달팽이관 표면 제제는 면역 조직 화학 및 공초점 이미징을 사용하여 코르티 장기의 전체 렌즈를 시각화 할 수 있습니다. 그것은 광범위하게 관심의 특정 달팽이관 병리학의 조사에 사용되었습니다. 우리는 달팽이관 미세 절법을 수정합니다.
이 기술의 주요 장점은 여러 세척 단계 동안 조직 손실을 피하면서 면역 라벨링 절차를 위해 10mm 라운드 커버립으로 달팽이관 상피 조각을 준수하는 것입니다. 또한 달팽이관 병리학, 달팽이관 표면 제제는 또한 평가 발현 및 모발 세포 재생을 위해 활용될 수 있다. 이 기술에 기본적인 현미경 기술이 필요하며 방법의 시각적 데모는 각 단계가 올바르게 수행되도록 하는 데 도움이 될 수 있습니다.
절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 Qiaojun Fang이 될 것입니다. 측두골 추출의 경우 즉시 모템 후 피부를 앞쪽으로 당겨 두개골 뼈를 노출시키고 가위를 사용하여 두개골의 중앙 선을 따라 후방 측면에서 뼈를 자른다. 엄지 손가락과 검지 손가락을 사용하기 전에 뇌 조직을 제거하기 위해 집게를 사용하여 3 개월 이상의 마우스에서 측두골을 수동으로 제거하십시오.
뼈를 30mm 직경의 페트리 접시에 넣고 신선한 얼음 차가운 4% PFA및 PBS를 해부 현미경아래에 넣고 타원형 창에서 스테이프를 제거합니다. 5번 집게로 둥근 창막을 뚫고, 달팽이관 정점에 작은 구멍을 만들기 위해 신선한 4%PFA가 들어있는 1밀리리터 주사기에 부착된 27게이지 바늘을 사용합니다. 용액이 정점의 작은 구멍에서 세차질 될 때까지 둥근 창문과 타원형 창을 통해 고정 용액으로 코클레아를 부드럽고 천천히 견딜 수 있습니다.
그런 다음 최대 2개의 응고된 달팽이관을 유리병 당 4%PFA의 10밀리리터를 포함하는 개별 20 밀리리터 신경병 바이알로 옮기고 실온에서 2시간 동안 샘플을 부드럽게 교반하고 회전자에 섭씨 4도에서 하룻밤 을 보관합니다. 다음 날 아침, 코클레아를 세척당 신선한 PBS로 5분간 씻는다. 마지막 세척 후, 각 유리병에 4 %EDTA의 20 밀리리터를 추가하고 부드러운 동요와 섭씨 48 시간 동안 샘플을 회전.
인큐베이션의 끝에서, 샘플의 탄력성을 평가하기 위해 집게로 각 달팽이관의 뼈 전정 부분을 터치합니다. 뼈가 단단하지 않고 탄력있는 경우, 달팽이관은 탈질화되었습니다. 각 샘플에 대해 EDTA를 신선한 PBS로 교체합니다.
달팽이관 상피의 미세 절부의 경우, 측두골의 정전 부분을 집게로 잡고 메스를 사용하여 45도 각도로 정골 회전을 자른다. 둥근 창과 타원형 창 사이의 희미한 선을 따라 수직으로 잘라 달팽이를 전정 부분에서 분리하고 바질 회전으로 달팽이관 부분을 방향을 조정하여 페트리 접시의 상단을 향해 돌립니다. 이 위치에서, 중간 회전의 뼈 캡슐과 측면 벽을 파기하여 정단면이 제거된 끝으로 절단하고 중간 부분을 기초 및 후크 영역으로부터 완전히 분리하기 위해 절단을 계속한다.
바실라 멤브레인 부위를 접시의 바닥을 중심으로 바실라 멤브레인 부위를 배치하고, 후크 영역의 내측을 수직으로 잘라 내측을 제거하고 바질 및 후크 영역을 잘라 후크 부분을 분리합니다. 조직의 왜곡을 피하기 위해, 기저 회전 및 후크 영역의 분리 전에 후크 영역의 내측을 잘라. 뼈 캡슐과 중간 회전의 측면 벽 조직의 상대적으로 큰 부분을 잘라 페트리 접시의 바닥과 뼈 캡슐과 측면 벽을 정렬하는 집게와 측면 벽을 잡고, 바질라 막 측에서이러한 조직을 잘라.
다음으로, 표본을 평평하게 하여 감각적인 모발 세포 표면면을 위로 향하게 하고 뼈 캡슐과 측면 벽의 나머지 부분을 다듬습니다. 그런 다음 집게를 사용하여 지각 막을 제거하여 중간 부위를 완전히 분리하고 뼈 캡슐, 측면 벽 조직 및 남은 회전의 지각 영역을 방금 입증한 것처럼 제거합니다. 모든 달팽이관 회전이 해부되면, 세포 및 조직 접착제의 0.5 마이크로 리터를 1 라운드 10 mm 커버 슬립의 중앙에 확산하고 실온에서 3 ~ 5 분 동안 접착제가 건조 할 수 있습니다.
말린 커버립을 페트리 접시에 넣고 각 감각 상피 샘플 4개를 모두 하나의 커버슬립에 붙입니다. 그런 다음 집게를 사용하여 각 커버슬립의 한 가장자리를 파악하여 면역학 라벨링을 위한 4웰 세포 배양 접시의 개별 우물로 표본을 옮기는 다. 표면 달팽이관 시냅스 제제의 면역 라벨링을 위해, 각 감각 상피를 세척당 신선한 PBS로 5분 동안 3회 세척한 다음, 각 시료의 처리에 따라 회전기의 실온에서 30분 동안 2밀리리터2밀리리터를 처리합니다.
인큐베이션의 끝에서, 각 우물에서 계면 활성제 용액을 흡습하고 실온에서 부드러운 교반과 회전기에 1 시간 동안 잘 차단 솔루션의 100 마이크로 리터와 비특이적 결합을 차단합니다. 차단 인큐베이션의 끝에서, 빛으로부터 보호되는 섭씨 37도에서 24시간 동안 관심있는 1차 항체의 100 마이크로리터로 각 상피를 표시하기 전에 부드러운 동요 하에서 입증된 바와 같이 PBS로 샘플을 세 번 세척한다. 다음 날, 신선한 PBS와 세척당 부드러운 동요로 샘플을 세 번 세척하고 빛으로부터 보호되는 섭씨 37도에서 2시간 동안 관심있는 적절한 이차 항체의 100 마이크로리터로 표본을 라벨을 붙입니다.
인큐베이션이 끝나면 시료를 시료가 올려 놓는 개별 유리 현미경 슬라이드에 각 커버슬립을 놓기 전에 세척당 신선한 PBS에 3개의 5분 세척으로 샘플을 세척합니다. 다음으로 각 커버슬립의 중앙에 적절한 장착 매체8마이크로리터를 조심스럽게 추가하고 집게를 사용하여 각 샘플에 10mm 커버슬립을 더 장착합니다. 그런 다음 각 커버슬립 샌드위치의 측면을 명확한 매니큐어로 밀봉하고 샘플을 골판지 슬라이드 폴더에 넣고 슬라이드를 섭씨 4도에 보관합니다.
표면 준비를 위한 성인 마우스 달팽이관의 해부는 간단하지 않지만, 기술에 새로운 연구원은 10 에서 15 귀로 연습 한 후 방법을 배울 수 있어야합니다. CTBP2 및 GluA2를 가진 치료되지 않은 10-12주 된 CBAJ 마우스의 표면 제제의 면역 라벨링은 전시냅스 리본과 포스트냅스 말기 둘 다 각각 내부 모발 세포 핵 아래에 위치하고 기능성 시냅스를 나타내는 병치된다는 것을 보여줍니다. 미오신 7A에 대한 면역 라벨링 및 phalloidin 및 DAPI를 포함하는 카운터스테인링은 외부 모발 세포 및 내부 모발 세포 및 핵을 포함한 감각 모발 세포의 존재를 드러낸다.
미신 7A및 phalloidin을 사용한 반염색에 대한 면역 라벨링은 세포 및 조직 접착제의 사용 여부에 관계없이 면역 반응성 또는 균일성에 차이가 없음을 나타낸다. 또한, 6~8주 된 C57 블랙 6 마우스로부터 표면 제제의 전자 현미경 검사를 스캐닝하여 시료의 3열에서 외부 모발 세포의 잘 조직된 V자 형 스테레오시리아를 시연한다. 용액이 정점에 있는 작은 구멍에서 흘러 나올 때까지 둥근 창문과 타원형 창을 통해 고착용용으로 달팽이관을 천천히 채우는 것을 기억하십시오.
후크 영역을 기초 회전에서 분리하기 전에 후크 영역의 내측을 잘라 내측의 제거를 용이하게하십시오.
