Name: tissue characterization after a new disaggregation method for skin micro-grafts generation
Uploaded: 2016-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
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저자는 유동 세포 계측법 분석을 수행하는 연구에 기여에 대한 감사 박사 페데리카 Zanzottera를 바랍니다.

윤리 문 : 프로토콜의 임상 응용 프로그램이 환자의 피부자가 조직의 사용을 필요로하기 때문에, 시험 관내에서의 특성은 수확, 처리에 국가 규정의 지침에 따라 에밀리아 로마 냐 지역 스킨 은행에서 동종 피부 조직에 임상 적으로 사용되기 전에 수행 된 및 이식을위한 조직 (2013 CNT)를 배포. 임상 응용 프로그램 1. 바이오 복합 건물 주 :이 프로토콜은 임상 Rigeneracons (조직 장애 물질) 및 Rigenera 머신 (티슈 교란 시스템) (도 1A)의 사용에 기초한다. 조직 장애 물질은 약 50 미크론의 컷오프 육각형 블레이드 및 필터링 세포의 세포 외 기질 성분에 의해 제공되는 격자를 사용하여 조직의 작은 조각을 방해 할 인체 조직의 생물 의학적 장애 물질이다. <ol><li> BI를 통해 환자의 skinsamples를 수집opsy 펀치 (도 1b) 및 미세자가 이식 6,7,9을 얻기 위해 각각의 조각에 대한 생리 식염수 1 ㎖를 첨가들을 분해 (또는 단계 2.1 참조). </li><li> 콜라겐 스폰지에 마이크로 이식 1 ㎖를 놓습니다 (그림 1C) toform 바이오 단지 임상 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다. </li><li> 배양 5 % CO 2의 가습 분위기에서 37 ℃에서 10 % 태아 소 혈청으로 보충 된 DMEM 배지 6 ㎖의 존재하에 콜라겐 스폰지 마이크로 이식편의 다른 한 용액. </li><li> 배양 3 일 후, RT에서 10 분간 0.3 % 파라 포름 알데히드 바이오 복합체를 고정한다. 샘플에 직접 특정 디스펜서 파라핀을 붓고. 5 ㎛의 두께 마이크로톰으로 슬라이스를 구하여 유리 슬라이드에 직접 넣어. </li><li> 20 ml의 크실렌 (시판 - - m - 크실렌 (40의 혼합 - 65 %), p- 크실렌 (20 %), O - 크실렌 (20 % (15)를 포함하는, 조직 학적 분석을위한 유리는 5㎛ 파라핀 슬라이스 빠져 ) 및 ETH일 벤젠 (6~20%), 3 분마다 톨루엔, 트리메틸 벤젠, 페놀, 티 오펜, 피리딘 및 황화수소)의 흔적. </li><li> 디 paraffinizing 대한 다음 탈 이온수 (1 시간, 1 시간, 80 % 에탄올, 70 % 에탄올을 1 시간 동안 위해 1 시간, 100 % 에탄올, 95 % 에탄올) 에탄올 감소 학년 슬라이스 (100 % ~ 70 %)을 담가 및 섹션을 돌리는. </li><li> 1 1g / L Ematoxylin 2 ㎖ - - 1 섹션을 얼룩 2 분이어서 모든 Ematoxylin 흑자를 제거하기 위해 물에 헹군다. </li><li> 에탄올 70 % 혼합 농도의 1 %에 에오신 Y 알코올 용액을 5 분간 물에 희석 - 4 섹션을 얼룩. </li><li> 각 슬라이드 섹션 에오신 Y 2 ㎖ 및 실행 수돗물에서 헹구어 - 1을 사용합니다. </li><li> 에탄올의 성적을 증가 섹션을 빠져 기반 장착 mediumand 100X 배율 (그림 1D)에서 빛을 현미경으로 관찰과 함께 1 시간에 대한 크실렌의 통로, 커버 슬립 후, 마지막으로하고 (단계 1.6 참조). </li> &lt;/ OL&gt; 2. 컬렉션, 세분화 및 조직의 생체 외 분석에서 <ol><li> 피부 분절을 사용하여, 각각 0.6 mm, 1mm 또는 4 개의 다기관 및 / 또는 다중의 트렁크 영역에서 두께 2mm 독립적 피부 조직 유두 디 epidermized 진피 (DED) 또는 망상 진피 (진피) 걸릴 수확, 처리 및 이식을위한 조직을 배포에 국가 규칙 (CNT 2013) 다음 40~55년 범위에서 조직 기증자. <ol><li> 부드럽게 5 분 동안 궤도 통에 접시에 이르렀 0.9 % NaCl 용액에서의 모든 샘플을 씻어. </li><li> 5 mm 생검 펀치를 사용하여, 피부 조직, 진피와 DED 직경이 균일하며, 세분화 전에 모든 조직 표본 무게 샘플을 생성한다. </li><li> 세분화에 대한 생리 식염수 1.5 ml를 첨가 조직 장애 물질의 피부 조직, DED 또는 각각 진피의 팔, 서너 균일 한 샘플을 삽입합니다. </li><li> 다른 수행모든 조직 시료 세분화시기는 표 1에 나타내었다. </li><li> 컨트롤과 같은 손상 조직 샘플에서 파생 된 펀치 생검의 상대방 번호를 사용합니다. </li><li> 기계적 세분화 후 별도로 12 웰 플레이트의 한 웰에 각 샘플을 마이크로 이식 장소를 포함하는 식염수 대기음. 그대로 제어 펀치 생검에 대해 동일한 프로토콜을 수행합니다. </li><li> 각 샘플로 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 항생제가 보충 된 RPMI 1640 배지 1 ㎖를 추가한다. </li><li> 즉시 세포 생존 능력을 평가한다. 각 웰 (각각 피부 조직, DED 또는 진피 여덟 서너 균일 한 샘플의 동시 세분화하여 얻어진) 마이크로 - 그래프트를 포함하는 0.5 밀리그램 / MTT의 ㎖ (3- [함유 배지 1 ㎖를 추가 4,5 디메틸 티아 졸 -2- 일] -2,5- 디 페닐 브로마이드) 용액 및 CO 2 / 5 % 공기의 분위기에서 37 ℃에서 3 시간 동안 배양한다. 그대로 제어를위한 동일한 프로토콜을 수행생검 펀치. </li><li> 배양 후, 배지 모두 함유 MTT를 제거하고 10 분 동안 각 샘플 1 ml의 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 추가한다. </li><li> 큐벳에 각 샘플 및 DMSO를 전송하고 분광 광도계를 사용하여 570 nm에서 광학 밀도 (OD)에서 참조하십시오. 570 nm에서의 흡광도의 비율 세분화 전에 사용 조직 g (GR)에서의 중량으로 세포 생존율을 계산한다. 그대로 제어 펀치 생검에 대해 동일한 프로토콜을 수행합니다. </li></ol></li><li> 기계적 세분화 한 후 피부 조직을 단일 공여체 DED 진피 샘플로부터 유래 된 마이크로 그래프트 함유 식염수 대기음. <ol><li> 12 웰 플레이트의 단일 잘 또는 각각 세포 생존 능력 테스트 및 형태 학적 분석을위한 문화 플라스크에 개별적으로 각각의 샘플을 놓습니다. </li><li> 5 % CO 2 / AI 분위기 하에서 37 ℃에서 1 ㎖ (12 웰 플레이트) 또는 5 ㎖ 1640 배지는 10 % FBS로 보충 된 RPMI로 (배양 플라스크) 항생제를 추가 배양 마이크로 이식편24 시간 7 일 연구. </li><li> 24 시간 또는 칠일 (반복 2.1.8-2.1.10 단계) 후 세포 생존 능력을 평가합니다. </li><li> 24 시간 및 플라스크에 문화의 7 일 후 광학 현미경으로 세포 현탁액의 존재를 평가하는 형태 학적 분석을 수행합니다. </li><li> FACS 분석 (6)에 의해 CD146, CD34 및 CD45 항원을 포함하는 중간 엽 및 조혈 세포 마커에 양성을 위해 진피의 샘플을 분석 할 수 있습니다. </li><li> 층류 후드 시드에서 완전히 분해되지 각각 조직 샘플의 상대 작은 조각 (피부 조직 각각 DED 또는 진피 여덟 서너 균일 한 샘플의 동시 세분화시켜 얻음) 각 마이크로 그래프트 (&gt; 크기가 50 마이크론 5 % 양 혈액 배지 100 μl를 포함 컬럼비아 한천 플레이트에 세분화 과정) 후. </li><li> 사흘 동안 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션하고 멸균을 평가하기 위해 컬럼비아 한천 플레이트상에서 미생물 학적 분석을 수행 (11). </li></ol></li></ol>

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	<li>Sen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skin+wounds:+a+major+and+snowballing+threat+to+public+health+and+the+economy.">Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy.</a> Wound Repair Regen. 17, 763-771 (2009).</li><li>Ellis, E., Sinn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+homologous+bone+grafts+in+maxillofacial+surgery.">Use of homologous bone grafts in maxillofacial surgery.</a> J Oral Maxillofac Surg. 51, 1181-1193 (1993).</li><li>Nguyen, A., Pasyk, K. A., Bouvier, T. N., Hassett, C. A., Argenta, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+survival+of+autologous+adipose+tissue+taken+and+transplanted+by+different+techniques.">Comparative study of survival of autologous adipose tissue taken and transplanted by different techniques.</a> Plast Reconstr Sur. 85, 378-389 (1990).</li><li>Abuzeni, P. Z., Alexander, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+Autologous+Fat+Transplantation+With+Platelet+Rich+Plasma.">Enhancement of Autologous Fat Transplantation With Platelet Rich Plasma.</a> AJCS. 18 (2), 59-70 (2001).</li><li>Trovato, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Medical+Device+Rigeneracons+Allows+to+Obtain+Viable+Micro-Grafts+from+Mechanical+Disaggregation+of+Human+Tissues.">A New Medical Device Rigeneracons Allows to Obtain Viable Micro-Grafts from Mechanical Disaggregation of Human Tissues.</a> J Cell Physiol. , (2015).</li><li>Zanzottera, F., Lavezzari, E., Trovato, L., Icardi, A., Graziano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Derived+Stem+Cells+and+Growth+Factors+Applied+on+Hair+Transplantation+Follow-Up+of+Clinical+Outcome.">Adipose Derived Stem Cells and Growth Factors Applied on Hair Transplantation Follow-Up of Clinical Outcome.</a> JCDSA. 4 (4), 268-274 (2014).</li><li>Giaccone, M., Brunetti, M., Camandona, M., Trovato, L., Graziano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Medical+Device,+Based+on+Rigenera+Protocol+in+the+Management+of+Complex+Wounds.">A New Medical Device, Based on Rigenera Protocol in the Management of Complex Wounds.</a> J Stem Cells Res, Rev &amp; Rep. 1 (3), 3 (2014).</li><li>Aimetti, M., Ferrarotti, F., Cricenti, L., Mariani, G. M., Romano, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+dental+pulp+stem+cells+in+periodontal+regeneration:+a+case+report.">Autologous dental pulp stem cells in periodontal regeneration: a case report.</a> Int J Periodontics Restorative Dent. 34 (3), s27-s33 (2014).</li><li>Graziano, A., Carinci, F., Scolaro, S., D'Aquino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodontal+tissue+generation+using+autologous+dental+ligament+micro-grafts:+case+report+with+6+months+follow-up.">Periodontal tissue generation using autologous dental ligament micro-grafts: case report with 6 months follow-up.</a> AOMS. 1 (2), 20 (2013).</li><li>Brunelli, G., Motroni, A., Graziano, A., D'Aquino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sinus+lift+tissue+engineering+using+autologous+pulp+micro-grafts:+A+case+report+of+bone+density+evaluation.">Sinus lift tissue engineering using autologous pulp micro-grafts: A case report of bone density evaluation.</a> J Indian Soc Periodontol. 17 (5), 644-647 (2013).</li><li>Ellner, P. D., Stoessel, C. J., Drakeford, E., Vasi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+culture+medium+for+medical+bacteriology.">A new culture medium for medical bacteriology.</a> Am J Clin Pathol. 45, 502-504 (1966).</li></ol>

저자 안토니오 그라는 생산과 Rigenera 시스템을 판매하고 인간의 뇌파 Srl의 과학 감독이다. 저자 레티 지아 Trovato는 인간의 뇌파 Srl의 과학 부문의 협력자입니다

이 예비 연구. 이미 마이크로 이식 임플란트 (9)의 효과 (10)를 최적화하는 다른 임상 적 적용에보고 된이 프로토콜에 의해 얻어진 마이크로 이식은 콜라겐 스폰지와 결합 될 수 있다는 것을 보여 주었다 특히, 본 연구는 생체의 용량을보고 -complexes, 임상 응용 프로그램에서 30 일 후에 다리 병변의 상처 치유를 보조하기 위해, 마이크로 이식 및 콜라겐 스폰지로 구성. 또한, 체외</...

지난 몇 년 동안, 몇몇 새로운 방법은 급성 및 만성 피부 병변 원스텝 치료를 제공하기 위해 수술 중자가 세포 현탁액을 수득 생명 공학 분야에서 개발되어왔다. 또한, 외상, 당뇨병, 감염증 및 기타 원인으로 인한 급성하지만 주로 만성 상처 관리 도전 남아있다. 만성 상처 의료 시스템 전 세계적으로 1 막대한 재정 부담의 원인이 심각한 글로벌 건강 문제가 될 것을 장착 증거가있다. 피부 병변의 치료 성공률을 높이기 위해 (셀룰러 인핸스 포함) 광범위한 조작이없는 무균 상태의 유지는 즉시의 손상된 영역에 도포 될 수있다 세포 현탁액을 생성하기 위해 필수적인 환자함으로써 이러한 세포 공장으로 클린 룸에서 더 이상 처리를 피하는. 성작은 피부 생검, 연삭, 원심 분리 등의 분리 방법 (예를 들어, 효소 또는 기계)로부터 arting 자주 성장 배지에서 배양 될 수있는 세포 현탁액을 얻기 위해 사용된다. 이들 모든 방법은 일반적으로 셀 구조를 강조하고, 세포 생존율의 감소를 초래 실행 시간이 필요하다. 또 다른 중요한 양태는 손상된 부분을 복구하는, 예를 들어, 임상의에 의해 사용될 준비자가 세포 현탁액을 수득한다. 또한, 잘자가 ​​조직 이식은 결국 유도와 전도 2, 3의 원리에 의해받는 사이트에서 살아 남기 위해 전송 절차를 살아남을 것으로 설정됩니다. 이상적인 이식 조직은 쉽게 사용할 수 있으며 낮은 항원과 공여부의 이환율 (4)이 있어야합니다. 이 증거에 기초하여, 본 연구의 목적은 제 적합자가 생체 복합체를 만드는 것이었다조직 복구에 임상 응용 프로그램입니다. 이를 위해,이 프로토콜에 의해 세분화 된 피부 조직으로부터 개시자가 미세 이식을 구하는 새로운 방법을 설명한다. 사례 발표도 여기에 콜라겐 스폰지와 함께이 프로토콜에 의해 얻은자가 미세 이식의 임상 응용 프로그램으로 설명한다. 이 방법은 이미 사람 조직 (5)의 기계적인 세분화 효율적인 것으로보고되고있어 이식 및 피부 조직 6,7의 재생뿐만 아니라 구강 악안면 외과 8-10에 결합 조직의 재생 치료를 위해 임상 적으로 사용되어왔다 . 또한,이 연구의 목적은 초이 프로토콜에 의하여 자신의 세분화 후에 피부 조직의 생물학적 특성이었다. 이 목적을 위해 피부 조직의 다른 동종 샘플은 다른 여러 기관의 트렁크 지역에서 유래및 / 또는 다중 조직 기증자는 에밀리아 로마 냐 지역 스킨 은행에서 이식을위한 조직 (CNT 2013) 수확, 처리에 국립 규칙을 다음과 분산 처리 하였다. CASE 프리젠 테이션 : 자동차 사고로 인한 복합 외상을 보여주는 35 세 여자 환자는 앙 코나 병원의 중환자 실에 입원했다. 환자 인해 열린 상처와 외부 고정 안정화 복합 골절로 다리에 감염을 보였다. 두 급진적 인 변연 절제술을 수행하고 상처 음압 치료 (VAC 치료) 후 깨끗한되었고, 골막 건강 나타 났을 때, 우리는 회복 두 달 후에 프로토콜을 적용 하였다. 이 시스템을 세분화 한 후, 얻어진 마이크로 이식이어서 환부 복구에 미치는 효과를 조사하기 위해 주입 된 콜라겐 스폰지 바이오 복합체를 만들기 위해 사용되었다.

<table><tbody><tr><td>Rigenera Machine</td><td>Human Brain Wave</td><td>79210R</td><td></td></tr><tr><td>Rigeneracons</td><td>Human Brain Wave</td><td>79450S</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Roche Diagnostic GmbH</td><td>11465007001</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium</td><td>PBI International</td><td>733-2292</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>PBI International</td><td>F 0415</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotics</td><td>Biological Industries PBI</td><td>03-038-1 &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies for FACS Analysis</td><td>eBiosciences</td><td>code 12-1469 for CD146-P; code 17-0349&amp;nbsp; for CD34-APC&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Columbia agar</td><td>BioMerieux Company</td><td>43041</td><td></td></tr><tr><td>Condress&amp;reg;</td><td>Abiogen Pharma</td><td></td><td>collagen sponge used for bio-complexes</td></tr><tr><td>DMSO&amp;nbsp;</td><td>Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl solution</td><td>Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene&amp;nbsp;</td><td>Carlo Erba</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tissue characterization after a new disaggregation method for skin micro-grafts generation

몇 가지의 새로운 방법은 급성 및 만성 피부 병변 한 단계 치료를 제공하기 위해 수술 중자가 세포 현탁액을 수득 생명 공학 분야에서 개발되어왔다. 또한, 외상, 당뇨병, 감염증 및 기타 원인으로 인한 만성하지만 급성 상처 관리 도전 남아있다. 이 연구에서 우리는 하나 환자의 피부 조직과 임상 응용 프로그램에서자가 마이크로 이식을 만들 수있는 새로운 방법을 설명합니다. 또한, 피부, 디 epidermized 진피 (DED) 및 다기관 및 / 또는 다중 조직 공여자로부터 유래 된 진피의 피부 조직의 시험 관내 생물학적 특성화 또한 수행 하였다. 모든 조직은 우리가 가능한 마이크로 이식편을 수득 할 수 있도록, 새로운 프로토콜 세분화 하였다. 특히,이 혁신적인 프로토콜 피부 환부에 도포 될 준비자가 이식 및 마이크로 콜라겐 스폰지로 이루어지는 바이오 복합체를 만들 수 있음을보고 하였다. clini다리 병변자가 생체 복합체 학적 애플리케이션은 재 epitalization 처리 및 병변의 부드러움 모두 향상을 보여주는보고되었다. 또한, 우리의 체외 모델은이 시스템을 기계적 세분화 한 후 세포 생존 능력은 문화의 최대 7 일의 시간 동안 유지되는 것으로 나타났다. 또한 세분화로부터 얻은 세포의 풀이 높은 재생 잠재력, 조직 재생 및 복구 과정에서 중요한 역할을 발휘하는 중간 엽 줄기 세포를 포함한 여러 세포 유형으로 구성되어, 유동 세포 계측법 분석으로 관찰 하였다. 마지막으로, 우리는 한천 요리를 배양 할 때이 절차는 마이크로 이식의 불임을 유지 체외에서 보여 주었다. 요약하면, 우리는 의사가 가능한 멸균 일반적인 생물학적 scaffo으로 단독으로 또는 조합하여 적용 할 수있는 마이크로 - 도관을 사용하여 하나의 준비 단계에서 획득하는 새로운 재생 방식은 유망한 수단이 될 수 있다는 결론LDS.

이 예비 연구에서, 제 목표 사용할 준비 바이오 복합체를 제조하는 콜라겐과 같은 생물학적 지원과 함께 인간자가 미세 이식의 능력을 조사 하였다. 이러한 바이오 복합체는 환자에 이식했다 자동차 사고 (도 2A)에 의한 다리 병변 30 일 (도 2b) 후 조직 복구와 관련된 완전한 재 상피화 관찰되었다. 또한, 임상 후속 임상 ?...

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Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

새로운 프로토콜에있어서 인간의 조직들을 분해하고, 콜라겐 스폰지와 함께, 피부 병변의 치료에 사용할 준비 인간 생체 복합체를 야기 미세자가 이식편을 만들 설명. 또한,이 시스템은 기계적 세분화 한 후 다른 시간에 마이크로 이식편의 세포 생존율을 유지.

피부 마이크로 이식 세대를위한 새로운 세분화 방법 후 조직 특성

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

tissue-characterization-after-new-disaggregation-method-for-skin

Research

JoVE Journal

Medicine

21.5K 조회수.  Burns Centre and Emilia Romagna Regional Skin Bank.  새로운 프로토콜에있어서 인간의 조직들을 분해하고, 콜라겐 스폰지와 함께, 피부 병변의 치료에 사용할 준비 인간 생체 복합체를 야기 미세자가 이식편을 만들 설명. 또한,이 시스템은 기계적 세분화 한 후 다른 시간에 마이크로 이식편의 세포 생존율을 유지. 

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Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

약화 된 인간의 진피를 사용하여 유전자 변형의 Organotypic 피부 문화의 생성

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

연구

발생학

Isolation of Papillary and Reticular Fibroblasts from Human Skin by Fluorescence-activated Cell Sorting

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have traditionally been attributed to the superficial papillary or lower reticular dermis according to their histological localization. In mouse dermis, papillary and reticular fibroblasts originate from two different lineages with diverging functions regarding physiological and pathological processes and a distinct cell surface marker expression profile by which they can be distinguished.
Importantly, evidence from explant cultures from superficial and lower dermal layers suggest that at least two functionally distinct dermal fibroblasts lineages exist in human skin dermis as well. However, unlike for mouse skin, cell surface markers enabling the discrimination of different fibroblast subsets have not yet been established for human skin. We developed a novel protocol for the isolation of human papillary and reticular fibroblast populations via fluorescence-activated cell sorting (FACS) using the two cell surface markers Fibroblast Activation Protein (FAP) and Thymocyte antigen 1 (Thy1)/CD90. This method enables the isolation of pure fibroblast subsets without in vitro manipulation, which was shown to affect gene expression, thus permitting accurate functional analysis of human dermal fibroblast subsets in regard to tissue homeostasis or disease pathology.

This manuscript describes a FACS-based protocol for isolation of papillary and reticular fibroblasts from human skin. It circumvents in vitro culture which was inevitable with the commonly used isolation protocol via explant cultures. The emanating fibroblast subsets are functionally distinct and display differential gene expression and localization within the dermis.

Fibroblasts are a highly heterogeneous cell population implicated in the pathogenesis of many human diseases. In human skin dermis, fibroblasts have ...

유전학

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Tissue engineering often includes in vitro expansion in order to create autografts for tissue regeneration. In this study a method for tissue expansion, regeneration, and reconstruction in vivo was developed in order to minimize the processing of cells and biological materials outside the body.

압축 된 콜라겐에 다진 조직 : 단일 무대 재건 복구를위한 세포 함유 Biotransplant

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

생체공학

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

개선 2D 및 3D 스킨<em&gt; 체외</em거대 분자의 크라우 딩 사용&gt; 모델

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

표현형 분석 및 대한 인간의 피부에서 림프구 분리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 세포 배양

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

면역학 및 감염병학

Apparatus for Harvesting Tissue Microcolumns

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns of full-thickness skin tissue. The small size of the microcolumns allows donor sites to heal quickly without causing donor site scarring, while harvesting full-thickness tissue enables the incorporation of all cellular and extracellular components of skin tissue, including those associated with deeper dermal regions and the adnexal skin structures, which have yet to be successfully reproduced using conventional tissue engineering techniques. The microcolumns can be applied directly into skin wounds to augment healing, or they can be used as the autologous cell/tissue source for other tissue engineering approaches. The harvesting needles are made by modifying standard hypodermic needles, and they can be used alone for harvesting small amounts of tissue or coupled with a simple suction-based collection system (also made from commonly available laboratory supplies) for high-volume harvesting to facilitate studies in large animal models.

Here we describe a protocol for producing harvesting needles that can be used to collect full-thickness skin tissue without causing donor site scarring. The needles can be combined with a simple collection system to achieve high-volume harvesting.

조직 Microcolumns 수확 용

This manuscript describes the production process for a laboratory apparatus, made from off-the-shelf components, that can be used to collect microcolumns ...

Decellularization for the Preparation of Highly Preserved Human Acellular Skin Matrix for Regenerative Medicine

Extracellular matrix (ECM) provides biophysical and biochemical stimuli to support self-renewal, proliferation, survival, and differentiation of surrounding cells due to its content of diverse bioactive molecules. Due to these characteristics, the ECM has been recently considered a promising candidate for the creation of biological scaffolds to boost tissue regeneration. Emerging studies have demonstrated that decellularized human tissues could resemble the native ECM in their structural and biochemical profiles, preserving the three-dimensional (3D) architecture and the content of fundamental biological molecules. Hence, decellularized ECM can be employed to promote tissue remodeling, repair, and functional reconstruction of many organs. Selecting the appropriate decellularization procedure is crucial to obtain acellular tissues that retain the characteristics of the ideal microenvironment for cells. 
The protocol described here provides a detailed step-by-step description of the decellularization method to obtain a reproducible and effective cell-free biological ECM. Skin fragments from patients undergoing plastic surgery were scaled down and decellularized using a combination of sodium dodecylsulfate (SDS), Triton X-100, and antibiotics. To promote the regular and homogeneous transport of the solution through the samples, they were enclosed in embedding cassettes to ensure protection from mechanical insults. After the decellularization procedure, the snow-white color of skin fragments indicated complete and successful decellularization. Additionally, decellularized samples showed an intact and well-preserved architecture. The results suggest that the proposed decellularization method was effective, fast, and reproducible and protected samples from architectural damages.

Decellularized human skin is suitable for tissue regeneration. A major issue of decellularization is the preservation of the native architecture, along with the appropriate content of structural proteins, glycosaminoglycans (GAGs), and growth factors. The method proposed allows fast and effective decellularization, producing decellularized skin with well-preserved native features.

Extracellular matrix (ECM) provides biophysical and biochemical stimuli to support self-renewal, proliferation, survival, and differentiation of ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

헤어 재생시 상피 - 중간 엽 시그널링의 빠른 유전 분석

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

생물학

Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo

The human skin xenograft model, in which human donor skin is transplanted onto an immunodeficient mouse host, is an important option for translational research in skin immunology. Murine and human skin differ substantially in anatomy and immune cell composition. Therefore, traditional mouse models have limitations for dermatological research and drug discovery. However, successful xenotransplants are technically challenging and require optimal specimen and mouse graft site preparation for graft and host survival. The present protocol provides an optimized technique for transplanting human skin onto mice and discusses necessary considerations for downstream experimental aims. This report describes the appropriate preparation of a human donor skin sample, assembly of a surgical setup, mouse and surgical site preparation, skin transplantation, and post-surgical monitoring. Adherence to these methods allows for maintenance of xenografts for over 6 weeks post-surgery. The techniques outlined below allow maximum grafting efficiency due to the development of engineering controls, sterile technique, and pre- and post-surgical conditioning. Appropriate performance of the xenograft model results in long-lived human skin graft samples for experimental characterization of human skin and preclinical testing of compounds in vivo.

Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo

The present protocol describes how to graft human skin onto non-obese diabetic (NOD)-scid interleukin-2 gamma chain receptor (NSG) mice. A detailed description of the preparation of human skin for transplant, preparation of mice for transplant, transplantation of split-thickness human skin, and post-transplantation recovery procedure are included in the report.

생체 내에서 인간 면역 반응을 조작하기 위한 이종이식 피부 모델

The human skin xenograft model, in which human donor skin is transplanted onto an immunodeficient mouse host, is an important option for translational ...

피부 마이크로 이식 세대를위한 새로운 세분화 방법 후 조직 특성

요약

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