RP는 국립 보건 의료 연구위원회 (NHMRC) 박사후 연수 원정대에 의해 지원되었다. VS는 대학 퀸즐랜드 국제 대학원 학생의 장학금으로 지원되었다. MRD는 NHMRC 및 내부 휠 호주에 의해 지원되었다. 우리는 환자의 동의 및 샘플 컬렉션 지원에 대한 임상 간호 직원을 감사드립니다. 우리는 산부인과에서 통찰력 토론, 태아 - 태반 개발 및 태반 해부학에 대한 교수 Nickolas 피스크 교수 케리 앳킨슨 박사 로한 Lourie 감사합니다.

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

태반은 태아 또는 모체 MSC 22을 분리 할 수있는 것을 말하고, 물리적으로 대형 기관이다. 여기서, 우리는 구체적으로 탈락 (임산부), 융모막 융모 (태아)와 융모 판 (태아) 조직 (2.2-2.4 단계) 해부하는 방법에 대한 태반 해부학과 명령의 자세한 개요를 제공했다. 다음으로, 우리는 이들 세 조직 (2.5-2.6 단계) 각각으로부터 MSC 분리 가능 강력한 프로토콜을 설명했다. 태반 MSC 확장은 효율적이고 배양 골수 - 유래 MSC 배양 (도 3 및도 4)과 유사한 나타난다. 지방 세포 분화는 일반적으로 (그림 5C) 5 비효율적 동안 골 형성 분화는 (그림 5B) 신뢰할 수있다. 분야에 많은 신규 이민자는 태아의 융모막 융모 또는 융모 판 조직에서 파생 된 문화가 태아 MSC에 대한 풍부한 될 것으로 추정됩니다. 그러나, 우리의 손에 철탈 세포 농축는 일시적인 경우 등 DMEM-LG + 표준 MSC 확장 FBS 배지 5를 이용 10 %. 여기에서 우리는 남자 아기에서 파생 된 태반 조직을 사용하는 대표적인 결과를 제공합니다. 모체 세포 XX 염색체를 갖는 것으로 식별하는 동안 수형 아기의 태반 조직을 사용하여 태아 세포는 용이하게 특정 가능 XY 염색체를 갖는 것으로한다.도 6은 대표적인 배양 XY 물고기 결과를 나타낸다. 태아 MSC (XY)이 태아 융모 또는 융모 판 조직 유래 초기 배양에서 (최대 80 %) 농축되어 있지만,이 같은 문화 신속 처음 두 통로 위에 (~ 100 %) 모체 그래피 (XX) MSC 뽑힌되고 . 표준 매체에서, DMEM-LG + 10 % FBS, 태아 조직 문화의 태아 유래 세포를 outcompete 오염 몇 산모의 유래 MSC로 구성. 이 프로토콜에 설명 된 중요한 단계는 태반 해부학 어디 태아에서 감사입니다산모 조직을 가장 효과적으로 수확 할 수있다. 대표적인 결과 섹션에 설명 된대로, 태아 조직의 박리는 태아 유래 MSC에 대한 과도 농축을 가능하게 않습니다. 확장 배지 제형 개선은 특정 외인성 성장 인자 배지 보충으로 태아 유래 MSC 인구의 선택적 확장을 허용하고, (우리 그룹은 이러한 매체 제형을 개발하고있다) 태아보다는 모체 세포 충실 셀 제품을 제조한다. 태아 MSC가 큰 혈관 및 등가 모체 MSC 인구 (37)보다 면역 억제 특성을 갖는 것으로 추정 된대로 태아 MSC 집단의 제조는 다수의 장점을 가질 수있다. 상술 분리 각 프로토콜에서는 조직의 약 10g을 사용 하였다. 전체 태반은 일반적으로 500~750g이며, 이전의 연구에서 우리는 증명이 자동화 된 조직 다이제스트 및 셀 확장 생물 반응기 시저를 통해이 가능해야 esses 번의 태반 4에서 7,000 세포 임상 용량을 제조한다. 이 숫자에 관계없이 (태아 나 산모) MSC 기원 태반 유래 동종 MSC 치료에 MSC,이 방법의 중요성의 잠재적 인 적합성을 강조 표시합니다. 치료 적 관점에서, 사용자가 휴대 제품 신뢰성이 셀 제품을 제조 할 수있는 능력의 완전한 이해하는 것이 가장 중요하다. 우리는 우리의 비디오, 태반 해부학을 이해 태반에서 MSC를 분리, 그들의 문화의 가능성이 태아 나 모체 세포 조성물을 예상하는 연구자 도움이되기를 바랍니다.

중간 엽 줄기 / 간질 세포 (MSC)는 세포 기반 치료 (1)에서의 사용을위한 유망한 후보로 부상하고있다. 대부분의 응용 프로그램은 MSC 매개 조직 복구 또는 면역 조절 (2)을 대상으로 나타납니다. 이러한 응용 프로그램의 많은에서는 동종 MSC는자가 MSC 3만큼 효과적 일 수있다. 동종 MSC의 사용은 많은 환자를 치료하기위한 단일 소스 조직 (4)로부터 복수의 셀 용량의 대규모 제조와 호환되는 경제적 인 이점을 갖는다. 역사적으로, 전임상 및 임상 연구는 골수 (4)로부터 MSC가 유래 이용했다. 골수는 일반적으로 자원 봉사 기증자의 장골에서 수집됩니다. 이 과정은 침습적이고, 골 (~ 20 ㎖)의 단지 소량의 단일 구멍을 통해 수집된다. MSC의 임상 적으로 의미있는 숫자를 생성하는 체외 확장에 광범위한 필요합니다. 세포 효능 통로 수 감소 <sup&gt; (3), 임상 적 효능에 필요한 세포의 이론적 개수가 더 많은 세포 집단이 팽창 증가 역설 작성. 골수 흡인과는 대조적으로, 용어의 태반은 기증자에 대한 위험없이 제왕 절개 수술시 무균 수확 할 수있는 물리적으로 큰 시작 조직 (일반적으로 5백~7백50g 4)이다. 태반 유래의 MSC는 골수 - 유래 MSC 우수한 장기간 증식 5 및 면역 조절 용량 (6)을 갖는다. 이전의 연구는 단일 용어 태반 최대 7000 임상 용량 (4)의 제조를 위해 충분한 MSC를 함유하는 것으로 보였다. 이러한 특성은 동종 MSC의 제조를위한 이상적인 소스 태반 조직을 만든다. 태반은, 이론적으로 고립 될 수 있습니다 태아 나 산모의 기원의 것을 말하고, 모두 태아와 산모의 조직 (7)로 구성된 기관, 따라서 MSC이다. 다음 참조 드를 제공개발 및 병리에 꼬리 정보뿐만 아니라, 인간 태반 부속기 8,9 현미경 및 육안 검사. 태반은 적절한 융모막의 frondosum (판) (8)에 의해 덮여 융모막 융모를 구성하는, 주로 태아의 혈관과 분비 및 trophoblasts라고지지 세포로 구성되어 있습니다. 지형 태반 융모는 영양, 호르몬 및 태아와 어머니 사이의 가스 교환을 가능하게 자궁 나선형 동맥에서 전달 된 산모의 혈액에서 목욕을하고 있습니다. 태반은 산모의 탈락 기질 세포와 태아 extravillious trophoblasts를 통해 자궁 내막에 고정되어이 세포 외 기질 (8)에 산재되어있다. 융모는 탯줄 (8)을 형성하는 태아의 융모 판에 수렴. 태반 - 유래 줄기 세포에 대한 최초의 국제 워크샵의 결과 (2008)을 분리 및 characterizatio 표준화 필요성의 하락했다인간의 장기 태반 (10)에서 세포의 N. 때문에 태반의 해부학의, 다른 조직의 절개는 MSC의 분리 및 예상 배양 결과는 필드 이민자를위한 압도 할 수있다. 이 프로토콜에서, MSC 분리 및 확장 뒤에 태반 융모 조직의 수확은 철저하게 자세히 설명되어 있습니다. 유동 세포 계측법을 통해 체외 분화 MSC 특성화 일상 5,11-13 간주하고, 따라서 간략 여기에 자세히 설명되어 있습니다. 최근의 체계적 문헌 고찰 (14)에서 강조 바와 같이, MSC는 태반의 융모막 융모는 일반적으로 태아로 가정에서 얻을. 하지만, 연구의 18 %를 수득 한 MSC의 출처를 조사하고, 그 중, 연구의 절반 태아 MSC 나머지 절반은 모체 또는 혼합 MSC 집단보고를보고 하였다. 본 명세서에 설명 된 세 가지 조직 각 구성 요소 (융모, 융모 접시 탈락 basalis)는 완있다주로 태아 막 / 융모 및 전달 태반에 부착 된 상태를 유지 자궁 모체 유래 세포의 소량의 osed. 우리는 데이터를 모체 MSC 싶은 경우는 우리가 이전 5,11보고 한 바와 같이, 태반의 모체 측보다는 태반 태아 측으로부터 MSC 분리,보다 적절한 출발 물질임을 증명 제공한다. 이 프로토콜은 또한 세포 배양에 태아 나 산모의 기여를 검증하는 XY 생선의 사용을 설명합니다. 이 제조 업체에서 표준 프로토콜 인 반면,이 분석은 종종 무시하고 그 중요성 14을 과소 평가한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1131">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:337px;">Reagents</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:555px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">HBSS</td>
			<td style="width:121px;">Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14185-052</td>
			<td>Long name: Hanks Balanced Salt Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">FBS</td>
			<td style="width:121px;">Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Long name: Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">trypsin-substitute</td>
			<td style="width:121px;">Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">12563-029</td>
			<td>Long name: TrypLE Select</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">DMEM-LG</td>
			<td style="width:121px;">Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11885-092</td>
			<td>Long name: Dulbecco&#8217;s Modified Eagles Medium-Low Glucose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">DMEM-HG</td>
			<td style="width:121px;">Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11965118</td>
			<td>Long name: Dulbecco&#8217;s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">PBS (Mg+Ca+ free)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">14190-250</td>
			<td>Long name: Dulbecco&#39;s Phosphate buffered saline, magnesium and calcium free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Anti- anti-</td>
			<td style="width:121px;">Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td>Long name: antibiotic-antimycotic solution x100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">paraformaldehyde powder or 4% solution</td>
			<td style="width:121px;">any&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Collagenase I</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">17100-017&#160;</td>
			<td>2500U/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Dnase I</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5025</td>
			<td>10 mg/mL in&#160; 0.15 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Dispase</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">17105-041&#160;</td>
			<td>10 mg/ml in water (20,000 U/ml).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Material</td>
			<td style="width:121px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Disposables:</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">50 ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:121px;">Falcon or any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">petri dishes, sterile plactic (25 cm and 10 cm diameter)</td>
			<td style="width:121px;">Nunc</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell strainers (100 micron)</td>
			<td style="width:121px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">175 and 75 cm2 (T175 and T75) tissue culture flasks</td>
			<td style="width:121px;">Nunc</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 ml, 10 ml, 25 ml sterile serolgical pipettes</td>
			<td style="width:121px;">any brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Material</td>
			<td style="width:121px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Equipment:</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Centrifuge&#160;&#160;</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">&#160;tissue culture incubator 37 degrees celcius, 5 % CO2</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biological safety cabinet</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Sterile scissors and tweezers</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube racks&#160;</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette-boy or equivalent</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gilson type pipetters and sterile tips 1000 &#181;l, 200 &#181;l, 20 &#181;l.</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">rocking or shaking incubator (37 degrees celcius)</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">personal protective equipment</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">cleaning solutions (suitable for blood)</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">waste containers, correct disposal bins for tissue/blood</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Reagents for MSC characterization</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibody (Clone ID)</td>
			<td>Manufacturer</td>
			<td>Catalogue No.</td>
			<td>Isotype</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">CD73 (AD2)</td>
			<td style="width:121px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-095-183</td>
			<td style="width:555px;">Mouse IgG1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">CD105 (43A4E1)</td>
			<td style="width:121px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-094-941</td>
			<td style="width:555px;">Mouse IgG1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">CD90/Thy-1 (AC122)</td>
			<td style="width:121px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-095-403</td>
			<td style="width:555px;">Mouse IgG1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">CD45 (5B1)</td>
			<td style="width:121px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-080-202</td>
			<td style="width:555px;">Mouse IgG2a</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">CD34 (AC136)</td>
			<td style="width:121px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-090-954</td>
			<td style="width:555px;">Mouse IgG2a</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">HLA-DR (AC122)</td>
			<td style="width:121px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-095-298</td>
			<td style="width:555px;">Mouse IgG2a</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">CD31 (PECAM-1)</td>
			<td style="width:121px;">BD Pharmingen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">555446</td>
			<td style="width:555px;">Mouse IgG1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">CD146 (541-10B2)</td>
			<td style="width:121px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-849</td>
			<td style="width:555px;">Mouse IgG1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">CD44 (DB105)</td>
			<td style="width:121px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-095-180</td>
			<td style="width:555px;">Mouse IgG1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Isotype Controls (Clone ID)</td>
			<td>Manufacturer</td>
			<td>Catalogue No.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5)</td>
			<td style="width:121px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-214</td>
			<td style="width:555px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5)</td>
			<td style="width:121px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-092-212</td>
			<td style="width:555px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Mouse IgG1 Isotype (IS5-21F5)</td>
			<td style="width:121px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Mouse IgG2a (S43.10)</td>
			<td style="width:121px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-091-837</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Mouse IgG2a (S43.10)</td>
			<td style="width:121px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-098-849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">MACS Buffer</td>
			<td style="width:121px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Osteogenic differentation</td>
			<td>Manufacturer</td>
			<td>Catalogue No.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">DMEM-HG</td>
			<td style="width:121px;">Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11965118</td>
			<td>Long name: Dulbecco&#8217;s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">FBS</td>
			<td style="width:121px;">Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Long name: Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Anti- anti-</td>
			<td style="width:121px;">Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td>Long name: antibiotic-antimycotic solution x100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">&#946;-Glycerol Phophate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">50020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">L-ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Alizarin Red S</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5533-25G</td>
			<td>For calcium matrix staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Adipogenic differentation</td>
			<td>Manufacturer</td>
			<td>Catalogue No.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">DMEM-HG</td>
			<td style="width:121px;">Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11965118</td>
			<td>Long name: Dulbecco&#8217;s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4.5 g/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">FBS</td>
			<td style="width:121px;">Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Long name: Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Anti- anti-</td>
			<td style="width:121px;">Gibco/Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15240-062</td>
			<td>Long name: antibiotic-antimycotic solution x100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">insulin</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Dexamethasone</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Indomethacin</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I7378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">3-isobutyl-1-methyl xanthine</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">Oil Red O solution</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">O1391-250ML</td>
			<td>For lipid vacuole staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">XY FISH kit to determine fetal or maternal origin of cells</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">XY chomosome FISH kit</td>
			<td style="width:121px;">Vysis (Abbott Molecular)</td>
			<td style="width:119px;">07J20-050</td>
			<td>Long name: CEP X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Direct Labeled Fluorescent DNA Probe Kit</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and expansion of mesenchymal stem/stromal cells derived from human placenta tissue

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose dependent. Human term placenta is rich in MSC and is a physically large tissue that is generally discarded following birth. Placenta is an ideal starting material for the large-scale manufacture of multiple cell doses of allogeneic MSC. The placenta is a fetomaternal organ from which either fetal or maternal tissue can be isolated. This article describes the placental anatomy and procedure to dissect apart the decidua (maternal), chorionic villi (fetal), and chorionic plate (fetal) tissue. The protocol then outlines how to isolate MSC from each dissected tissue region, and provides representative analysis of expanded MSC derived from the respective tissue types. These methods are intended for pre-clinical MSC isolation, but have also been adapted for clinical manufacture of placental MSC for human therapeutic use.

태반 MSC 분리 절차는 MSC가 고립되었던 태반 해부학의 세 가지 영역이 다음은 산모의 탈락뿐만 아니라 융모 판과 융모막 융모의 대부분 태아 조직입니다 그림 2에 강조 표시됩니다 그림 1에 요약되어있다. 많은 교과서, 기사 및 온라인 리소스 세부 개발 및 다양한 태반 조직의 기능적 역할은 (참조 8 참조). 48 시간 분리 및 조직 파편의 제거 후 배양 형태. 적혈구 및 대부분의 다른 세포 파편이 첨부되지 않습니다 동안 문화의 48 시간 후, 중간 엽 줄기 세포는 조직 배양 플라스틱에 부착 된 것입니다. 이때, 배지는 신선한 배지 35 ㎖로 교체되어야한다. 이 배지 교환하기에 앞서 때문에 정확한 관찰을하기 어렵다시각적 평가를 방해 할 적혈구 많은 수의. 배양 상등액의 모양은 태반 기증자 사이에 실질적으로 다를 수 있습니다. 본 변형 예 1 및 2 (도 3a)에 시각적으로 볼 수있다. 매우 다르게 나타나 두 MSC 아이솔레이션은 두 가지 태반에서 동시에 수행 하였다. 그러나, 한번 세정 모두 배양 (세정 실시 예 3,도 3a 참조)와 유사한 나타났다. 현미경 하에서 48 시간 배지 교환 후, 몇 셀 플라스크 (도 3b)에 연결되며, 상기 세포를 더욱 광범위하게 전개 엽 줄기 세포에서 유의 한 차이가 나타날 것이다. 일부 파편과 적혈구 부동 또는 부착 덩어리로 볼 수 이러한는 중간 엽 줄기 세포의 성장을 방해하지 않습니다. 플라스크의 바닥에 부착 된 긴 섬유 아세포 세포가 MSC, 조혈 세포를 포함한 혼​​합 될 가능성융모 또는 내피 세포. 또, 비 MSC 세포는 이들 세포는 일반적으로 MSC 배양 조건에서보다 1-2 통로 살아남 같이, MSC 배양을 손상하지 않는다. 배양 초기 모양의 일부 변동에도 불구하고, 후속 팽창 결과는 일반적으로 일치한다. 시간이 지남에 MSC 문화의 형태. 비 MSC 세포는 원형으로 볼 수있다 또는 느슨하게 연결된 세포 (그림 4A)가. 첨부 된 세포가 원래 형성 &quot;식민지 장치라고 있었는지되지만이 대표적인 예에서, 분리 다음 칠일은 작은 섬유 모세포 MSC 식민지는 볼 수 있었다 나중에 -fibroblast &quot;(CFU-F) (17)와 MSC (18)라고합니다. 열세 일 격리 다음, 섬유 모세포 MSC 식민지가 큰 (그림 4B)이었다. 일반적으로, 단일 층이 시점에서 80-90% 합류되며 세포 파샤되어야<html> 검정 고시. 통로 (2) 이후부터, 태반 MSC 단일 층이 합류 (그림 4C)의 특성 소용돌이 모양의 형태를 개발합니다. 세포를 낮은 밀도로 계대 않는 한, CFU-F 형성은 더 이상 관찰되지 않을 것이다. 낮은 밀도에서, 태반 유래 MSC는 성인 골수 유래 MSC 1보다 작은, 사각형 모양을 가지고있다. 태반 유래 MSC와 골수 유래 MSC 유사한 증식 속도를 나타내는 반면, 태반 - 유래 세포는 급속 노화 5 이하 쉽다. 체외에서 태반 MSC의 특성. 각 확장 세포 집단은 (1) 플라스틱 접착 (2) 중간 엽 표면 마커의 존재 및 조혈 표면 마커의 부재 및 중배엽를 받아야하기 (3)의 용량을 포함하여 표준 MSC 기준 (16)에 부합하도록있어서해야 분화. &quot;fo를 : 유지-together.within 페이지 =&quot;1 &quot;&gt; 태반 중간 엽 줄기 세포는 플라스틱 접착 있습니다. 도 4에 도시 된 바와 같이, 중간 엽 줄기 세포의 배양은 접착 수지이며 섬유 아세포와 같은 형태를 가지고; 이 세포가 MSC (16)를 정의하는 첫 번째 기준을 충족하는지 확인합니다. 태반 MSC 디스플레이 중간 엽 표면 마커. 두 번째 정의 MSC 특성 간엽 표면 마커의 존재 및 조혈 표면 마커 (16)의 부재이다. 결정적은 MSC를 식별 할 수있는 단일 마커가 없기 때문에, 마커의 패널은 일반적 아니라 조혈 간엽있는 셀을 식별하기 위해 유세포 분석과 관련하여 이용된다. 여기에 제공된 대표 데이터 세트에서 (그림 5A), 우리는 중간 엽 마커 CD73, CD105, CD90, CD146, 및 CD44, 조혈 마커 CD45 및 CD34 및 HLA-DR, 아 등의 세포 발현을 평가내피 마커 CD31와 같은 리터. 이 태반 MSC 특성화 과정에 사용되는 항체의 모든 재료 / 장비의 표에 나열되어 있습니다. (가) 여기에 19 설명 분석 방법으로, 지침을 제조 따라 염색을 실시 하였다. 5,20 예상대로 세포, 중간 엽 마커 CD73, CD105, CD44, 및 세포 표면 마커 CD45, CD34, HLA-DR 및 CD31 양성 부정적이었다. 약 37 %와 우리의 대표 데이터 세트에서 세포의 57 %는 각각 CD90와 CD146 (21)에 대한 긍정적이었다. CD90 및 CD146 모두 일반적으로 MSC (21)는 마커 이용된다. MSC 세포 표면 마커 정보는 MSC 조직 소스, 중간 조성물 또는 통로 번호 (22)에 따라 다를 수있다. 경험 다년간에서는 1-2 P하기 비 중간 엽 세포, 태반 - 유래 MSC 장기 오염이 관찰되지 않은assages 5,11. 태반 MSC 디스플레이 중간 엽 분화 가능성 정의에 의하면, MSC는 체외 중배엽 분화 능력 5,13을 가지고 있어야합니다. 중배엽 분화 잠재력은 일반적으로 트리 또는 이중 혈통 차별화 분석 중 하나를 통해 평가된다. 트라이 혈통 분석이 추가로 연골 분화 능력을 평가하는 동안 바이 계보 분석은 일반적으로 골 형성 및 지방 세포 분화 능력을 평가합니다. 여기에 제시된 대표적인 결과에서, 우리는 확장 된 MSC 인구가 두 골 형성 분화를 나타내는 칼슘 예금 및 지질 공포, 지방 조직을 나타내는 (그림 5B)를 형성 것을 보여준다. 여기에보고 된 MSC 집단을 특성화하기 위해 유도 배지 1 ㎖를 6 × 104 세포로 24 웰 배양으로 세포를 시딩. 중간 콤포넌트넌트는 재료 / 장비의 표에 나열되어 있습니다. 유도 매체 제제는 문헌에서 공통적 인 반면, 출판 제제에 상당한 변화가있다. 이러한 이유로 우리는 간단히 여기에 우리의 유도 매체 제제와 염색 방법을 나열합니다. 골 형성 유도 배지는 DMEM-HG 10 % FBS, 1X 항생제 항진균제 용액 된 10 mM β-글리세롤 한 인산, 100 나노 덱사메타손, 50 μM L- 아스 코르 빈산 -2- 인산을 함유 하였다. 지방 세포 유도 배지는 DMEM-HG 10 % FBS, 1X 항생제 항진균제 용액 10 μg의 / ㎖ 인슐린, 덱사메타손 100 나노 미터, 200 μM 인도 메타 신 (indomethacin), 500 μM 3- 이소 부틸 -1- 메틸 크 산틴을 함유 하였다. 여기서 문화는 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 유지되고 14 일 동안 배양 하였다. 유도 매체는 배양 기간 동안 두 번 일주일 교환했다. 유도 14 일 후, 문화는 우리의 이전에 따라 뼈 같은 매트릭스 (골 형성) 또는 지질 액포 (지방 조직) 중 하나를 위해 특성화되었다빚을내는 게시 5. 조골 칼슘 매트릭스 증착 분석 먼저, 배지를 흡인을 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데하이드 문화를 정착, DPBS로 단층을 세척 한 다음 지시를 제조에있어서, 알리자린 레드 S 염색에 의해 달성 하였다. 지방 세포 유도는이 지침을 제조에 따른 오일 레드 O 솔루션, 매체를 흡입 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드와 문화를 고정, 단일 층을 세척하고, 염색으로 평가 하였다. 스테인드 칼슘 예금과 석유 공포 후 광학 현미경으로 시각화 및 이미지는 나중에 참조 할 수 있도록 저장되었습니다. 이전의 출판물에서, 우리는 더 광범위 4,5 태반 유래 MSC의 분화 잠재력을 특징으로하고있다. 지방 조직은 태반 유래 MSC 5 일반적으로 덜 효율적인 동안 태반 유래 MSC의 골 형성은 &lt;, 골수 유래 MSC와 유사하다/ SUP&gt;. 이 이전에 태반-MSC (5) 우리가보고되어 있지만 우리는 정기적으로, 여러 가지 이유로 연골 분화를 수행하지 않습니다. 중배엽 분화 능력은 MSC의 특성을 정의하면서 먼저, 상기 치료 효과가 분비 분비물 MSC (26)로부터 유래 될 가능성이 특히 여기서, 이차적 23-25 ​​쉽다. Dominici는 등. 인간의 성인 골수 유래 MSC 16의 임상 적 생산을위한 최소한의 기준을 제시하지만, 다른 틈새 시장이 서로 다른 고유의 특성과 분화 능력 5,13,27-32가에서 두 번째로, 최근 연구는 MSC를 나타냅니다. 실제로는 Parolini 외. 태반 유래 MSC &quot;은 하나 이상의 중배엽&quot;계통이 아닌 세 개의 계통 ​​(10)으로 분화하도록 제안 하였다. 이는 유사한 통해 발생 마지막으로, 다수의 MSC 연구는 연골 분화를 제외골 형성 등의 세포 내 신호 전달 경로 (TGFβ 가족 경로) 33-35. 태반 MSC는 출발 물질의 해부학 적 위치에도 불구하고,이 배양 방법을 이용하여 모체 기원이다. 대부분의 출판물은 세포 배양 14시 태아의 융모막 수율 태아 MSC에서 분리 된 것으로 가정합니다. 우리가 이전에 5보고 그러나, 모든 문화는 빠르게 직관적으로 산모의 탈락 MSC 문화에 대해 예상되는 바와 같이 산모의 MSC에 대한 풍부한 될이 프로토콜을 사용하여 태아의 융모막에서 유래. 쉽게 확장 된 세포 집단에서 태아와 모체 세포 기여를 묘사 할 수 있었다 있도록 이러한 대표적인 결과에서 우리는 남자 아기의 태반 조직을 사용했다. 이러한 연구를 위해 우리는 자재 / 장비의 표에 나와있는 XY 생선 키트를 사용하고, 제조 업체의 지침을 따랐다. (그림 6) . 통로 (2)에 의해, 모체 조직으로부터 유래 된 세포 집단은 (XX) ~ 100 % 모체 세포이었고, 태아 세포 (XY)이 탐지되었다. 이것은 모성 조직의 물리적 해부 후속 문화의 모체 세포의 농축되었다 제안합니다. 그러나, 태아 융모 융모막 판 유래 배양에서 배양 결과를 고려하는 것이 중요하다. 통로 0에서 태아의 융모막 융모 융모막 두 판 파생 된 문화 타겟 절개 태아 세포 (그림 6)에 대한 풍부한 것을 나타내는 ~ 85 % XY, 또는 태아 기원했다. 통로 0에서 두 문화 ~ 15 % 모체 세포 (XX) 오염 물질이 포함되어 있습니다. 놀랍게도, 통로 (2)에서 모두 태아 배양 ~ 100 % 모체 세포 (XX), 태아 세포 (XY)로 채워했다더 이상 검출되지 않았다. XY의 FISH 분석은 모체 세포 (XX 염색체가) 신속하고 지속적으로 인수 문화 태아의 융모 조직에서 파생 된 것을 알 수있다. 이것은 종종 5를 간과되는 중요한 문화의 관측이다. 이 DMEM는 태아 유래 인구를 지원하도록 설계 추가 요소없이 사용이 10 % FBS와 보충 할 때 모체 세포가 빠르게 모든 문화를 채우는 매우 중요한 관찰을 보여줍니다 때문에이 분석의 세부 사항은이 프로토콜에 포함되어 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54204/54204fig1.jpg" /> 그림 1 :. 태반 MSC 분리 절차의 개요 (1 단계) 태반 해부학와 함께 자신의 방향을. (2 단계) 수동으로 탈락, 융모막 융모 또는 가위를 사용하여 융모 판 중 하나에서 조직의 10g을 해부하다. (단계 3) t 말하다그는 가위 나 메스와 미세 조각으로 탈락, 융모막 융모 또는 융모 판 조직의 일부를 해부. (4 단계) 디스 파제와 콜라게나 I.에서 1 ~ 2 시간의 소화를 통해 미세 조각에서 세포를 해방 (단계 5) 펄스를 원심 분리 및 / 또는 셀 스트레이너를 통해 세척하여 섬유 조직으로부터 세포를 분리. 수집 및 배지에서 세포를 재현 탁하고 배양 플라스크에 넣고. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54204/54204fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 중간 엽 기질 세포 (MSC)는 플라스틱 준수 및 생존과 배양 배지에서 증식 능력에 대한 자신의 성향에 따라 선택됩니다. 마지막으로, 결과 섹션에서 팽창 MSC 특성화 될 수 있고, 미래의 실험에 사용하기 위해 저장된다. 그림 2 :.이 절차에 고립 된 인간의 용어 태반 조직의 해부학 수확하는 첫 번째 조직은 산모의 탈락이다. 탈락 그것이 (탈락 녹색 마커에 의해 식별된다) 자궁벽에서 흘린 후 태반의 표면에 얇은 층으로 남아있는 조직이다. 태반의 내부에서 수확됩니다 두 번째 조직은 태아의 융모막 융모 (파란색 마커)입니다. 수확하는 세 번째 조직 (참조 36에서 적응) 태아의 융모 판 (빨간색 마커)입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54204/54204fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54204/54204fig3.jpg" /> 그림 3 : 48 시간 격리 다시 후 문화의 형태학조직 파편을 이동. (A) 배양 상등액의 모양 부스러기를 세척하기 전에 태반 기증자 사이에 실질적으로 변할 수있다. 예 배양 물 1 및 2는이 변화를 보여준다. 이 두 아이솔레이션을 동시에 수행하지만, 두 개의 서로 다른 태반에서 있었다. 후속 팽창 결과는 일반적으로 일치하는 실시 예 3에 나타낸 바와 같이 한번 세정 배양 적혈구 및 조직 파편이 명백 할 것이다. 48 시간의 미디어 교환하기 (B)는 단지 몇 세포가 플라스크에 부착 될 것이다. 스케일 바 = 200 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54204/54204fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54204/54204fig4.jpg" /> 그림 4 :. 시간이 지남에 MSC 문화의 형태학 (A) 분리 후 7 일, 작은 F비 MSC 세포는 원형 또는 느슨하게 연결된 세포와 같은 존재한다하더라도 ibroblastic MSC 식민지 볼 수 있습니다. (B) 분리 후 십삼일, 섬유 모세포 MSC 식민지가 크고 자주 MSC의 단층이 합류 및 통로 준비입니다. 통로 (2) 이후부터 (C)는 MSC의 단층이 합류 특성 소용돌이 모양의 형태를 개발합니다. 스케일 바 = 200 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54204/54204fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54204/54204fig5.jpg" /> 그림 5 :. 유동 세포 계측법 및 중배엽 분화에 의해 MSC의 특성 (가) 태반의 융모막 융모 유래 MSC는 유동 세포 계측법 분석에 의해 고전 MSC 마커 프로파일을 표시이 세포 표면 마커, EXPRES 있지만,시온은 인간 MSC의 모든 종류의 유사합니다. 각 히스토그램은 y 축 (최대의 %)에 상기 정규화 된 셀 계수 대 신호 강도 (X 축)을 나타낸다. 설정이 대표 데이터에서 세포는 조혈 마커 CD45 및 CD34 및 HLA-DR에 대한 CD73, CD105과 CD44 양성 및 음성이었다. (B) 태반 MSC는 일반적으로 단 (C)이 지방 세포 분화가 골수 유래 MSC보다 덜 효율적일 수 있으며, 강력한 골 형성 분화를 겪는다. 자막 B와 C의 이미지가 40 배 배율로 촬영되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54204/54204fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/54204/54204fig6.jpg" /> 그림 6 : 태반 MSC는 출발 물질의 해부학 적 위치에도 불구하고, 문화의이 방법을 사용하여 원점에서 산모 있습니다.플롯은 태아 (남성 XY)와 어머니의 모든 제 2 통로에서 탈락, 융모막 융모와 융모 판 조직에서 분리 태반 MSC 문화의 (여성 XX) 세포 성분의 정량을 보여줍니다. 산모 세포 (XX)는 신속하고 재현성 태아의 융모 조직에서 파생 된 문화를 정복. 태아 = 남성 = 개별 세포에서 발견 XY 염색체, 개별 셀에서 검출 된 산모 = 여성 = XX 염색체. 여기에 제시된 데이터는 XY의 물고기를 염색하고 각 데이터 포인트 계산 100 셀의 최소, 남자 아기에서 N = 3 독립적 인 기증자 태반에서였다. 바는 평균을 나타내며, 오차 막대가 하나의 표준 편차를 반영한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54204/54204fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

여기에서 우리는 고립과이 조직에서 중간 엽 줄기 / 간질 세포 (MSC)의 확장 다음에 인간의 장기 태반에서 태아와 모체 조직의 절개 방법을 설명합니다.

인간 태반 조직에서 추출 분리 및 중간 엽 줄기의 확장 / 기질 세포

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

36.1K 조회수.  The University of Queensland.  여기에서 우리는 고립과이 조직에서 중간 엽 줄기 / 간질 세포 (MSC)의 확장 다음에 인간의 장기 태반에서 태아와 모체 조직의 절개 방법을 설명합니다. 

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Isolation of Human Mesenchymal Stem Cells and their Cultivation on the Porous Bone Matrix

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold. Thus, the application of MSCs in repair and tissue regeneration processes depends principally on the efficient implementation of the techniques for placing these cells in a host tissue. For this reason, the design of biomaterials and cellular scaffolds has gained importance in recent years because the topographical characteristics of the selected scaffold must ensure adhesion, proliferation and differentiation into the desired cell lineage in the microenvironment of the injured tissue. This option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) employs bovine bone matrix as a cellular scaffold and is an efficient culture technique because the cells respond to the topographic characteristics of the bovine bone matrix Nukbone (NKB), i.e., spreading on the surface, macroporous covering and colonizing the depth of the biomaterial, after the cell isolation process. We present the procedure for isolating and culturing MSCs on a bovine matrix.

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific biomaterials. This work presents a novel option for the delivery of MSCs from human amniotic membrane (AM-hMSCs) that employs the bovine bone matrix Nukbone (NKB) as a scaffold.

인간 중간 엽 줄기 세포의 분리 및 다공성 뼈 매트릭스에 자신의 재배

Mesenchymal stem cells (MSCs) have a differentiation potential towards osteoblastic lineage when they are stimulated with soluble factors or specific ...

연구

발생학

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

분리 및 인간의 농축 향상된 골 연장술에 대한 기질 세포를 지방이 유래

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34- pericytes and vascular CD34+CD146- adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Human cardiac tissue harbours multipotent perivascular precursor cell populations that may be suitable for myocardial regeneration. The technique described here allows for the simultaneous isolation and purification of two multipotent stromal cell populations associated with native blood vessels, i.e. CD146+CD34- pericytes and CD34+CD146- adventitial cells, from the human myocardium.

인간의 심장 조직에서 혈관 주위 능성 전구체 세포 집단의 분리

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

인간 제대혈 및 태아 태반에서 중간 엽 기질 세포의 분리 및 특성

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

분리와 인간 성인 그리고 태아 심장 표본에서 파생 하는 기본 Epicardial 세포의 문화

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms of retinitis pigmentosa (RP) and age-related macular degeneration (AMD). Cell therapy is one of the most promising therapeutic strategies proposed to cure these diseases, with already encouraging preliminary results in humans. However, the method of preparation of the graft has a significant impact on its functional outcomes in vivo. Indeed, RPE cells grafted as a cell suspension are less functional than the same cells transplanted as a retinal tissue. Herein, we describe a simple and reproducible method to engineer RPE tissue and its preparation for an in vivo implantation. RPE cells derived from human pluripotent stem cells are seeded on a biological support, the human amniotic membrane (hAM). Compared to artificial scaffolds, this support has the advantage of having a basement membrane that is close to the Bruch&#39;s membrane where endogenous RPE cells are attached. However, its manipulation is not easy, and we developed several strategies for its proper culturing and preparation for grafting in vivo.

We describe a method to engineer a retinal tissue composed of retinal pigment epithelial cells derived from human pluripotent stem cells cultured on top of human amniotic membranes and its preparation for grafting in animal models.

인간 배아 줄기 세포에서 파생 된 이식 적합 한 망막 색소 상피 조직 공학

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally isolated and characterized from bone marrow (BM), then acquired from tissues including adipose tissue, synovium, skin, dental pulp, and fetal appendages such as placenta, umbilical cord blood (UCB), and umbilical cord (UC). MSCs are a heterogeneous cell population with the capacity for (1) adherence to plastic in standard culture conditions, (2) surface marker expression of CD73+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19-/HLA-DR- phenotypes, and (3) trilineage differentiation into adipocytes, osteocytes, and chondrocytes, as currently defined by the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Although BM is the most widely used source of MSCs, the invasive nature of BM aspiration ethically limits its accessibility. Proliferation and differentiation capacity of MSCs obtained from BM generally decline with the age of the donor. In contrast, fetal MSCs obtained from UC have advantages such as vigorous proliferation and differentiation capacity. There is no ethical concern for UC sampling, as it is typically regarded as medical waste. Human UC starts to develop with continuing growth of the amniotic cavity at 4-8 weeks of gestation and keeps growing until reaching 50-60 cm in length, and it can be isolated during the whole newborn delivery period. To gain insight into the pathophysiology of intractable diseases, we have used UC-derived MSCs (UC-MSCs) from infants delivered at various gestational ages. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-MSCs from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

Human umbilical cord (UC) can be obtained during the perinatal period as a result of preterm, term, and postterm delivery. In this protocol, we describe the isolation and characterization of UC-derived mesenchymal stem cells (UC-MSCs) from fetuses/infants at 19-40 weeks of gestation.

절연 및 인간의 탯 유래 중간 엽 줄기 세포 Preterm와 기간 유아에서의 특성화

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Isolation, Culture, and Adipogenic Induction of Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of cardiovascular disease. ADSCs derived from different adipose tissues show distinct features, and those from the PVAT have not been well characterized. In a recent study, we reported that some ADSCs in the periaortic arch adipose tissue (PAAT) descend from the neural crest cells (NCCs), a transient population of migratory cells originating from the ectoderm.
In this paper, we describe a protocol for isolating red fluorescent protein (RFP)-labeled NCCs from the PAAT of Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+ mice and inducing their adipogenic differentiation in vitro. Briefly, the stromal vascular fraction (SVF) is enzymatically dissociated from the PAAT, and the RFP+ neural crest derived ADSCs (NCADSCs) are isolated by fluorescence activated cell sorting (FACS). The NCADSCs differentiate into both brown and white adipocytes, can be cryopreserved, and retain their adipogenic potential for ~3&#8211;5 passages. Our protocol can generate abundant ADSCs from the PVAT for modeling PVAT adipogenesis or lipogenesis in vitro. Thus, these NCADSCs can provide a valuable system for studying the molecular switches involved in PVAT differentiation.

We present a protocol for the isolation, culture, and adipogenic induction of neural crest derived adipose-derived stem cells (NCADSCs) from the periaortic adipose tissue of Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+ mice. The NCADSCs can be an easily accessible source of ADSCs for modeling adipogenesis or lipogenesis in vitro.

신경 문장 원래 지방 유래 줄기 세포의 격리, 문화 및 지방 유도는 periaortic 지방 조직에서

An excessive amount of adipose tissue surrounding the blood vessels (perivascular adipose tissue, also known as PVAT) is associated with a high risk of ...