WM 켁 재단은 관대하게이 일을 위해 자금을 제공했다. 정부에서, 고등 교육 인력의 개선을 위해 조정에서 테두리 장학금 88888.075416 / 2013-00없이 RDM 브라질, 과학 - 본 자료는 리오 데 자네이로 국가의 정부로부터 FAPERJ 연구 보조금 100.039 / 2014 지원 작업을 기반으로 브라질의, HSS를 들면, 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 대학원 연구 OSS에 대한 교제 번호 2014171659에서 친목 및 CNPq 연구 보조금 LHFDVPCH에 대한 브라질 정부의 202,011 / 2012-7에 의해 생명의 노스 웨스턴 대학의 화학받는 사람은 연구소 박사후을 처리하다 원정대 수상.

참고 :이 비디오 프로토콜은 관련 출판물 (9)을 기반으로합니다. 특정 시약, 재료와이 프로토콜에 설명 된 모든 단계를 수행하는 데 필요한 장비는 재료 섹션에 나열되어 있습니다. 필요한 모든 솔루션의 준비를위한 조리법 및 정보는 표 1에 항목별로된다. 1. 그라데이션 튜브 젤 쏟아져 <ol><li> 주조 시스템 조립 <ol><li> 화염 가열 면도날 또는 메스를 사용하여, 분배 팁의 상부로부터 수직 단면을 따라 10cm를 20 ㎖ 혈청 피펫을 자른다. 절단 표면이 부드러운 지 확인합니다. (끝) 하단 부분을 유지하고 상단 부분을 폐기합니다. 지원 스탠드에 수직으로 (원추형 끝이 아래를 향하도록) 아래 피펫 부분을 클램프. 주의 : 화상을 방지하기 위해 적절한 핸들 또는 플라이어를 사용하여 가열 된 블레이드 금속을 만지지 마십시오. </li><li> 유연한 튜브의 3cm를 잘라을 스트레칭하여 컷 피펫에 연결분배 팁. 튜브의 타단에 유량 제어 밸브를 연결한다. </li><li> 튜브 부재를 사용하는 그라데이션 혼합기 분배 선단에 상기 밸브의 바닥을 연결한다. 개방 밸브를 유지합니다. </li><li> 자기 교반기 위에 그라데이션 믹서 설정. 혼합 챔버 내부에 자기 막대를 놓습니다. </li><li> 겔은 중력에 의해 주입 될 수 있도록 피펫 부재의 상단보다 5~10cm에서 허용 경사 혼합기 분배 팁을 위치. </li><li> 탈 이온수로 누출 시스템을 테스트합니다. 누수가 발견되지 않으면 계속하기 전에 내부에 공기를 불어하여 ​​시스템을 건조. </li><li> 테이프의 2 층 이상으로 피펫 부재의 상단을 커버. 원형 개구부의 중심에 테이프 층을 통해 구멍을 천공. 구멍이 유리관을 통해 긴밀하게 통과하기에 충분한 지 확인합니다. </li><li> 유리 단단히 맞도록 겔 테이프를 연신, 천공 구멍을 캐스팅한다 유리관 슬라이드. 나는유리관 nsert 튜브의 하단은 상기 바닥 피펫 2mm가되도록. </li><li> 유리 튜브가 개최되고 중앙 집중화 된 시스템이 준비되면 피펫 벽을 터치하지 않은 경우 확인하십시오. 이 시스템은 현재 캐스팅 준비가 된 것입니다. </li></ol></li><li> 주조 젤 <ol><li> 겔 완충액 APS 쿠마 용액 (용액 1-3, 표 1)을 준비한다. </li><li> 겔 용액을 분리하는 12 % T (용액 4, 표 1), 1 % T (용액 5, 표 1)을 준비한다. T 12 % 분리 겔 용액 쿠마 용액 10 μL를 추가한다. 바로 그라데이션 믹서에 주입하기 전에 두 솔루션의 APS와 TEMED를 추가합니다. 주의 : 폴리 아크릴 아미드가 매우 신경 독성과 장갑을 착용해야합니다. </li><li> 그라데이션 믹서의 분배 밸브가 닫혀 있는지 확인합니다. 분배 끝에서 혼합 챔버 먼에 겔 용액을 분리하는 12 % T를 추가합니다. 두 챔버 사이의 밸브를 열고 솔루션 흐름 내가하자다음 챔버 NTO. </li><li> 밸브를 닫고 이전 챔버로 다시 탈구 12 % T의 분리 겔 용액을 피펫. 이것은 챔버들 사이의 공기 방울을 방지하기 위해 수행된다. </li><li> 분배 팁에 가장 가까운 혼합 챔버 겔 용액을 분리하는 1 % T를 추가한다. 자석 교반기를 켭니다. </li><li> 동시에 열 모두 그라데이션 믹서 밸브 분리 겔 용액 혼합하고 피펫 유리 튜브로 흐르게한다. </li><li> 구배 혼합기 분리 겔 용액이 고갈되면, 10 ㎖ 주사기로 믹서를 커플에서 튜브를 풀다. 주사기를 단단히 부착 될 때까지 튜브의 단부 피펫 내의 액체 레벨 이상 남아 있는지 확인. </li><li> 부드럽게 피펫 유리 튜브에 튜브에서 나머지 분리 겔 용액을 밀어 주사기를 사용합니다. 그것으로 공기 방울을 허용하기 전에 피펫 밸브를 닫습니다. </li><li> 조심스럽게 물을 포화 butano 약 0.25 mL의 층을 추가유리관 내부 겔 용액 위에 리터 (액 6, 표 1) 공기 중의 산소에서 중합 반응을 밀봉하도록 상단 메 니스 커스를 평탄화. </li><li> 탈 이온수 (세제를 사용하지 않음) 즉시 주입 장치를 청소합니다. </li><li> 실온에서 완전한 겔 중합에 밤새 기다립니다. </li></ol></li><li> 장치 및 보관에서 젤 튜브를 분리 <ol><li> 다음 날, 신중 단말기 위쪽 오프 테이프를 벗겨. </li><li> 피펫에서 배관에서 밸브를 분리합니다. 클램프에서 피펫을 놓고 단계 1.3.3를 수행합니다. 및 1.3.4. 싱크대 위에. </li><li> 커플 유연한 튜브에 탈 이온수 가득 10 ML의 주사기. 천천히 피펫에서 중합 된 겔을 슬라이딩, 피펫으로 튜브를 통해 물을 밀어 넣습니다. </li><li> 수평 피펫을 잡고 조심스럽게 개방 단부에서 슬라이딩 젤을 고정합니다. </li><li> 아래와 ARO를 초과하는 폴리 아크릴 아미드를 잘라면도날을 사용하여 유리관 핀클. 유리 튜브의 끝이 평평하게하여, 튜브 내에서 겔의 부드러운 끝을 작성해야합니다. </li><li> 겔 상부면에 남아있는 부탄올 닿아 캡핑 15 mL의 원심 분리 튜브에 젤 튜브를 설정한다. 4.5 mL의 초순수로 0.5 ㎖의 겔 완충액 (용액 1, 표 1)을 혼합하고 젤 튜브의 용액 (유리관 내) 양 상측 및 (원심 튜브) 하부 측의 약 2 mL로 추가한다. </li><li> 버퍼 증발을 방지하기 위해 파라 필름으로, 유리관의 개구를 포함하는 원심 분리 튜브의 전체 상부면을 커버. 겔은 약 2 주 동안 39 ° C에서 저장 될 수있다. </li></ol></li></ol> 2. 샘플 준비 <ol><li> 두 마우스의 마음을 달아 면도날을 사용하여 페트리 접시에서 그들을 말하다. </li><li> 박격포로 처리 된 조직을 추가하고 샘플을 커버하기에 충분한 액체 질소를 추가 할 수 있습니다. 더 추가, 유봉과 조직을 분쇄이 증발 액체 질소. </li><li> 조직을 완전히 분쇄되면, 질소 증발하게 조직마다 100 mg을 4 ° C에서 (용액 7, 표 1) 용해 완충액 1 ㎖를 추가한다. 원심 분리기 튜브에 솔루션을 이동합니다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 2,000 XG에 원심 분리기. 조심스럽게 새로운 튜브에 뜨는를 수집하고 펠렛을 폐기합니다. bicinchoninic 산 제 12을 이용하여 상등액의 단백질 농도를 정량화하거나 바람직있다. 주 : 바람직한 네이티브 세포 용 해물 또는 세포 내 분획을 제조 할 수있다. CN-GELFrEE 다양한 다른 기본 샘플 준비와 호환됩니다. </li><li> 가용화 완충액 로딩 용액 (용액 8 및 9 표 1)을 준비한다. </li><li> 시료 펠릿 인 경우, 가용화 완충액 50-150 μL 그것을 재현 탁. 15 분 동안 얼음에 샘플 유지. </li><li> 버퍼로 재현 탁 샘플 또는 solubilizat와 세포 용 해물을 교환30 kDa의-MWCO 초 원심 필터를 사용하여 이온 버퍼입니다. </li><li> 단백질 4 ° C에서 샘플 5 ~ 10 분 동안 또는 유지 부분의 볼륨이 아래로 약 20 μL에 있습니다까지 10,000 XG를 원심 분리기. 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> 유지 부분에 용해 버퍼의 400 μl를 추가하고 피펫으로 혼합한다. 4 ° C에서 원심 분리기 및 5 ~ 10 분 동안 또는 유지 부분이 아래로 약 20 μL에 있습니다까지 10,000 XG. 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> 단계를 반복 2.9 두 개의 추가 시간. </li><li> 용해 완충액 100 ㎕로 여과 샘플 (약 20 μL)을 희석. </li><li> 샘플 로딩 용액 20 μl를 추가합니다. </li></ol> 3. CN-GELFrEE 장치 <ol><li> , CN-GELFrEE 분획을 수행 기계 공장을 참조하여 장치의 부품을 제조한다. 테프론에서 장치의 부품 제조. 필요한 모든 정보가 부품 t을 생산하는 그림 1 참조하시기 바랍니다하나의 장치에 필요한 부품의 수 O 표 2. 안전 고려 사항 : 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 케어 고전압 전원 장치 주위를 촬영해야하고, 모든 접합 제대로 장착해야한다. 전압이 켜져있는 동안 장치 또는 인접 젖은 영역을 터치하여 전기 영동시 주변 벤치 영역 건조를 유지하지 마십시오. 장치 처리 및 / 또는 분획을 수집 할 때 또한, 전원이 완전히 오프한다. </li><li> 양극과 음극 버퍼 버퍼 (솔루션 10-11, 표 1)을 준비하고 4 ° C 또는 얼음에 보관하십시오. </li><li> &quot;샌드위치&quot;방식으로, 스페이서, O 링 및 제 2 스페이서를 통해 젤 튜브 (겔없이 단)의 상단부를 장착한다. </li><li> , 제 2 스페이서 후 버퍼 챔버 (음극)를 추가 측면 구멍을 통해 나사를 완전히 통과, 양쪽에 너트를 추가하고 조입니다. 있는지 확인 한 유리의 상단S 튜브 버퍼 챔버의 상부 개구 전에 아닌 바로 아래 또는 과거에 고정된다. </li><li> 스페이서, O 링, 수집 챔버, 및 제 2 스페이서를 통해 젤 튜브의 하단부를 장착한다. </li><li> , 제 2 스페이서 후 버퍼 챔버 (양극)를 추가 측면 구멍을 통해 나사를 완전히 통과, 양쪽에 너트를 추가하고 조입니다. 가깝지만 후벽 닿지 않으면, 젤 튜브의 하단부는 상기 버퍼 챔버의 상부 개구를지나 고정되어 있는지 확인. </li><li> 음극 버퍼 챔버 위쪽 클램프와 지원 스탠드를 사용하여 수직으로 CN-GELFrEE 장치를 설정합니다. </li><li> 음극 버퍼 챔버 (위) 애노드 버퍼 챔버 (아래)와 캐소드 버퍼 애노드 버퍼를 추가한다. 4 ° C에서 모든 버퍼를 유지합니다. </li><li> 부드럽게 유리관을 눌러 유리관 내부로부터 공기 방울을 제거하고 누설 검사 시스템. </li><li> 백금 전극이 챔버에 모두 해당 버퍼에 접촉되어 있는지 확인합니다젤 튜브 단부는 각 챔버 내의 버퍼에 침지된다. </li><li> 양극 버퍼 챔버 (아래)에 음극 버퍼 챔버 (위)에 음과 양 : 각각의 바나나 플러그에 전원 공급 장치에서 전원 코드를 연결합니다. </li><li> 젤 튜브 내부 겔의 표면 상단으로 젤로드 팁을 사용하여 샘​​플을로드합니다. </li><li> 붉은 염료 프론트 젤 튜브의 바닥에 도달하기까지 과열을 방지하기 위해, 1 W 상수에서 겔을 실행. 주의 : 계속하기 전에 전원 공급 장치를 끄십시오. </li><li> 양극과 음극 버퍼를 폐기하십시오. </li><li> 스페이서와 O 링 유지 음극 버퍼 챔버 의해 너트 Untighten 및 하부 스페이서 및 챔버를 분해. 상단 조리개, 과거 또는 직접 그 아래되지 전에, 수집 챔버 내부의 젤 튜브의 하단을 배치합니다. 수집 챔버에 가까운 스페이서와 O 링을 밀어 넣습니다. </li><li> 셀룰로오스 투석막의 조각을 잘라내어 애노드 버퍼 immerging하여 재수. AP 커버수집 챔버 및 투석막을 이용하여 하부 스페이서 사이 erture. </li><li> 상기 제 2 스페이서 후의 양극 버퍼 챔버를 조립 추가 나사 볼트를 조인다. </li><li> 얼음 양동이에 걸쳐 수평으로 장치를 놓습니다. 버퍼 챔버에 신선한 양극과 음극 버퍼를 추가 누출을 위해 시스템을 확인합니다. </li><li> 수집 챔버에 양극 버퍼의 150 μl를 추가합니다. 각각의 바나나 플러그에 전원 코드를 다시 연결합니다. </li><li> 3mA 정전류에서 전원을 켭니다. 염료 프론트는 수집 챔버에 버퍼로 용리되기 시작한다. </li><li> 전체 염료 전면이 용출되면, 낮은 단백질 결합 microcentrifuge 관으로 이송, 전원을 차단 한 후 제 1 분획 (0 분)를 수집한다. </li><li> 애노드 완충액 150 μL와 수집 챔버 리필. 얼음에 수집 된 모든 분수를 유지합니다. </li><li> 컬렉션에서 다음 시간 간격 이후에 분수를 수집제 1 분획 2 분, 4 분, 6 분, 8 분, 10 분, 15 분, 20 분, 25 분, 30 분, 45 분 및 60 분. 전원 공급 장치가 꺼져있는 동안 시간을​​ 고려하지 마십시오. 분수를 수집하기 전에 전원 공급 장치를 해제하는 것을 잊지 마십시오과 샘플 사이의 양극 버퍼 150 μL와 수집 챔버를 보충 할 수 있습니다. 다음 부분을 용출 시작 수집 후 다시 전원을 켜십시오. </li><li> 양극과 음극 버퍼를 분배하고 60 분 후 버퍼 챔버에 신선한 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 90 분, 120 분에서 분수를 수집합니다. </li><li> 양극과 음극 버퍼 모든 시간을 변경합니다. </li><li> 명확한 기본 또는 분수와 푸른 기본 페이지를 실행하고 선호로 얼룩. 제조업체의 지침 또는 선호하는 프로토콜을 따르십시오. </li><li> 환원성 SDS-PAGE를 실행하고 선호로 얼룩. 제조업체의 지침 또는 선호하는 프로토콜을 따르십시오. </li><li> GELFrEE 분획을 정리하고 기본 질량 분석에 제출 설명한 홍보로 분석eviously 9. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53597/53597fig1.jpg" /> 그림 1 :. CN-GELFrEE 장치 (A) GELFrEE 장치 부품 도면과 제조 부품 (B) 사진; (C) CN-GELFrEE 장치 조립체 방식 : (1) 버퍼 실 (2) 스페이서 (3)에 O 링 (4) 겔 관 (5)에 수집 챔버, 및 (6) 투석막. <img alt="1 번 테이블" src="/files/ftp_upload/53597/53597table1.jpg" /> 표 1 : 솔루션의 표. <img alt="표 2" src="/files/ftp_upload/53597/53597table2.jpg" /> 표 2 : GELFrEE 장치 부의 표.

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The authors have nothing to disclose.

CN-GELFrEE은 겔 매트릭스를 통해 분자량 계 단백질 분획에 대한 담체 분자 9 음이온 성 및 중성 세제의 혼합물을 사용하여 클리어 네이티브 (CN) 페이지 버퍼 시스템으로부터 유도된다. 네이티브 마우스 심장 단백질 추출물 CN-GELFrEE의 애플리케이션 생체 분자 어셈블리의 비공유 상호 작용을 유지하면서, 이산 대역폭과 낮은 복잡도 분획 생성. CN-PAGE 및 SDS-PAGE 환원 슬랩 겔 분획 사이의 비교 ?...

셀 내에서 일어나고있는 생물학적 과정의 대부분은 단백질 어셈블리보다는 단일 단백질 (1)에 의해 수행 될 것으로 생각된다. 결과적으로, 셀의 서브 유닛 단백질의 특정 생물학적 역할을 규명하기 위하여는 단지이 다른 단백질 또는 리간드와의 상호 작용의 구조를 이해하는 것이 필요하다. 그러나, 그들의 비공유 상호 작용과 활동을 유지, 기본적으로 단백질을 공부하고, 도전 남아있다. 천연 단백질 연구의 단점 중 하나는 다양한 하류 단백질 분석 기술과 호환되는 적절한 원시 분리 기술이다. 따라서, 생체의 비공유 어셈블리를 특성화 할 수있는 분리 기술에 대한 관심은 최근에 급격히 증가하고있다 (3). 단백질 분리 기술은 생화학, 생물 물리학 등 다양한 연구하는 것이 필수적이다. 현재 기본 분리 기술을 intrinsi낮은 해상도, 낮은 처리량, 강수량 감소, 초기 샘플 많은 양의 요구 사항으로 다운 스트림 분석, 호환성을 줄일 C 결핍. 탠덤 친 화성 정제는 일반적으로 단백질 상호 작용 연구를 위해 사용되지만, 그것은 높은 처리량 분석 4와 호환되도록한다 각 단백질 타겟에 대해 개별적으로 수행되어야한다. 크기 배제 크로마토 그래피 (5) 모두 기본 분리를 제공하지만, 본질적으로 저해상도 기술이며 높은 초기 샘플 량을 필요로 한 이온 친 화성 크로마토 그래피 (5) 밀도 구배 분리 6 선택적 침전. 대안 적으로, 청색 기본 (BN) 및 클리어 네이티브 (CN)과 같은 PAGE 겔 기반 기술 (중 1-D 또는 2-D)는, 고해상도의 분리를 표시. 또한, 다른 기술이 언급 대조, 네이티브 PAGE 분리는 광범위한 연구의 용해도 및 기본 형태를 유지소수성 단백질을 포함하는 고분자 종의 플랜지. 이 기능은 또한 이러한 방법 7,8에 의해 도달 프로테옴 범위를 넓혀 및 CN 및 BN-PAGE 사이에 다른 화학을 통해 달성된다. CN-PAGE는 일반적으로 BN-PAGE에서 쿠마 파란색 염료를 대체 캐리어 분자 소프트 충전 세제를 사용합니다. 높은 해상도와 관련된 있지만 BN-PAGE는 이러한 분리 된 단백질 8 쿠마 분자 부가 형성의 감소 효소 활성,이 후자의 다운 스트림 MS에 크게 편파적 인 9를 분석 같은주의 사항이 있습니다. 이 두 가지 방법은, 그러나, 전통적으로 인해 염색 및 젤 추출 제한 7을 둘러 복구 및 좁은 프로테옴 범위와 관련이있다. 변성 된 단백질의 연구를 위해이 높은 단백질 회복 고해상도 분별을 행하면서 고분자의 용해도를 유지 몇몇 기술은 다음과 그 D와 호환분리 후 단백질 분석 기술을 iverse. 젤 - 용출 액체 분수 내포 전기 영동 (GELFrEE)는 모든 이러한 특성에 맞게 분류 기법 중 하나입니다. 이 방법은 대부분이 신속하고 다목적 인 것을 나타내는, 높은 처리량 하향식 프로테오믹스 연구에 적용된다. GELFrEE에서 단백질이 변성되고 관형 겔 매트릭스를 통해 분자량에 기초한 분리의 기공율은 샘플 요건 및 원하는 분류 결과에 기초하여 변화 될 수있다. 분획 따라서 고해상도를 유지하면서, SDS-PAGE와 연관된 회수 제한을 감소 액상으로 용출된다. 분획 분액 후 분자량 대역폭 선택 (11) 1-D의 PAGE에 의해 분석 될 수있다. 기본 분리 기술에 GELFrEE과 관련된 이점에 대한 수요가있다. 본원에 기재된 방법은, 클리어 네이티브 GELFrEE (CN-GELFrEE)는 GELFrEE의 네이티브 적응된다. 위해 폭 넓은들과 호환 가능합니다그 나라의 상태에서 거대 분자의 pectrum,이 방법은 소프트 CN-PAGE 화학에뿐만 아니라 불연속 겔 시스템 (9)에 존재하는 다공성의 거친 전환을 제거하여 단백질 침전을 감소 다공성 기울기 분리에뿐만 아니라 의존한다. 마우스의 심장으로부터 추출 된 단백질 복합체를 분별에 적용될 때, 용출 된 분획을 회수하고 높은 얻었다 광범위한 분자량 고해상도 분리 표시. 또한, 얻어진 분획 하류 생화학 및 생물 물리학 적 단백질 분석 대부분 호환된다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% acrylamide/bis solution, 37.5:1</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0158</td><td>This solution is neurotoxic.</td></tr><tr><td>6-aminohexanoic acid (&amp;epsilon;-aminocaproic acid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2504</td><td>This chemical is an irritant.</td></tr><tr><td>Ammonium persulfate (APS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7727-54-0</td><td>This chemical is flammable, toxic, and corrosive.</td></tr><tr><td>Coomassie blue G250</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0406</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylmaltoside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4641</td><td>This chemical is an irritant.</td></tr><tr><td>Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)</td><td>FLUKA</td><td>3777</td><td>This chemical is toxic.</td></tr><tr><td>Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120</td><td>This chemical is toxic.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td>Any supplier</td><td>n/a</td><td>Store liquid nitrogen in containers&lt;br/&gt; designed for low-temperature&lt;br/&gt; liquids</td></tr><tr><td>Mouse heart</td><td>Bioreclamation LLC</td><td>MSE-HEART</td><td></td></tr><tr><td>n-butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>71-36-3</td><td>This chemical is flammable and toxic.</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BP103</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78430</td><td>This chemical is toxic.</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td>This chemical is an irritant.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>JTBaker</td><td>4097</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td>This chemical flammable and irritant.</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Amresco</td><td>M151</td><td></td></tr><tr><td>Trycine</td><td>Bio-Rad</td><td>161-071</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gradient mixer</td><td>Hoefer</td><td>SG15</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stir&amp;nbsp;</td><td>Any supplier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic bars&amp;nbsp;</td><td>Any supplier</td><td>n/a</td><td>Small enough to fit inside the gradiet mixer chambers.</td></tr><tr><td>Power supply</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5056</td><td>Voltage up to 1,500 V</td></tr><tr><td>Refrigerated centrifugue</td><td>Eppendorf</td><td>022622552</td><td>Up to 15,000 x g</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml conical tube</td><td>Any supplier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa-MWCO ultra centrifugal filter</td><td>Millipore</td><td>UFC503096</td><td></td></tr><tr><td>Flexible tubing</td><td>Saint-Gobain</td><td>B000FOV1J0</td><td>Approximately 1 m length</td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td>Any supplier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Liquid/air metallic or plastic valve. (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; aquarium air/water flow control lever valve)</td><td>Any supplier&amp;nbsp;</td><td>n/a</td><td>Aquarium valves are compatible.</td></tr><tr><td>Mortar and pestle</td><td>Any supplier</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Native PAGE 3-12% T slab gel</td><td>Invitrogen</td><td>BN1003</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>Protein low bind tube 1.5&amp;nbsp;ml</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>IDL Tools</td><td>TE05-091C</td><td></td></tr><tr><td>Regenerated cellulose dialysis tubing 3,500 MWCO</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-152-9</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE slab gel for any kDa</td><td>Bio-Rad</td><td>456-9036</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipets (25&amp;nbsp;ml)</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>Syringe (10 ml)</td><td>Any supplier</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

cn-gelfree - clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis

단백질 복합체는 중요한 세포 기능의 배열을 수행한다. 자신의 비공유 상호 작용과 역 동성을 해명하는 것은 생물학적 시스템에서 단지의 역할을 이해하는 데 중요합니다. 생체 분자 어셈블리 직접 특성화 최근 점점 더 중요 해지고 있지만, 질량 분석법을 포함한 다운 스트림 분석 기술과 호환되는 기본 분류 기술은 더욱 이러한 연구를 확장 할 필요가있다. 그럼에도 불구하고, 필드는 천연 단백질 어셈블리에 대한 높은 처리량, 넓은 범위의 높은 회수 분리 방법이 부족하다. 여기서는 비공유 단백질 어셈블리 신규 분리 양상을 분명히 네이티브 겔 용출 액체 분획 포착 전기 (CN-GELFrEE)를 제시한다. CN-GELFrEE 분리 성능은 마우스 마음에서 추출 분획 복합체에 의해 입증되었다. 분수는 2 시간에 걸쳐 수집 ~ 30에서 500 kDa의에 이르기까지 개별 밴드를 표시했다. 콘분자량의 대역폭을 증가시키는 일관된 패턴은 각각 ~ 100 kDa의 범위를 관찰 하였다. 또한, SDS-PAGE를 통해 네이티브 분획 후의 재분석 분자량 단백질 복합체의 변성과 일치 이동 하였다. 따라서, CN-GELFrEE 하류 단백질 분석과 호환되는 분획을 제공하는 넓은 분자량 범위에서 단백질 복합체의 고해상도 및 높은 회복 네이티브 분리를 수행 할 수있는 능력을 제공하는 것으로 판명되었다.

극저온 접지 마우스 하트 추출 단백질 200 μg의은 1-12% T 겔 관 CN-GELFrEE 방법을 이용하여, 150 ㎕의 각각의 14 분획으로 기본적 분획 하였다. 각 부분의 10 μL의 분취 스테인드 CN-PAGE 슬래브 젤은 실행되었다. CN-GELFrEE 분획 얻어진 분획 해상도의 명확한 묘사는도 2a에 도시된다. 분획을 두 시간에 걸쳐 수집하고, 겔 분석은 30 ~ 500 kDa의 범위의 분자량을 증가시키는 일...

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CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis

CN-GELFrEE - 지우기 기본 젤 - 용출 액체 분수 내포 전기 영동

This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding ...

cn-gelfree-clear-native-gel-eluted-liquid-fraction-entrapment

Research

JoVE Journal

Chemistry

11.5K 조회수.  Northwestern University. This protocol describes how to prepare and perform clear native gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis (CN-GELFrEE), a native separation technique for non-covalent biomolecular assemblies and proteins from heterogeneous samples that is compatible with various downstream protein analysis techniques.

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Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

Okay.Hi, my name is Celeste Peterson and I'm a fellow at Harvard University studying microbial bio film communities. So I am profiling the bacterial communities by looking at their 60 N sequence and how this sequence changes over time in space. And to do that, I'm using DDGE.This is not a normal acry of my well, it needs to be kept at 60 degrees when it's run and the buffer needs to be pumped continuously. So we're gonna warm up the buffer for about an hour until it's at 60 degrees, and then we can run the towel. Now I'm gonna wash this plate with dilute uc solution, peeling around for impurities, andone, light that up.Anything like that can cause regularities. It is important to wipe off all the water. So when I assemble the gel, I'll put that chip on the outside of the gel.So the gel will be in between these two pieces of glass and the chip will be on the outside and it won't affect the gel in between. So now I'm gonna assemble the gel in these clamps and then I squeeze them together and tighten by turning to the right. As with any gel, it's important to make sure that the bottom is flush.To prevent making, we now turn the gel around and put it in here to get sealed with the gasket. So it's important when you do this that the gel, that the plates are actually lined up with the gasket here. So these knobs on the side then go in and you press down to type the seal.So this is a 30 mil syringe. And this part and this part come with the bio red kit and it just on like this. And that's just to get rid of the excess water in the tubes.So put the tubing onto the gel to load the gel. First you put an adapter into the tubing and then a needle look with that small adapter and put it right in the center of the gel just so it's fairly below the bottom glass. Then this wire adapter goes into the long tubing and it's going to connect to equal syringes containing the high and the low density solution.So these are pre-prepared solutions. The blue one, I've added a dye here that just indicates that this is the most denaturing solution and this is the least fitting train solution, the low density one. And they have everything in them.And now I'm gonna to make, gonna be Actually I twice as much the week. And once you've got the tempt, you have about five to seven minutes to fill the gel before the colon rises. And now we fill the syringe juice with the solution.So I'm gonna fill it with about 15 the solution. And then to get rid of any air bubbles, I'll turn it upside down and squeeze gently until that top air bubble is gone. Now this little screw here is gonna go into this groove.This adapter is gonna line up with this clamp here, and it's gonna get C clamped in very tightly. And then this tubing is gonna attach to the syringe. And the same thing is done on the other side with the high density matrix where it's time to deliver.And so I'm gonna be turning this wheel in a steady clockwise motion. And first the blue solution is gonna go out first because that's the the most in nature, and it's gonna form the bottom part of the gel. And then after a little while, the clear solution will start filling in the gel and the Gradient will be formed.One moment is the gently on an angle to And as soon as you finish pouring the gel to wash out your tubes immediately because they will polymerize Going, It's the group there. And then press down. So this little, And on the other side, I'll do the same thing.Okay.Hi, my name is Celeste Peterson and I'm a fellow at Harvard University studying microbial bio communities. So I am profiling the bacterial communities by looking at their 60 F sequence and how the sequence changes over time in space. And to do that, I'm using DDGE.So DGE is Dena gel electrophoresis. And basically the idea is that there's a gradient and the DNA, as it runs down the gradient gets de natured. And so different 16 species will stop at different points along the gradient.And so it ends up being a fingerprint of the different sexiness species in the community. So the goal of my experiment is to see who is in the community and how that's changing over time and space. And I can run the sexiness DDD gel and then I can cut out the bands and identify the species that are represented in each community.So one of the biggest issues when, when doing A DDG gel is to figure out the gradient that's the best. And so that is just something that needs to be played around with and figuring out for a particular community which type of gradient. So the one I'm using today is 35 to 55%urea.One of the big problems that can happen with this technique is that smears come up in in the leans. And I found for that, for whatever reason, one of the best things to do is to run the gels for a really long time and then the smears disappear. Well, today I'm just using it for general bacterial communities, but this can also be used for a specific family of bacteria to see how those change over time, and those tend to be very clean gels.You can also look at mutations in single genes with DDGE.

Denaturing 그라디언트 젤 전기 영동 (DGGE)

연구

생물학

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

단백질의 전기 영동 분리

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

블루 기본 젤 전기 이동 법에 의해 Thylakoid 막 단백질 복합물의 분석

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

생화학

Fast and Sensitive Colloidal Coomassie G-250 Staining for Proteins in Polyacrylamide Gels

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and high quantitation. Furthermore, it is completely compatible with mass spectrometric protein identification. But despite these advantages, CBB is regarded to be less sensitive than silver or fluorescence stainings and therefore rarely used for the detection of proteins in analytical gel-based proteomic approaches.
Several improvements of the original Coomassie protocol1 have been made to increase the sensitivity of CBB. Two major modifications were introduced to enhance the detection of low-abundant proteins by converting the dye molecules into colloidal particles: In 1988, Neuhoff and colleagues applied 20% methanol and higher concentrations of ammonium sulfate into the CBB G-250 based staining solution2, and in 2004 Candiano et al. established Blue Silver using CBB G-250 with phosphoric acid in the presence of ammonium sulfate and methanol3. Nevertheless, all these modifications just allow a detection of approximately 10 ng protein. A widely fameless protocol for colloidal Coomassie staining was published by Kang et al. in 2002 where they modified Neuhoff's colloidal CBB staining protocol regarding the complexing substances. Instead of ammonium sulfate they used aluminum sulfate and methanol was replaced by the less toxic ethanol4. The novel aluminum-based staining in Kang's study showed superior sensitivity that detects as low as 1 ng/band (phosphorylase b) with little sensitivity variation depending on proteins.
Here, we demonstrate application of Kang's protocol for fast and sensitive colloidal Coomassie staining of proteins in analytical purposes. We will illustrate the quick and easy protocol using two-dimensional gels routinely performed in our working group.

This video shall popularize a colloidal Coomassie G-250 staining protocol according to Kang et al. for the detection of average 4 ng protein in gels. The staining is completed within 2 hours and without any effort. We routinely use Kang's protocol for analytical purposes in gel-based proteomics.

Polyacrylamide의 젤의 단백질에 대한 신속하고 민감한 콜로이드 쿠매시 G - 250 스테 이닝

Coomassie Brilliant Blue (CBB) is a dye commonly used for the visualization of proteins separated by SDS-PAGE, offering a simple staining procedure and ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

액상 복구와 분자량 기반 분류에 대한 GELFREE 8100 분획화 시스템을 사용하여

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

셀룰러 Lysates에서 Multiprotein의 단지의 분석을 위해 블루 기본 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (BN - PAGE)

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry and molecular biology researchers1-4. For laboratories that perform daily analyses of proteins, the cost of commercially available polyacrylamide gels (&tilde;$10/gel) can be considerable over time. To mitigate this cost, some researchers prepare their own polyacrylamide gels. Traditional methods of pouring these gels typically utilize specialized equipment and glass gel plates that can be expensive and preclude pouring many gels and storing them for future use. Furthermore, handling of glass plates during cleaning or gel pouring can result in accidental breakage creating a safety hazard, which may preclude their use in undergraduate laboratory classes. Our protocol demonstrates how to pour multiple protein gels simultaneously by recycling Invitrogen Nupage Novex minigel cassettes, and inexpensive materials purchased at a home improvement store. This economical and streamlined method includes a way to store the gels at 4&deg;C for a few weeks. By re-using the plastic gel cassettes from commercially available gels, labs that run frequent protein gels can save significant costs and help the environment. In addition, plastic gel cassettes are extremely resistant to breakage, which makes them ideal for undergraduate laboratory classrooms.

Our protocol demonstrates how to pour multiple protein gels at a time by recycling Invitrogen Nupage Novex minigel cassettes, and inexpensive materials purchased at a home improvement store. This economical and streamlined method includes a way to store the gels at 4&deg;C for a few weeks. By re-using the plastic gel cassettes from commercially available gels, labs that run frequent protein gels can save significant costs and help the environment.

상업 카세트를 재사용하여 물을 붓는과 단백질 젤 러닝

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

Separating Protein with SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their size and nothing else. SDS, an anionic detergent, is used to produce an even charge across the length of proteins that have been linearized. By first loading them into a gel made of polyacrylamide and then applying an electric field to the gel, SDS-coated proteins are then separated. The electric field acts as the driving force, drawing the SDS coated proteins towards the anode with larger proteins moving more slowly than small proteins. In order to identify proteins by size, protein standards of a known size are loaded along with samples and run under the same conditions.
This video presents an introduction to SDS-PAGE by first explaining the theory behind it and later demonstrating its step-by-step procedure. Various experimental parameters, such as the polyacrylamide concentration and voltage applied to the gel are discussed. Downstream staining methods like Coomassie and silver stains are introduced, and variations of the method, like 2D gel electrophoresis are presented.

Separating Protein with SDS-PAGE: Procedure and Applications

SDS-PAGE로 단백질 분리

Sodium Dodecyl Sulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis, or SDS-PAGE, is a widely-used technique for separating mixtures of proteins based on their ...

교육

JoVE Science Education

기초 생물학

세포 및 분자 생물학의 기본 테크닉

Two-Dimensional Gel Electrophoresis

Two-dimensional gel electrophoresis (2DGE) is a technique that can resolve thousands of biomolecules from a mixture. This technique involves two distinct separation methods that have been coupled together: isoelectric focusing (IEF) and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). This physically separates compounds across two axes of a gel by their isoelectric points (an electrochemical property) and their molecular weights.
The procedure in this video covers the main concepts of 2DGE and a general procedure for characterizing the composition of a complex protein solution. Three examples of this technique are shown in the applications section, including biomarker detection for disease initiation and progress, monitoring treatment in patients, and the study of proteins following posttranslational modification (PTM).
<div class="chapter_text" id="script_0">
Two-dimensional, or 2D, gel electrophoresis is a technique utilizing two distinct separation methods which can separate thousands of proteins from a single mixture. One of the techniques, SDS-PAGE or sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, cannot fully separate complex mixtures alone. 2D gel electrophoresis couples the SDS-PAGE to a second method, isoelectric focusing or IEF, which separates based on isoelectric points, allowing for the resolution of potentially all proteins in a cell lysate. This video will show the principles of 2D gel electrophoresis, a general procedure, and some of its biomedical applications.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_1">
2D gel electrophoresis begins with IEF as the first dimension. Every protein has a pH value, called the isoelectric point or pI, where the net charge is zero. When a protein is subjected to an electric field, it will move toward the electrode with opposite charge. Samples of interest are loaded onto immobilized pH gradient, or IPG, strips which have embedded ampholytes, molecules containing both acidic and basic groups. An electric field is then applied to the pH gradient strip, causing the proteins to migrate until they reach the pH value matching their pI, where they lose their net charge.
Prior to running the second-dimension, the embedded proteins are treated with SDS, denaturing them and providing a uniform negative charge. Once completed, the IPG strips are placed onto a polyacrylamide gel. An applied electric field draws the proteins toward the anode, with larger proteins moving more slowly through the gel.
Once the protein mixture has been separated according to pI and molecular weight, the proteome map is visualized using stains, and proteins of interest are identified.
Now that we have discussed the principles of 2D gel electrophoresis, let&#39;s go over a typical laboratory procedure.
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Before the experiment can be performed, the proteins must be solubilized into media. Solubilization of the sample is achieved by de-aggregating proteins with a combination of chaotropic agents for disrupting hydrogen-bonding interactions, nonionic detergents to prevent altering of the proteins&#39; charge, reducing agents to break disulfide bonds, and buffers. To remove interfering abundant proteins and other molecules, the material is sequentially extracted by centrifugation, and collection of the resulting pellet; followed by treatment with endonuclease, an enzyme used to consume any DNA that would interfere with the experiment.
Once the proteins have been solubilized, IPG strips are prepared by rinsing with a strip-cleaning solution and left upside-down to dry. Each strip is then assigned a strip holder number. Once ready, the cellular extract is loaded onto the strips in a slow, sliding motion from the negative to the positive end. For the purpose of rehydration, damp blotting paper is placed on top of the electrode and under the gel strips; the IPG strips are then lined onto the IEF instrument. A high electric current is applied, and the proteins begin to migrate.
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Following completion of the first dimension, the gel for SDS-PAGE is prepared in a casting apparatus. The IPG strips are treated by placing them face down in SDS-containing equilibration buffer. The electrophoresis unit is readied with the addition of electrophoresis buffer. The treated IPG strips are collected using tweezers, placed on top of the gel plates, and sealed with agarose-sealing solution. A voltage source then applies an electric field, which is held until the fastest-moving proteins are 1 cm from the bottom of the gel.
After completion of the electrophoresis, the proteins must be visualized. Traditionally this is performed by staining with Coomassie blue or silver nitrate. Proteins of interest may be transferred from the gel, and analyzed by Western blot analysis.
A second identification approach involves excision of the proteins from the gel, digesting them, than analyzing them by mass spectrometry.
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Now that we&#39;ve reviewed a procedure, let&#39;s look at some of the uses for 2D gel electrophoresis.
One of the most common uses for this technique is the identification of molecules involved in disease initiation and progression. 2D gel electrophoresis, coupled with mass spectrometry, can detect the up- or down-regulation of specific proteins in diseased areas in comparison to healthy ones.
Additionally, 2D gel electrophoresis is useful in following the progress of patients&#39; response to a potential therapeutic drug. Specimens may be taken from patients at various timepoints following administration of the treatment. In this way, 2D gel electrophoresis coupled with Western blot or mass spectrometry analysis, can detect proteins associated with negative responses such as inflammation; or the absence of proteins in an alleviated state.
Another use for 2D gel electrophoresis is in the study of protein structure and function following posttranslational modification, or PTM, which are additions to proteins following their translation from mRNA. PTM&#39;s can regulate a variety of functions, including protein signaling, gene expression, or cause oxidative damage. 2D gel electrophoresis is sensitive to modifications such as methylation or acetylation, which can cause a shift in pI as well as the molecular weight.
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You&#39;ve just watched JoVE&#39;s video on 2D gel electrophoresis. This video described the principles of the technique, a typical experimental procedure, and several of its applications in the field of biomedicine.
Thanks for watching!
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