이 새로운 기술은 이온 이동성-질량 분석법과 분자 모델링 및 반응 역학 이론을 결합하여 삼원 복합체의 두 경쟁 해리 반응의 상대 열화학을 결정합니다. 이러한 기술의 조합은 반응물 및 생성물 반응 경로, 구조적 구조 및 금속 이온과 삼원 복합체를 형성하는 리간드의 친화력을 특성화합니다. 이 연구는 재조합 단백질 정제를 위한 두 개의 잠재적인 펩타이드 태그의 반응성을 모델링하며, 여기서 태그는 고정화된 금속 친화성 컬럼에서 니트릴로트리아세트산에 의해 킬레이트화된 금속과 반응합니다.
2 밀리리터 샘플을 2.5 밀리리터 무딘 코 주사기에 넣고 분당 10 마이크로 리터의 유속으로 기기의 주사기 펌프를 사용하여 기기의 전기 분무에 샘플을 주입하는 것으로 시작합니다. 기기를 음이온 이동도-질량 분석법 또는 IM-MS 모드로 설정합니다. 질량 분석 프로그램을 열고 스펙트럼을 선택하여 음전하를 띤 대체 금속 결합 삼원 복합체 또는 amb-metal-NTA 복합체의 질량-전하 동위원소 패턴을 식별합니다.
그런 다음 도구를 선택한 다음 동위원소 모델을 선택합니다. 팝업 창에서 복합체의 분자식을 나열하고 전하를 띤 이온 표시 확인란을 선택하고 음의 전하로 1을 입력하고 복합체의 표시된 동위 원소 패턴을 OK.In 클릭하고 가장 낮은 질량 피크를 확인합니다. 계측기 소프트웨어에서 설정을 선택한 다음 쿼드 프로파일을 선택합니다.
그런 다음 수동 고정(Manual Fixed)을 선택하고 가장 낮은 동위원소 패턴 피크의 질량을 입력합니다. 업데이트를 클릭하고 창을 닫습니다. 다시 설정을 선택한 다음 쿼드 해결을 클릭합니다.
5분의 실행 지속 시간 및 2초의 스캔 시간을 이용하여 첫 번째 전달 충돌 에너지부터 시작하는 음이온 IM-MS 스펙트럼을 수집한다. 반복하여 각각의 다른 충돌 에너지에 대한 IM-MS 스펙트럼을 수집합니다. 삼원 amb-metal-NTA 복합체와 NTA-금속 복합체 및 amb-금속 복합체의 두 제품에 대해 통합 도착 시간 분포 또는 ATD 영역을 활용하여 상대적 백분율 척도로 정규화합니다.
반복 임계값 충돌 유도 해리 또는 TCID 측정에서 각 데이터 포인트의 평균 및 표준 편차를 찾습니다. 그런 다음 실험실 프레임 전달 충돌 에너지를 질량 중심 충돌 에너지로 변환합니다. 충돌 단면을 측정하려면 기기 작동 조건을 사용하여 10분 동안 10ppm 폴리-DL-알라닌 또는 PA 샘플의 음이온 IM-MS 스펙트럼을 수집합니다.
이어서, 5분 동안 각 삼원 복합체의 IM-MS 스펙트럼을 수집한다. 각 PA 및 삼원 복합체의 ATD를 추출하고 드리프트 시간 유지 옵션을 사용하여 파일을 질량 분석 소프트웨어로 내보냅니다. 해당 ATD 곡선의 최대값에서 평균 도착 시간을 구합니다.
횡단면 보정 방법을 사용하여 평균 도착 시간을 삼항 복합체의 충돌 단면으로 변환합니다. CRUNCH 기본 메뉴에서 질량 중심의 에너지 또는 제품의 ECM 종속 상대 강도가 포함된 GB5 텍스트 파일을 엽니다. 아니요라고 응답하여 매개 변수를 읽습니다.
그런 다음 모델링을 선택한 다음 모든 매개 변수 설정을 선택합니다. 반응 모델 옵션에서 기본 임계값 CID 옵션을 선택한 다음 삼항 복합체의 에너지 전달 분포에 대한 적분을 사용하여 RRKM을 선택합니다. 모델링된 독립 제품 채널에 대해 2를 입력하고 횡단면 계산을 선택합니다.
비컨볼루션 모델 유형의 경우 충돌 셀에서 비행 시간 검출기까지의 50마이크로초 시간 창으로 인한 운동 이동의 통계적 RRKM 보정을 포함하는 0 켈빈 횡단면을 선택합니다. 컨벌루션 옵션의 경우, 삼항 복합 이온과 아르곤 충돌 기체 사이의 변환 에너지 분포에 대한 컨벌루션을 포함하는 Tiernan의 이중 적분을 선택합니다. 수치 적분 방법의 경우 미리 저장된 단면이 있는 가우스 구적법을 선택합니다.
분자 파라미터를 입력하는 옵션에서 G를 입력하여 삼항 복합체의 PM6 진동 및 회전 주파수로 구조 모델링 파일을 읽습니다. 질문에 예라고 대답하십시오:반응물 중 하나가 원자입니까? 모델링 파일의 위치와 이름을 씁니다.
이온 전하의 경우 1을 입력하고 아르곤 가스의 분극성에 대해 1.664를 입력합니다. 이온의 질량과 표적의 질량은 각각 삼항 복합체와 아르곤에 대한 것이며 GB5 텍스트 파일에서 자동으로 읽습니다. 고조파 진동의 경우 0을 입력합니다.
Enter 키를 눌러 구조 모델링 파일에서 1차원 및 2차원 회전 상수를 읽습니다. 힌더드 로터 처리의 경우 기본값 0을 선택하고 분자 대칭의 경우 1을 선택합니다. 반응물 온도에 대해 기본 300켈빈을 선택합니다.
상태 배열의 밀도를 줄이는 방법에 대해 통합을 선택합니다. 예를 선택하여 에너지 분포를 자릅니다. 분배를 위한 최대 에너지의 경우 40000 파수, 빈 크기의 경우 2개의 파수, 에너지 분포의 포인트 수에는 32를 입력합니다.
TCID/RRKM 모델에 대한 파라미터의 경우 변경에 대해 예를 선택하고 고정 시간에 0을 입력하고 탐지 창의 상한에 0.000050초를 입력합니다. 제품 채널 1의 경우 해리 채널 옵션에서 단일 전환 상태에 대해 1을 선택하고 순차 해리가 없는 경우 0을 선택합니다. 전환 상태 유형의 경우 궤도에 대해 1을 선택합니다.
G를 선택하여 amb-metal 컴플렉스와 NTA 제품에 대한 PM6 회전 및 진동 매개변수가 포함된 모델링 프로그램 파일을 읽습니다. 아니오를 입력하십시오 : 위상 공간 제한 전이 상태 또는 PSL TS 중 하나가 원자 종입니까? amb-metal 컴플렉스 파일의 위치와 이름을 입력합니다.
스케일 주파수에 1.062를 사용하고, 원자 수에 대해 Enter 키를 누르고, 아니오를 입력합니다:분자가 선형입니까? NTA 제품의 진동 및 회전 주파수가 포함된 모델링 파일에 대해 동일한 작업을 반복합니다. 궤도 TS에 대한 설명을 입력합니다. amb-metal 이온의 전하에 대해 1.0을 입력한 다음 NTA의 분극성과 쌍극자 모멘트를 입력합니다.
회전 온도의 경우 0 켈빈을 선택하고 궤도 전이 상태의 처리를 위해 잠긴 쌍극자를 선택합니다. amb-metal 이온과 NTA의 평균 질량을 입력합니다. Enter 키를 눌러 모델링 파일에서 1차원 및 2차원 회전 상수를 읽습니다.
방해 로터의 경우 0, 분자 대칭의 경우 1, 반응 축퇴의 경우 1을 선택합니다. 변경 없음 옵션을 입력합니다. 제품 채널 2의 경우 단일 전환 상태에 대해 1을 선택하고, 순차 해리에 대해 없음에 대해 0을 선택하고, 전이 상태 유형에 대해 궤도에 대해 1을 선택합니다.
NTA-금속 복합체 및 amb 제품에 대한 PM6 회전 및 진동 매개변수가 포함된 모델링 파일을 읽으려면 G를 선택합니다. 그런 다음 궤도 TS에 대한 설명을 입력합니다. NTA- 금속 착물 이온의 전하에 대해 1.0을 입력하고 amb의 분극성과 쌍극자 모멘트를 입력하십시오. 회전 온도로 0 켈빈을 선택하고 궤도 전이 상태를 처리하려면 잠긴 쌍극자를 선택합니다.
NTA- 금속 복합체 및 amb 제품의 평균 질량을 입력하십시오. Enter 키를 눌러 모델링 파일에서 1차원 및 2차원 회전 상수를 읽습니다. 방해 로터의 경우 0, 분자 대칭의 경우 1, 반응 축퇴의 경우 1을 선택합니다.
그런 다음 변경 사항 없음을 입력합니다. 비활성 2차원 회전을 처리하려면 통계적 각운동량 분포에 대한 기본 옵션을 선택하고 P-E, G over J 분포를 적분하십시오. 통합의 포인트 수에서 기본값 32를 사용합니다.
모형 메뉴에서 데이터에 맞게 모수 최적화를 선택하고 데이터 피팅을 시작하고 종료할 최소 에너지와 최대 에너지를 각각 입력합니다. 가중치 모델의 실험 표준 편차에 대해 1을 선택합니다. 데이터를 기반으로 일반적으로 0.01에서 0.001 사이의 최소 허용 표준 편차를 선택합니다.
E0 수렴 한계에 기본값을 사용하고 현재 값으로 매개변수를 유지하려면 아니요를 선택하고, 하한 및 상한에 대해 0.5 및 2.0 전자 볼트를, 파생 평가 방법에 대해 2를 선택합니다. 최적화 메뉴에서 최적화 시작을 선택합니다. CRUNCH 프로그램은 선택한 TCID 모델을 실험 데이터에 최적화합니다.
마지막으로 모델 메뉴에서 두 해리 채널의 열화학적 평가를 위해 T에서 delta-H 및 S를 선택합니다. 대표적인 이미지는 대체 금속 결합 A 및 H 펩티드의 1 차 구조를 보여줍니다. 색상은 잠재적인 금속 결합 부위를 강조 표시합니다.
amb-metal 및 NTA-metal 생성물 이온을 형성하기 위한 에너지 의존성이 여기에 나와 있습니다. 질량 중심 충돌 에너지, 여기서 amb-metal-NTA 삼원 복합체의 50% 해리가 그래프에 포함됩니다. 대표 이미지는 에너지 분해 TCID 방법의 동역학 모델을 보여줍니다.
ambH-아연-NTA 복합체와 아르곤 사이의 충돌은 ambH-아연 복합체와 유리 NTA 또는 NTA-아연 복합체와 유리 ambH 생성물로의 해리를 초래합니다. 임계 에너지 E1 및 E2는 ambH-아연-NTA 복합체에서 ambH-아연 복합체 및 유리 NTA 또는 ambH-아연-NTA 복합체에서 NTA-아연 복합체 및 유리 ambH로의 반응에 대한 해리의 0 켈빈 엔탈피와 같습니다. A와 H의 PM6 지오메트리 최적화 삼원 amb-metal-NTA 복합체가 여기에 나와 있습니다.
이러한 컨포머는 실험 데이터의 TCID 모델링에 사용되었으며 PM6 전자 에너지 및 IM-MS가 측정한 충돌 단면과 비교하여 계산된 충돌 단면을 비교하여 다른 후보 구조에서 선택되었습니다. 4개의 amb-metal-NTA 복합체의 에너지 분해 TCID가 이 이미지에 묘사되어 있습니다. 종 A 및 H의 경우, 복잡한 CRUNCH 임계 피팅을 갖는 amb-metal 및 NTA- 금속의 생성물 이온이 여기에 표시됩니다.
에너지 값은 amb-metal-NTA에서 amb-metal 및 free NTA 또는 amb-metaL-NTA에서 NTA-metal 및 free amb로의 반응에 대한 0 켈빈에서의 해리 엔탈피입니다. 몰당 킬로줄 단위의 Gibbs 자유 에너지 및 해리 엔탈피에서 파생된 형성 상수, 순 제로 켈빈을 PM6 매개변수를 사용한 정적 역학 계산과 비교한 것이 여기에 나와 있습니다. ambA-니켈-NTA 복합체를 형성하기 위한 NTA-니켈과 유리 ambA의 반응은 가장 높은 형성 상수를 나타내며 ambA-태그된 단백질이 친화성 컬럼 내부의 NTA-니켈에 의해 고정화되는 반응을 나타냅니다.
크런치 피팅은 정확한 임계 에너지를 얻기 위해 반응물과 생성물을 신중하게 스크리닝해야 합니다. 구조와 신뢰할 수 있는 분자 파라미터를 얻기 위한 분자 모델링에 대한 전문 지식이 필요합니다. 여기에 설명된 전체 방법은 효소 기능을 차단하기 위해 금속 보조인자 및 단백질의 활성 부위에 결합하도록 설계된 분자의 효과를 스크리닝하기 위해 개발될 수 있습니다.
