This work was supported by National Institute of Health (1R01DK103150-01A1, T32 DK007639, R01CA175803, K08CA125209) and the Institute for Translational Sciences at the University of Texas Medical Branch, and a Clinical and Translational Science Award (8UL1TR000071).

폐기 인간의 수술 환자의 조직과 차 문화의 설립을 얻기위한 프로토콜은 텍사스 의료 분기 및 뉴 멕시코 임상 시험 심사 보드의 대학의 대학에 의해 승인되었다. 인체 조직 표본의 조달을위한 일반적인 요건은 다음과 같다. MFS 냉동 조직, 바이오 뱅크 및 상업 공급 업체에서 고립 될 수 있기 때문에 또한 실행 가능한 옵션입니다 있습니다. 1. 인체 조직을 구합니다 <ol><li> 승인 기관 심사위원회에 인간의 대장 조직을 얻기 위해 프로토콜을 제출합니다. </li><li> 연구를 위해 인체 조직을 얻기 위해 일반 외과 및 / 또는 대장 외과 의사와 협력을 설정합니다. 그들이 진단을 위해 필요하지 않습니다 및 연구를 위해 지정 될 수있다 조직을 결정하는 바와 같이 병리 부서와의 협력은 필수입니다. </li><li> grossl 후 종양에서 조직을 제공하기 위해 병리학 조언종양 정상적인 점막 Y 적어도 5cm. 즉시 얼음처럼 차가운 세척 매체에 샘플을 배치하고 얼음에 배치합니다. 병리학 연구를 위해 안전하게들 수 조직의 양을 결정할 것이다. MF 분리에 필요한 최소한의 티슈는 1.5 mm 2이다. </li><li> 미래의 격리를위한 -80 ° C에서 차 문화 또는 동결과 장소를 설정 얻어진 조직 중 즉시 사용합니다. <ol><li> -80 ℃에서 동결 미디어 (아래 참조), 저장의 1 ml의 극저온 튜브에 배치, 2 MM 2 개 - 나중에 분리에 대한 동결 경우, 약 1로 조직을 잘라. 참고 :이 프로토콜을 이용, 4 년 동안 동결 조직에서 MFS의 성공적인 분리가 관찰되었다. </li></ol></li></ol> 2. 시약 준비 <ol><li> 콜라게나 솔루션의 경우 : 칼슘과 행크의 균형 소금 용액 (HBSS) 100 U / ㎖ 콜라게나 제 I, II 및 IV 준비 / 마그네슘 2+ (재료 표 참조 </stronG&gt;). 주의 : 콜라게나 제 활성 단위 농도 및 순도 월 점막 세포 표면 에피토프 티슈 소화 및 / 또는 보존 효율을 방해 할 수 벤더 벤더마다 다르다. 이러한 가능성을 방지하기 위해 함정, 순도 (≥95 %)의 가장 높은 정도 콜라겐을 사용하여 활성 단위의 농도에 기초하여 상기 스톡 용액을 제조 하였다. </li><li> 10 밀리그램 / ㎖ (3.55 UA / mg)을 물 기반 DNase의 주식 솔루션을 준비합니다. </li><li> 워시 매체를 준비합니다 (MEM : 89 ml에, 항생제 - 안티 곰팡이, 100 배 : 1 ml의 열 불 활성화 FCS : 10 ㎖) </li><li> MEM : 섬유 아세포 성장 미디어를 준비 500ml의 병; L- 글루타민 (200 mM)을 5 ㎖; MEM 비 필수 아미노산, 100 배 용액 5 ml의; 염산 시프로플록사신 (10 ㎎ / ㎖) 570 μL; 항생제 안티 곰팡이, 100 배 용액 10 ml의; 피루브산 나트륨 (100 mM)을 5 ㎖; 열 불 활성화 FCS : 50 ㎖ </li><li> 동결 매체 제조 : 섬유 아세포 성장 배지 10 %의 디메틸 설폭 시드 부가 (DMSO)와 (시약 2.4) 후 - 필터링을 아이돌0.22 μm의 필터로 ilize. </li></ol> 3. 효소 다이제스트 인간의 조직 <ol><li> 조직이 따뜻한 (~ 37 ° C) 물에 동결 미디어, 장소 cryovial에 동결 된 경우 조직 및 미디어가 해동 될 때까지. </li><li> 4 - 조직의 2mm 2 개 5, 칼슘 / 마그네슘 2+없이 두 번 HBSS 10 mL로 조직을 씻는다. </li><li> 조직이 중력에 의해 정착되면, 조심스럽게 샘플을 회전하지 않고 상층 액을 버린다. </li><li> 샘플 콜라게나 제 용액 10 ㎖를 추가로 멸균의 DNase /의 RNase가없는 튜브로 조직 혼합액을 전송 내장 된 샘플 해리 용 로터. 상피 세포의 기저 부분을 둘러싸는 점막 고유 층의 비 세포 분획을 형성하는 세포 외 기질을 해리 콜라게나 제를 사용한다. </li><li> 단단히 가까운 튜브 및 dissociator (예를 들어, GentleMACs)의 소매에 거꾸로 부착. 연구소는 T로 액세스 권한이없는 경우그는 장비 상술 유사한 결과를 얻기 위해 각각의 분해 공정의 시간을 증가시킨다. </li><li> 프로그램 h_tumor_01을 실행, 미리 설정된 프로파일은 기계 (- 실행 당 268 원과 4,000 rpm으로,에 이르기까지 간헐적 인 펄스와 36 초 총 지속 시간, 1,000)에 포함. </li><li> 프로그램의 종료 후, 관 dissociator로부터 분리. </li><li> 140 rpm에서 진탕 기에서 연속 회전에서 37 ° C에서 45 분 동안 샘플을 품어. 주 : 조직 샘플의 양을 변화시키기위한, 소화 시간은 비례 적으로 감소하거나 증가 될 수있다 (즉, 조직의 더 많은 양의 추가적인 시간이 필요할 수 있음). </li><li> dissociator의 소매에 거꾸로 튜브를 연결합니다. </li><li> (- 실행 당 235 원으로, 4,000 RPM 1,000에 이르기까지 간헐적 인 펄스, 37 초 총 시간)을 선택하고 프로그램 h_tumor_02를 실행합니다. </li><li> 프로그램의 종료 후, 관 dissociator로부터 분리. </li><li> DNase의 주식 솔루션의 50 μl를 추가. / 해리 죽은 세포와 응집 셀에 이르게 세포 파편의 DNA의 일부를 제거하기 위해 DNase를 사용합니다. </li><li> 60 rpm에서 진탕에 연속 회전에서 37 ° C에서 30 분 동안 샘플을 품어. </li><li> 다시 dissociator의 소매에 거꾸로 튜브를 연결합니다. </li><li> (- 실행 당 168 원으로, 4,000 RPM 1,000에 이르기까지 간헐적 인 펄스, 37 초 총 시간)을 선택하고 프로그램 h_tumor_03를 실행합니다. 주 : 조직이 완전히 분해되지 않는 경우 20 ° C에서 10 분 동안 250 × g에서 원심 분리, 세포 해리 용액 2 ml의 상등액을 폐기 재현 탁하고 실온에서 10 분 동안 배양한다. </li><li> 멸균 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 전달합니다. </li><li> 20 ° C에서 10 분 동안 250 × g에서 원심 분리 세포 현탁액. 대기음이 완전히 뜨는. </li><li> 세척 세포 칼슘 / 마그네슘 2+없이 두 번 HBSS 25 mL를 펠렛과 상층 액을 버린다. </li><li> 마지막으로 이전했다H는, 실험실에서 사용 가능한 자동화 된 셀 카운팅 시스템을 사용하거나 수동 혈구를 사용하여 세포 수를 카운트. MF 차 문화의 생성을위한 분석 단계 3.19.1 동안 진행 또는 단계 3.19.2 동안 진행 유동 세포 계측법 사용 MFS의 정렬. <ol><li> 분리 및 순수 MF 문화의 성장 (그림 1)의 경우, 미디어의 3 ㎖에 4 × 10 6 셀을 배정하는 데 필요한 섬유 아세포 절연 매체의 적절한 양의 마지막 원심 분리에 resuspend 세포 펠렛에서 뜨는을 버리고 당 잘 6 아니라, 세포 배양은 처리 플레이트. 3.20 단계로 진행합니다. </li><li> 분석을 위해 또는, 유동 세포 계측법 (24)의 섬유 아세포 분리 미디어 2 ㎖에 2 × 10 6까지 배치 아니라, 낮은 바인딩 플레이트와 5 % CO 2와 37 ° C에서 O / N을 배양하여 MFS의 정렬. 이것은 효소 적 절차에 의해 영향을받을 수있는 세포 표면 에피토프를 복원하는 것이다. 그런 다음 세포 현탁액을 수집하고 복구 세포를 계산하고 진행및 면역 염색에 대한 분석 8 유동 세포 계측법. </li></ol></li><li> 5 % CO 2, 37 ℃에서 세포를 성장한다. 80 %의 합류 MF 단층 ~의 형성 (그림 1D-E)까지 3 일 - 매 2 미디어를 변경합니다. </li><li> 통로 6 웰 플레이트에서 비율 1에서와 T25 플라스크에 세포 : 1 ~ 10 성장 - 100 % 컨 플루 - 섬유 아세포 성장 매체의 14 일 (80)을 달성했다. </li><li> 2 : 1 비율로 T75 세포 T25에서 세포를 계대에 의해 문화를 확장합니다. 세포가 포화 상태에 도달하면, 이전에 5 바와 같이 유동 세포 계측법에 의해 사용 고립 MF 순도의 분석을 위해 하나의 플라스크를 사용합니다. 3 : 1 비율로 MF 문화의 또 다른 T75 플라스크를 동결 또는 통로. 참고 : EpCAM-, CD31-, CD45-, 멘틴의 + α-SMA +, CD90 + : 유동 세포 계측법에 의해 분석 할 때,이 중간 엽 기원의 GI 점막 기질 MF 문화에서 성장하는 것은 다음과 같은 표현형을 때 것으로 예상된다. </li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

이 프로토콜은 잠재적 인 암 예후 바이오 마커 및 치료 대상으로 기질 세포의 매우 중요한 성장의 빛만을 조사 어플리케이션을 위해 개발되었지만, 나중에 사용하기 위해 &quot;기능적&quot;biospecimens을 고정 할 수있는 능력은 상당한 이점을 제공한다. 이 개인화 된 약 10, 11의 개발을 진행하는 역할을하는 등의 추가 도구를 제공 할 수있는, 임상 biorepository의 생성을위한 독특한 장점을 나타낸...

근섬유 아세포는 / 섬유 아세포 (MFS)은 위장관 점막 세포의 풍부한 인구를 나타냅니다. 이러한 기질 세포는 상피 아래에 위치하며, 장내 점막 고유 층 내에서 상호 연결된 네트워크를 형성하고 있습니다. MFS하지 외 기질의 증착 만 담당하지만, 분비 조절을 통해 인접한 상피 1, 2의 전해질 수송 반발 및 장벽 기능에 영향을 미칠 수있다. 또한, MFS 염증 및 조직에서 중요한 역할을하는 것으로 나타났다 3,4- 리모델링. 근섬유 아세포는 또한 암 - 관련 아세포로 알려진 종양 미세 환경의 중요한 부분이며, 종양 세포 성장에 기여 암 줄기 세포 (3)에 대한 틈새의 역할을한다. 신흥 데이터는 MFS는 또한 지역의 항원 제시 세포를 제공 할 수 있음을 시사한다. 또한, MFS 기능 타고난 및 적응 면역 반응의 중요한 규제, produ의사이토 카인과 성장 인자 (5)의 다양한 향하도록. 건강한 사람에서, MFS 세포는이 세포는 vimentin에 긍정적이다. 중간 엽 줄기 세포로부터 분화와 그 세포 표면, 중간 엽 마커, CD90 3, 5에 표현하는 것으로되어 있지만, 상피 및 조혈 세포 마커는 EpCAM과 CD45에 대한 부정적인 각각. 근섬유 아세포가 섬유 아세포의 활성화 된 형태로 제시되고, α-SMA (5)의 식에 의해 비 활성화 된 섬유 아세포에서 구별 될 수있다. 지난 10 년 동안, 인간 대장 점막에서 근육 섬유 모세포의 분리를위한 여러 방법이 게시-주로 원래 Mahida 외. 5-8에서 기술 된 방법에 기초하고있다. 개별 연구는 다양한 장내 점막, 여러 위장관의 영역 (즉, 위, 작은 l로부터 MFS의 분리에 대한 더 보편적 인 프로토콜에서 분리 절차를보고 있지만ARGE 장 점막)이 출판되었습니다. 본 명세서에서 프로토콜은 테스트를 성공적으로 상술 한 조직의 세 종류에 사용되어왔다. . 또한, 냉동 GI 점막에서 MFS를 단리하기위한 절차는보고되지 않았다. 여기, 우리는 효소 소화를 기반으로하는 최적화 된 방법을 제시하고, 동시에 문화에 대한 인간의 장내 점막 MFS의 분리를 허용 갓 소화, 단일 세포, 점막 준비에 분석 유동 세포 계측법. 이 기술은 확실하게 MF 표현형과 차 문화를 산출한다. 또한, 동일한 방법뿐만 아니라 위 및 소장 동결 조직 시료로부터 MFS를 분리하는데 사용될 수있다. 신선한 GI 조직으로부터 근육 섬유 모세포의 분리는 전술 한 내용; 그러나, 냉동 검체의 사용은 많은 이점을 제공한다. 즉, 연구자들은 capabi가 전 세계에 걸쳐 공동 작업자의 숫자에서 수집하고 저장하는 조직 할 수있을 것입니다lity 냉동 조직 샘플을 제공합니다. 또한, 연구진은 현재 실험 일정과 충돌에 절연을위한 조직을 처리 수술실 및 / 또는 내시경 제품군 즉시에서 폐기 조직의 컬렉션을 찾을 수 있습니다. 또한, 수술의 예측할 수없는 특성으로 인해, 조직 조달은 처리 조직에 대해 남아있는 시간을 제한 할 매우 늦게 하루에 발생할 수 있습니다. 나중에 처리를 위해 조직을 동결하는 것은 이러한 문제를 개선 할 것이다. 마지막으로,이 방법은 성공적으로 대장 암과 염증성 장 질환 등의 질병 상태에서, 대장 위 및 소장 근육 섬유 모세포의 분리에 활용되고있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="719">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">MEM, 1X</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MT-10-010-CV</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Antibiotic-Antimycotic, 100X</td>
			<td style="width:111px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Ciprofloxacin HCl</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">61-277-RF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">L-Glutamine, 100x</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-005-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">MEM Nonessential Amino Acids</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">25-025-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Hybri-Max</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">DL-Dithiothreitol solution (DTT)</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td style="width:111px;">Cellgro</td>
			<td style="width:119px;">46-034-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">DNAse</td>
			<td style="width:111px;">Worthington</td>
			<td style="width:119px;">LS002139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Collagenase from&#160;Clostridium histolyticum, Type I</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C1639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Collagenase from&#160;Clostridium histolyticum, Type II</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C1764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:323px;">Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Accumax cell dissociation solution</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">gentleMACS C Tubes</td>
			<td style="width:111px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">gentleMACS Dissociator</td>
			<td style="width:111px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Countess Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C10227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Cell Strainer (70&#181;m)</td>
			<td style="width:111px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">PE Mouse Anti-Human Vimentin</td>
			<td style="width:111px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">562337</td>
			<td>Clone RV202</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">FITC Monoclonal Anti-Actin, &#945;-Smooth Muscle</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F3777</td>
			<td>Clone 1A4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">APC Mouse Anti-Human CD90</td>
			<td style="width:111px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">559869</td>
			<td>Clone 5E10</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cd 90+ fibroblast/myofibroblasts from human frozen gastrointestinal specimens

섬유 아세포 / 근육 섬유 모세포 (MFS)의 발병 기전에서의 역할과 종양 미세 환경 모두 상처 치유 및 홍보에 대한 그들의 공헌 증가 주목을 받고있다. 현재 위장관 (GI) 조직에서 MFS의 분리를위한 많은 기술이 있지만,이 프로토콜은 냉동 조직에서 이러한 기질 세포의 분리의 새로운 요소를 소개합니다. GI 조직 표본을 동결하는 것은뿐만 아니라 전 세계적으로 공동, 바이오 뱅크, 상업 공급 업체의 샘플을 수집 할 수있는 연구자가, 그것도 신선한 샘플의 지연 처리를 허용 할 수 있습니다. 설명 프로토콜은 지속적으로 마커 CD90, α-SMA 및 멘틴을 표현 MF 표현형과 특성 스핀들 모양의 세포를 얻을 것입니다. 이러한 세포가 환자 샘플에서 유래 된 바와 같이, 일차 전지의 사용은 질환 상태 - 즉 암 및 염증성 장 질환으로부터 가깝게 모방 MFS의 이점을 부여한다. 이 기술은 꿀벌이N 위, 소장 및 대장 MF 차 문화 발전에 확인. MF 일차 배양 통로 걸쳐 실험의 광대 한 배열로 사용될 수 있고, 그 순도는 모두 면역 세포 화학 분석에 의해 평가하고, 유동 세포 계측법.

이 효소 소화 프로토콜을 사용하여, 우리는 지속적으로 분리하고 위장관 수술 표본과 생체 검사 (그림 1)에서 MF 인구 굿 CD90 + 점막 기질 세포 성장을 할 수 있었다. 6 웰 플레이트 (그림 1A-B)로 단핵 세포 현탁액 시드 - 5 보이는 MF 식민지 증식은 2 일에 관찰 할 수있다. MF 차 문화 도달 ~ 50 - 11 (그림 1C-D) - 7 일 70 %의 합류. <p cla...

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Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, &#945;-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.

인간의 냉동 위장 표본에서 CD 90+ 섬유 아세포 / 근섬유 아세포의 분리


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

isolation-cd-90-fibroblastmyofibroblasts-from-human-frozen

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.5K 조회수.  University of Texas Medical Branch. Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, α-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production. 

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Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated from human muscle biopsy samples using enzymatic digestion and their myogenic properties studied in culture. Quantitatively, the two main adherent cell types obtained from enzymatic digestion are: (i) the satellite cells (termed myogenic cells or muscle precursor cells), identified initially as CD56+ and later as CD56+/desmin+ cells and (ii) muscle-derived fibroblasts, identified as CD56&#8211; and TE-7+. Fibroblasts proliferate very efficiently in culture and in mixed cell populations these cells may overrun myogenic cells to dominate the culture. The isolation and purification of different cell types from human muscle is thus an important methodological consideration when trying to investigate the innate behavior of either cell type in culture. Here we describe a system of sorting based on the gentle enzymatic digestion of cells using collagenase and dispase followed by magnetic activated cell sorting (MACS) which gives both a high purity (&#62;95% myogenic cells) and good yield (~2.8 x 106 &#177; 8.87 x 105 cells/g tissue after 7 days in vitro) for experiments in culture. This approach is based on incubating the mixed muscle-derived cell population with magnetic microbeads beads conjugated to an antibody against CD56 and then passing cells though a magnetic field. CD56+ cells bound to microbeads are retained by the field whereas CD56&#8211; cells pass unimpeded through the column. Cell suspensions from any stage of the sorting process can be plated and cultured. Following a given intervention, cell morphology, and the expression and localization of proteins including nuclear transcription factors can be quantified using immunofluorescent labeling with specific antibodies and an image processing and analysis package.

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

연구

발생학

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of multipotent, self-renewing, and expandable neural stem cells. In serum conditions, these multipotent NSPCs will differentiate, generating neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. The harvested tissue is enzymatically dissociated in a papain-EDTA solution and then mechanically dissociated and separated through a discontinuous density gradient to yield a single cell suspension which is plated in neurobasal medium supplemented with epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), and heparin. Adult rat spinal cord NSPCs are cultured as free-floating neurospheres and adult human spinal cord NSPCs are grown as adherent cultures. Under these conditions, adult spinal cord NSPCs proliferate, express markers of precursor cells, and can be continuously expanded upon passage. These cells can be studied in vitro in response to various stimuli, and exogenous factors may be used to promote lineage restriction to examine neural stem cell differentiation. Multipotent NSPCs or their progeny can also be transplanted into various animal models to assess regenerative repair.

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

뇌실 주위 백질 성인 쥐의 지역 및 인간의 척수에서 신경 줄기 / 전구 세포의 분리

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-Myc), typically expressed by human embryonic stem cells (hESCs). Due to their similarity with hESCs, iPSCs have become an important tool for potential patient-specific regenerative medicine, avoiding ethical issues associated with hESCs. In order to obtain cells suitable for clinical application, transgene-free iPSCs need to be generated to avoid transgene reactivation, altered gene expression and misguided differentiation. Moreover, a highly efficient and inexpensive reprogramming method is necessary to derive sufficient iPSCs for therapeutic purposes. Given this need, an efficient non-integrating episomal plasmid approach is the preferable choice for iPSC derivation. Currently the most common cell type used for reprogramming purposes are fibroblasts, the isolation of which requires tissue biopsy, an invasive surgical procedure for the patient. Therefore, human peripheral blood represents the most accessible and least invasive tissue for iPSC generation.
In this study, a cost-effective and viral-free protocol using non-integrating episomal plasmids is reported for the generation of iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats after whole blood centrifugation and without density gradient separation.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a source of patient-specific tissues for clinical applications and basic research. Here, we present a detailed protocol to reprogram human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats into viral-free iPSCs using non-integrating episomal plasmids.

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human development and investigate the pathophysiology of disease. By employing site-specific nucleases (SSNs) for genome editing, the rapid derivation of new hPSC lines harboring specific genetic alterations in an otherwise isogenic setting becomes possible. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 are the most commonly used SSNs. All of these nucleases function by introducing a double stranded DNA break at a specified site, thereby promoting precise gene editing at a genomic locus. SSN-meditated genome editing exploits two of the cell&#39;s endogenous DNA repair mechanisms, non-homologous end joining (NHEJ) and homology directed repair (HDR), to either introduce insertion/deletion mutations or alter the genome using a homologous repair template at the site of the double stranded break. Electroporation of hPSCs is an efficient means of transfecting SSNs and repair templates that incorporate transgenes such as fluorescent reporters and antibiotic resistance cassettes. After electroporation, it is possible to isolate only those hPSCs that incorporated the repair construct by selecting for antibiotic resistance. Mechanically separating hPSC colonies and confirming proper integration at the target site through genotyping allows for the isolation of correctly targeted and genetically homogeneous cell lines. The validity of this protocol is demonstrated here by using all three SSN platforms to incorporate EGFP and a puromycin resistance construct into the AAVS1 safe harbor locus in human pluripotent&#160;stem cells.

Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.

게놈 편집 인간 다 능성 줄기 세포의 설립 : 분리에 타겟팅에서

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

Herein we describe methods for the dissection of fetal and maternal tissues from human term placenta, followed by isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells (MSC) from these tissues.

인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34- pericytes and vascular CD34+CD146- adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Human cardiac tissue harbours multipotent perivascular precursor cell populations that may be suitable for myocardial regeneration. The technique described here allows for the simultaneous isolation and purification of two multipotent stromal cell populations associated with native blood vessels, i.e. CD146+CD34- pericytes and CD34+CD146- adventitial cells, from the human myocardium.

인간의 심장 조직에서 혈관 주위 능성 전구체 세포 집단의 분리

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

인간 제대혈 및 태아 태반에서 중간 엽 기질 세포의 분리 및 특성

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and colleagues1. Later, others documented the existence of similar types of EPCs originating from bone marrow2,3. More recently, Yoder and Ingram showed that EPCs derived from umbilical cord blood had a higher proliferative potential compared to ones isolated from adult peripheral blood4,5,6. Apart from being involved in postnatal vasculogenesis, EPCs have also shown promise as a cell source for creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs7,8. Various isolation protocols exist, some of which involve the cell sorting of mononuclear cells (MNCs) derived from the sources mentioned earlier with the help of endothelial and hematopoietic markers, or culturing these MNCs with specialized endothelial growth medium, or a combination of these techniques9. Here, we present a protocol for the isolation and culture of EPCs using specialized endothelial medium supplemented with growth factors, without the use of immunosorting, followed by the characterization of the isolated cells using Western blotting and immunostaining.

The goal of this protocol is to isolate endothelial progenitor cells from umbilical cord blood. Some of the applications include using these cells as a biomarker for identifying patients with cardiovascular risk, treating ischemic diseases, and creating tissue-engineered vascular and heart valve constructs.

인간 탯 줄 혈액에서 내 피 조상 세포의 고립

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

분리와 인간 성인 그리고 태아 심장 표본에서 파생 하는 기본 Epicardial 세포의 문화

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...