scale. In addition, by incorporating the HDX workflow onto a microfluidic platform housing an acidic protease microreactor, we are able to localize dynamic properties at the peptide level. In this study, Time-Resolved ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (TRESI-MS) coupled to HDX was used to provide a detailed picture of residual structure in the tau protein, as well as the conformational shifts induced upon hyperphosphorylation.

Conformational flexibility plays a critical role in protein function. Herein, we describe the use of time-resolved electrospray ionization mass spectrometry coupled to hydrogen-deuterium exchange for probing the rapid structural changes that drive function in ordered and disordered proteins.

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Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

생화학

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for characterizing lyophilized formulations of protein therapeutics. Labeling followed by suitable proteolytic digestion allows the protein structure and interactions to be mapped with peptide-level resolution. Since the protein structural elements are stabilized by a network of chemical bonds from the main-chains and side-chains of amino acids, specific labeling of atoms in the amino acid residues provides insight into the structure and conformation of the protein. In contrast to routine methods used to study proteins in lyophilized solids (e.g., FTIR), ssHDX-MS and ssPL-MS provide quantitative and site-specific information. The extent of deuterium incorporation and kinetic parameters can be related to rapidly and slowly exchanging amide pools (Nfast, Nslow) and directly reflects the degree of protein folding and structure in lyophilized formulations. Stable photolytic labeling does not undergo back-exchange, an advantage over ssHDX-MS. Here, we provide detailed protocols for both ssHDX-MS and ssPL-MS, using myoglobin (Mb) as a model protein in lyophilized formulations containing either trehalose or sorbitol.

Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.

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Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, metal-binding interactions, and conformational shape. Coupling ESI with ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) provides an instrumental technique that allows for simultaneous measurement of a peptide&#8217;s mass-to-charge (m/z) and collision cross section (CCS) that relate to its stoichiometry, protonation state, and conformational shape. The overall charge of a peptide complex is controlled by the protonation of 1) the peptide&#8217;s acidic and basic sites and 2) the oxidation state of the metal ion(s). Therefore, the overall charge state of a complex is a function of the pH of the solution that affects the peptides metal ion binding affinity. For ESI-IM-MS analyses, peptide and metal ions solutions are prepared from aqueous-only solutions, with the pH adjusted with dilute aqueous acetic acid or ammonium hydroxide. This allows for pH dependence and metal ion selectivity to be determined for a specific peptide. Furthermore, the m/z and CCS of a peptide complex can be used with B3LYP/LanL2DZ molecular modeling to discern binding sites of the metal ion coordination and tertiary structure of the complex. The results show how ESI-IM-MS can characterize the selective chelating performance of a set of alternative methanobactin peptides and compare them to the copper-binding peptide methanobactin.

Ion mobility-mass spectrometry and molecular modeling techniques can characterize the selective metal chelating performance of designed metal-binding peptides and the copper-binding peptide methanobactin. Developing new classes of metal chelating peptides will help lead to therapeutics for diseases associated with metal ion misbalance.

금속 결합 올리고펩타이드의 금속 이온 인식 및 Redox 활성의 구조 및 메커니즘을 결정하기 위한 이온 이동성 질량 분광법 기술

Electrospray ionization (ESI) can transfer an aqueous-phase peptide or peptide complex to the gas-phase while conserving its mass, overall charge, ...

Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass spectrometry (MS) of complex molecules and their reactions on surfaces. DINeC is based on a beam of SO2 clusters impacting on the sample surface at low cluster energy. During cluster-surface impact, some of the surface molecules are desorbed and ionized via dissolvation in the impacting cluster; as a result of this dissolvation-mediated desorption mechanism, low cluster energy is sufficient and the desorption process is extremely soft. Both surface adsorbates and molecules of which the surface is composed of can be analyzed. Clear and fragmentation-free spectra from complex molecules such as peptides and proteins are obtained. DINeC does not require any special sample preparation, in particular no matrix has to be applied. The method yields quantitative information on the composition of the samples; molecules at a surface coverage as low as 0.1 % of a monolayer can be detected. Surface reactions such as H/D exchange or thermal decomposition can be observed in real-time and the kinetics of the reactions can be deduced. Using a pulsed nozzle for cluster beam generation, DINeC can be efficiently combined with ion trap mass spectrometry. The matrix-free and soft nature of the DINeC process in combination with the MSn capabilities of the ion trap allows for very detailed and unambiguous analysis of the chemical composition of complex organic samples and organic adsorbates on surfaces.

Neutral SO2 clusters of low kinetic energy (&#60; 0.8 eV/constituent) are used to desorb complex surface molecules such as peptides or lipids for further analysis by means of mass spectrometry using an ion trap mass spectrometer. No special sample preparation is required, and real-time observation of reactions is possible.

클러스터 유도 탈착/이온화 질량 분광법에 의한 표면에 대한 복잡한 분자 및 표면의 반응 분석

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of protein therapeutics and the determination of the conformational transition pathways critical for biological functions, ranging from molecular recognition to enzymatic catalysis. Hydrogen/deuterium exchange (HDX) reaction coupled with top-down mass spectrometric (MS) analysis provides a means to characterize protein higher-order structures and dynamics in a conformer-specific manner. The conformational resolving power of this technique is highly dependent on the efficiencies of separating protein states at the intact protein level and minimizing the residual non-deuterated protic content during the HDX reactions. 
Here we describe a capillary electrophoresis (CE)-based variant of the HDX MS approach that aims to improve the conformational resolution. In this approach, proteins undergo HDX reactions while migrating through a deuterated background electrolyte solution (BGE) during the capillary electrophoretic separation. Different protein states or proteoforms that coexist in solution can be efficiently separated based on their differing charge-to-size ratios. The difference in electrophoretic mobility between proteins and protic solvent molecules minimizes the residual non-deuterated solvent, resulting in a nearly complete deuterating environment during the HDX process. The flow-through microvial CE-MS interface allows efficient electrospray ionization of the eluted protein species following a rapid mixing with the quenching and denaturing modifier solution at the outlet of the sprayer. The online top-down MS analysis measures the global deuteration level of the eluted intact protein species, and subsequently, the deuteration of their gas-phase fragments. This paper demonstrates this approach in differential HDX for systems, including the natural protein variants coexisting in milk.

Presented here is a protocol for a capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange (HDX) approach coupled with top-down mass spectrometry. This approach characterizes the difference in higher-order structures between different protein species, including proteins in different states and different proteoforms, by conducting concurrent differential HDX and electrophoretic separation.

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

구조 질량 분광법에 의해 큰 단백질 단지 분석

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

생물학

Thermochemical Studies of Ni(II) and Zn(II) Ternary Complexes Using Ion Mobility-Mass Spectrometry

This article describes an experimental protocol using electrospray-ion mobility-mass spectrometry (ES-IM-MS) and energy-resolved threshold collision-induced dissociation (TCID) to measure the thermochemistry of the dissociation of negatively-charged [amb+M(II)+NTA]- ternary complexes into two product channels: [amb+M(II)] + NTA or [NTA+M(II)]-&#160;+ amb, where M = Zn or Ni and NTA is nitrilotriacetic acid. The complexes contain one of the alternative metal binding (amb) heptapeptides with the primary structures acetyl-His1-Cys2-Gly3-Pro4-Tyr5-His6-Cys7 or acetyl-Asp1-Cys2-Gly3-Pro4-Tyr5-His6-Cys7, where the amino acids&#39; Aa1,2,6,7 positions are the potential metal-binding sites. Geometry-optimized stationary states of the ternary complexes and their products were selected from quantum chemistry calculations (presently the PM6 semi-empirical Hamiltonian) by comparing their electronic energies and their collision cross-sections (CCS) to those measured by ES-IM-MS. From the PM6 frequency calculations, the molecular parameters of the ternary complex and its products model the energy-dependent intensities of the two product channels using a competitive TCID method to determine the threshold energies of the reactions that relate to the 0 K enthalpies of dissociation (&#916;H0). Statistical mechanics thermal and entropy corrections using the PM6 rotational and vibrational frequencies provide the 298 K enthalpies of dissociation (&#916;H298). These methods describe an EI-IM-MS routine that can determine thermochemistry and equilibrium constants for a range of ternary metal ion complexes.

Thermochemical Studies of NiII and ZnII Ternary Complexes Using Ion Mobility-Mass Spectrometry

This article describes an experimental protocol using electrospray-ion mobility-mass spectrometry, semi-empirical quantum calculations, and energy-resolved threshold collision-induced dissociation to measure the relative thermochemistry of the dissociation of related ternary metal complexes.