AV는 EMBO 장기 박사 친교에 의해 지원되었다. 마틴 실험실에서 연구 ERC 시작 부여 (GeometryCellCycle)과 SGM에 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 (31003A_155944)에 의해 투자된다.

분열 효모 유성 생식의 현미경 분석 1. 미디어 준비 <ol><li> 포도당 : 10g의 /의 L, KH 2 PO 4 : 1g / L, 염화나트륨 : 다음과 같은 구성 요소가 혼합하여 최소 포자 형성 배지 (MSL-N) (15)을 준비 0.1 g / L, 황산 ·을 7H 2 O : 0.2 g / 엘. 추가 추적 요소 (10000) : 100 μL / L, 비타민 (1000 배) : 1 ㎖ / L, 0.1 M CaCl2를 &#160; ㎖ / L. 실온 (RT)에서 0.22 ㎛의 공극 크기의 필터를 사용하여 저장소 필터 살균. <ol><li> 다음과 같은 비타민을 사용 (1000 배) 재고 : 판토텐산 : 1 그램 /의 L, 니코틴산 : 10g / L, 이노시톨 : 10g / L, 비오틴 : 10 ㎎ / ℓ. 4 ℃에서 0.22 ㎛의 공극 크기의 필터를 사용하여 저장소 필터 살균. </li><li> 붕소 산 : : 5g / L, MnSO 4 : 4 그램 /의 L, ZnSO 4 · 7H 2 O : 4g / L, 50ml을 2 · 6H 2 O : 2g / L 다음과 같은 미량 원소 (10000) 주식을 사용하여 ,을 MoO 3 : 0.4 그램 /의 L, KI : 1g / L, CuSO 4· 5H 2 O : 0.4 g / L, 구연산 : 10g / L. 4 ℃에서 0.22 ㎛의 공극 크기의 필터를 사용하여 저장소 필터 살균. </li></ol></li><li> 아가 로스를 0.2 g과 MSL-N 10ml를 조합하여 MSL-N 아가에게 (아가 패드 챔버를 만들기 위해 사용) 2 %를 준비한다. 마이크로 원심 튜브에 아가로 용해하고 0.5 ml의 분취 량까지 전자 레인지 고전력 ~ 2 분 동안 용융. 실온에서 보관하십시오. </li><li> 1g / L, 류신 : 0.225 g / L, 아데닌 : 0.225 그램 /의 L, 우라실 (NH 4) 2 SO 4 추가하여 질소 MSL-N에서 (MSL + N)와 최소 포자 형성 매체를 준비 0.225 g / L를 . 0.22 ㎛의 공극 크기의 필터를 이용하여 필터 멸균. 실온에서 보관하십시오. 주 : 류​​신, 아데닌 및 우라실이 영양 요 구성 균주의 성장을 허용하기 위해 배지에 첨가된다. 사용 된 균주 (예를 his3Δ에 대한) 별개의 영양 요구를 전달하는 경우 추가 아미노산 보충이 포함되어야한다. 또한 완전히 prototroph 균주와 그 일을 양해 해 주시기 바랍니다 만 같이 추천이러한 균주는 높은 결합 효율을 수 있습니다. </li><li> 챔버 밀봉 200 ml의 VALAP을 준비합니다. 비커에 라놀린, 바셀린 (또는 다른 석유 젤리), 및 파라핀의 동일한 가중치를 추가합니다. 철저하게 혼합 될 때까지 열이 낮은 온도에서 혼합물 가끔 저어. 여러 개의 작은 배양 접시에 믹스를 나누어지는. 실온에서 보관하십시오. </li></ol> 짝짓기 실험 2. 배양 분열 효모 균주 (그림 1). <ol><li> 1 일, 저녁 : MSL + N 3 ㎖를 포함하는 배양 튜브에 고체 배지에서 갓 줄무늬 균주를 접종한다. 약 2.5 cm 직경의 평면 바닥 튜브를 사용합니다. 적응 문화 볼륨과 다른 문화 튜브 또는 플라스크를 사용합니다. 밤새 품어 (O / N) 25 ° C, 200 rpm으로 진탕. heterothallic 균주로 작업하는 경우, 별도로 접종. <ol><li> 문화가 광학 밀도가 저녁에 0.4-0.8의 600 nm의 (OD 600)에서 측정이 있는지 확인하기 위해 다음 아침에 미디어 세포 현탁액을 희석. 노트 :OD는 분열 효모 세포 농도의 프록시 (600)의 측정은 약 0.1 ~ 1.0의 범위에서 선형이다. 우리의 분광 광도계 OD 600 = 0.1 ml의 당 1.4 × 10 6 세포에 해당합니다. 초기 OD (600)는 읽는 경우 따라서, 샘플 신뢰할 수있는 측정을위한 농축 / 희석 할 필요가이 범위를 벗어납니다. </li></ol></li><li> 2 일, 저녁 : 100 ㎖ 플라스크에서 600 = 0.025 중독하는 MSL + N 배지 20ml에 세포를 희석. 30 ° C, 200 rpm에서 균주 O / N을 품어. 참고 : 야생 형 세포 배양은 OD 600 ~ 0.8 다음 아침 (15 시간 이상)에 도달한다. 이상 발생 시간 균주로 작업하는 경우 그에 따라 희석을 조정합니다. </li><li> 3 일, 아침 : 문화가 OD 600 ~ 0.8의 세포 밀도가 있는지 확인하기 위해 OD 600을 측정합니다. heterothallic 균주로 작업하는 경우, 파트너 세포의 동일한 숫자를 혼합한다. 1.5 ml의 1,000 XG 및 전송에서 펠렛 세포튜브. MSL-N 매체의 1 ml의 세포를 세 번 씻는다. MSL-N 배지 3 ㎖에 세포를 다시 일시 중단 = 1.5 600 중독에 셀을 희석. <ol><li> 직접 영상에 대한 세포를 장착 자매 세포 사이의 결합을 모니터링하려면 (프로토콜 2.4 절 참조). 결합 형 스위칭 질소 박탈 이후에 발생하는 유사 분열 분열 동안 열린다있는 homothallic H90 균주를 사용합니다. 아가로 오스 패드 세포의 직접 장착은 세포 분열 후, 자매 세포가 서로 옆에 남아 것을 보장한다. </li><li> 셀 편광 (탐색 역학과 shmooing)를 모니터링 30 ° C, 영상에 대한 사전 설치 세포에 3 ~ 4 시간 동안 200 rpm으로 세포 배양의 1-3 ml에 품어합니다. 이 3 ~ 4 시간 내 마지막 유사 분열 부문 발생한 것입니다. 몇 세포는 편광을 시작했다하지만 그들의 탐색 편광 역학 시작됩니다 대부분. </li><li> 세포 - 세포 융합 30 ° C에서 세포 배양의 1-3 ml에 품어 모니터링하려면, 200 rpm으로 4 ~ 6 시​​간의 PRI에 대한나에 이미징 세포를 장착. </li><li> 모니터링하려면 포스트 융합 이벤트는 30 ° C에서 세포 배양의 1-3 ml의 이전 영상에 대한 세포를 장착 8 시간 동안 200 rpm으로 품어. </li><li> (만 heterothallic 균주에 대한) 특정 페로몬 농도에 반응을 모니터링하기 위해 30 ° C에서 세포 배양 3 ㎖를 품어, 200 rpm으로 3 ~ 4 시간 동안 이미징 세포를 장착하기 전에. <ol><li> 95 ° C 열 블록의 MSL-N 함유 microcentrifuge 관을 제거 (프로토콜 섹션 2.4.1을 참조하십시오. 아래). 용융 MSL-N 아가로 오스에서 직접 원하는 농도로 P-인자 또는 M-요소를 추가합니다. 즉시 패드를 준비하기 전에 텍싱에 의해 잘 섞는다. </li><li> 셀을 장착 한 후, 이전 영상 25 ° C에서 15 ~ 30 분 동안 패드를 품어. P-M-인자 및 인자 페로몬 메탄올 1 ㎎ / ㎖의 스톡 용액으로부터 사용 하였다. 참고 : 돌연변이와 함께 작업하는 배양 시간이 다를 수 균주합니다. 세포의 응집 액체 m에서 장기간 배양 후 발생할 수있는edia 일부 돌연변이 균주에 특히 강한 될 수있다. 응집되어 세포 단층을 아가 로스에서 패드 상에 발견함으로써 자동 초점 화상하기 어려운 수 없다. 광범위한 세포 응집되는 경우에는 즉시 세척 후 아가로 오스 패드에 세포를 장착하고 다시 정지를 질소 부족 미디어 (프로토콜 2.3.1 절에서와 같이.) 전에 영상 30 ° C에서 그들을 품어. </li></ol></li></ol></li><li> 이미징을위한 세포 장착 : <ol><li> 10 ~ 15 분 동안 95 ° C 열 블록으로 나누어지는 용융 및 스페이서 (그림 1B)에 의해 분리 된 두 개의 유리 슬라이드 사이에 200 μl를 추가하여 MSL-N에게 아가로 오스 패드 (16)를 준비합니다. ~ 0.5 mm의 두께를 갖는 스페이서를 사용한다. 스페이서하려면 사용 스트립은 제한 효소로 전달 된 것과 같은, 판지에서 잘라. </li><li> 1 분 동안 1,000 XG에서 세포를 100 μl를 펠렛 뜨는을 제거하고 잔류 2-4 μl의 배지에서 세포를 다시 일시 중지합니다. 그것이 지연으로하지 마십시오 신선한 매체에 다시 일시 중지교배. </li><li> 2 ~ 3 분 후에 조심스럽게 스페이서 상단 유리 슬라이드를 제거합니다. 몇몇 균주가 장착되는 경우, 세포가 아가 로스 패드를 제조하기 전에 농축 물을 준비. </li><li> 패드 세포의 1 μl를 추가하고 드롭 커버 슬립으로 덮고 VALAP로 밀봉하기 전에 (~ 1 분) 건조 시작할 때까지 기다립니다. </li><li> 패드는 25 ° C 또는 RT에서 촬영하기 전에 적어도 30 분 동안 앉아 보자. </li><li> 짝짓기의 다양한 단계에서 세포의 혼합물을 얻으려면, MSL-N (2.3 절을 참조하십시오.)에서 세척 후 즉시 패드를하고 18 ° CO / N (~ 15 시간)에 품어. 이 방법은 약한 신호 높은 시간 해상도가 필요하거나 샘플과 별개의 결합 단계에서 세포를 영상화하는 데 유용합니다. </li></ol></li></ol> 상대 효모 세포의 3. 라이브 셀 이미징 <ol><li> 이미지 인식 설정을 조정합니다. 참고 : 여기에 제시된 이미지 획득 설정은 사용자 정의 올림푸스 IX-71으로 구성된 DeltaVision 플랫폼에 최적화 된계획 아포 60X / 1.42 NA 또는 U-계획 아포 100X / 1.4 NA 목표, CoolSNAP HQ2 카메라와 인사이트 SSI ​​7 색 조합 단위 조명과 거꾸로 현미경. 하드웨어는 디지털 자동 초점을 가능하게 softWoRx의 v4.1.2에 의해 제어된다. <ol><li> 장시간에 걸쳐 Z 드리프트 소프트웨어 자동 초점 시스템의 용량을 넘어 설 수 있기 때문에 오토 포커싱 간격이 15 분을 초과하지 않도록. 하드웨어 기반의 자동 초점 시스템을 이용하면, 큰 간격을 사용한다. </li><li> 촬영 간격을 조정합니다. 형광 처음으로 단백질을 태그로 작업 할 때 시작점으로 15 시간 ~에 대한 이미지마다 10 분 가져 가라. 이 간격은 광범위한 표백 않고 전체 정합 프로세스의 양호한 개요를 제공한다. <ol><li> 이러한 융합으로 더 정확하게 시간 이벤트 5 분 간격으로 이하와 이​​미지. 짧은 간격으로 낮은 노출 시간과 약간의 표백을 가능하게 강한 형광을 필​​요로한다. 1 분 피하기 O / N 현미경 아래 간격 이미징프로토콜 섹션 2.4.6에 설명 된대로 대신 모두 결합 단계의 혼합물을 준비합니다. </li></ol></li><li> 이미지 노출 시간을 조정합니다. 50 ~ 300 밀리 초 사이의 시험 노출 시간. (일반적으로 100) 뚜렷한 신호와 시간 - 다수의 지점을 달성하도록 신호 대 잡음비 및 광표백 간의 균형을 목표로한다. </li><li> Z-절편을 조정합니다. 섹션마다 0.3 ㎛의 피복이 5㎛ 좋은 촬상 깊이를 제공한다. (- 전체 표본 깊이의 단일 스위프 취득 광축 통합) OAI을 사용하여 최소화 할 수있는 Z-절편 더욱 증가 광 손상을 참고. 좋은 자동 초점 시스템은 많은 Z 섹션에 대한 필요성을 감소시키고, 추천된다. </li></ol></li><li> 팁 결합 형 특정 동작을 연구합니다 : <ol><li> heterothallic 균주, H- 사용하여 두 종류의 세포를 구별 할 수 있도록 H + 세포는 형광을 발현하는 별개. 어떤 유전자 인코딩 fluoropho를 사용하여우리가 sfGFP, GFP (17)의 빠른 접는 변형 좋은 성공이 있었다하지만, 내인성 단백질을 세포질 버전 또는 융합으로 표현 다시. 내인성 단백질은 일반적으로 상동 재조합 (14)에 의해 자신의 내생 게놈 궤적에 태그가 지정됩니다. </li><li> homothallic 균주 각각 P 및 M 세포에서 발현을 유도하는 등 페로몬 수용체 유전자 map3 체크하고 mam2의 것과 결합 형 특이 적 프로모터의 제어하에 유전자 부호화 세포질 형광 단백질을 발현. map3 체크 및 mam2의 프로모터는 식물의 성장 기간 동안 비활성 질소 기아 (18, 19)에 유도된다. 이러한 프로모터의 통제하에 GFP 또는 세포질 mCherry의 발현을 구동 구조체는 일반적으로 성적주기 (12)의 정상적인 진행을 방해하지 않는 게놈 유전자좌 (ura4, leu1)에 통합된다. </li></ol></리&gt; <li> (프로토콜 3.2.2 절에서와 같이)를 사용하여 결합 형 특정 세포질 형광은 다른 하나의 파트너 세포에서 형광 신호의 전송으로 시각 세포 융합의 정확한 타이밍을 결정합니다. </li></ol> 결합 및 융합 효율성 4. 정량 <ol><li> 위의 단계 2.3.1에서와 같이, MSL-N 아가로 오스 패드에 세척 직접 MSL-N 후 결합 및 융합 효율성 11, 12, 스팟 세포를 정량화하고, 25 ° C 전에 이미징 (그림 1A)에서 24 시간 동안 둡니다. 이 homothallic 야생형 균주의 결합 효율에 도달 프로토콜 ~ 60 % 융합 효율 99 % 사용. 돌연변이 균주에서 관찰이 값의 삭감 터미널 표현형 또는 지연을 반영 여부를 테스트하기 위해 36 시간의 배양 시간과 실험을 반복한다. </li><li> 같은 결합 효율을 계산 <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/53801/53801eq1.jpg" /> 결합 쌍에서 확인 접합체, ASCI 및 융합 세포 쌍을 포함서로에 대한 그들의 위치와 성장. </li><li> 같은 융합 효율을 계산 <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/53801/53801eq2.jpg" /> 참고 융합 결합 쌍는 연구중인 돌연변이 포자 형성에 영향을주지 않는 것으로 알려져 있다면 포자를 형성하는 능력에 의해 식별된다. 포자는 판독으로 사용할 수없는 경우, 융합 파트너 모두에 하나의 결합 파트너 표현 세포질 마커의 확산을 관찰함으로써 결정된다. </li></ol>

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+shallow+chemical+gradients+by+actin-driven+wandering+of+the+polarization+site.">Tracking shallow chemical gradients by actin-driven wandering of the polarization site.</a> Curr Biol. 23 (1), 32-41 (2013).</li><li>Beta, C., Bodenschatz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+tools+for+quantitative+studies+of+eukaryotic+chemotaxis.">Microfluidic tools for quantitative studies of eukaryotic chemotaxis.</a> Eur J Cell Biol. 90 (10), 811-816 (2011).</li><li>Lee, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+dynamic+assay+of+single+cell+chemotaxis.">Quantitative and dynamic assay of single cell chemotaxis.</a> Integr Biol (Camb). 4 (4), 381-390 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

환경 조건, 영양 가용성은 특히 강하게 분열 효모의 생리에 영향을 미칩니다. 질소 기아는 유성 생식에 헌신 필요하고 초기에 유사 분열 세포주기 진행에 눈에 띄는 변화 (참조. 21 및 그림 2)에 연결됩니다. 기하 급수적으로 증가하는 인구에서 질소 제거 후, 부문 셀 크기가 빠르게 (도 2C) 감소하고 세포의 대부분은 새로 태어난 기하 급수적으로 성장 세포 (참조. <s...

두 셀 간의 유전자 교환 유성 생식의 중앙 이​​벤트이지만, 그것은 세포 분화를 촉진 파트너의 선택을 허용, 세포 - 세포 융합을 수행하고 유전체의 안정성을 유지하는 일련의 사건에 의존한다. 따라서 성적 기간이 발달 스위치 관련 생물학적 질문들을 연구하는 모델 시스템 자체를 제시 분열 효모 이러한 현상을 연구 성적 사이클 탐색 등의 외적 자극 세포막 융합, 염색체 분리에 반응의 이점을 가져온다 모델 시스템의 강력한 유전학, 높은 처리량 방법과 정교한 현미경을 잘 설립. 분열 효모에서 섹스는 P-셀과 별개의 결합 유형의 M 세포 사이의 이형 이벤트입니다. 두 세포 유형은 차동 분비 P- 생산 및 M-페로몬, 페로몬 수용체 map3 체크하고 Mam2뿐만 아니라 페로몬 테아위한 포함한 유전자 1,2-들을 표현할SES Sxa1 및 Sxa2. 이러한 일반적으로 사용 H90 균주로서 Homothallic 균주, 단일 게놈 모두 결합 타입 유전 정보를 전달 및 세포 (참조. 3에서 검토) 분열주기에 걸쳐 결합 형 스위칭 복잡한 패턴을 겪는다. 거의 또는 전혀 결합 유형을 전환하지 heterothallic 분열 효모의 여러 균주는 일반적으로 가장 눈에 띄게, H + N (P 형) 및 시간 -S (M 형) 균주를 4를 사용한다. 분열 효모에서 성적 라이프 사이클에 진입 엄격한 영양 조절을 받고있다. 만 질소에 굶주린 분열 효모 세포 유사 분열 재생을 체포하고 짝짓기 파트너의 존재를 신호하고 (참조. 5에서 검토)의 성적 사이클의 추가 단계를 촉진 확산 성 페로몬을 생산하고 있습니다. 질소 부족의 발달 스위치 역할을하며 전자를 촉진 상대 Ste11의 주요 전사 조절을 드-억압페로몬 수용체와 페로몬 생산 유전자 6,7를 포함하여 특정 유전자 짝짓기의 xpression. 페로몬 수용체의 결합은 더욱 따라서 짝짓기 파트너 사이의 긍정적 인 피드백에 페로몬 생산을 증가, Ste11 전사 활동 8-10을 향상 수용체 결합 단백질 G 알파 및 다운 스트림 MAPK 신호를 활성화합니다. 페로몬 수준은 세포 극성의 Rho 가족는 GTPase Cdc42 (11)의 마스터 주최자를 조절하여 다른 세포 편광 상태를 유도하기에 매우 중요하다. 페로몬 낮은 농도에 노출시 활성 Cdc42은 세포 주위를 둘러 동적 패치 시각화하고, 어떤 세포 성장이 단계에서 관찰되지 않는다. 증가 페로몬 레벨 단일 영역과 편광 돌기의 성장에 Cdc42 활동의 안정화를 촉진 접촉 상대 세포를 제공 내가 어릴 때 좋아했던 연재 만화를 불린다. 이어서, 두 개의 반수체 결합 파트너 배체의 접합자를 형성하는 퓨즈. 최근 작품은 일을 계시상대 유도 formin FUS1 (12)에 의해 조립 융합에 필수적인 새로운 액틴 구조의 전자의 존재. 이 융합 포커스 따라서 세포 용해 (12)없이 세포막의 접촉을 허용하도록 칸막이 벽의 개장을 허용 타입 V 미오신 종속 프로세스 집중과 세포벽 분해 장치를 위치. 세포 - 세포 융합 후, 핵 접촉하고 karyogamy을 겪는다. 접합자 (말 꼬리 운동) 내부 핵의 눈에 ​​띄는 네인 의존 전후 운동은 감수 분열 뒤에 염색체 상 동체 (13, 14)의 페어링을 촉진한다. 마지막으로, 감수 분열의 네 제품은 포자 동안 개별 포자로 포장됩니다. 때문에 복잡성과 관련된 수많은 단계, 상대의 상세한 모니터링에 도전하고있다. 두 주목할만한 문제는 전체 프로세스가 아니라 다섯 시간 이상을 소요하고 세포를 동기화하기 어려운 것이 있습니다. 이 라ifficulties은 단일 셀 현미경 접근 방식에 의해 피할 수 있습니다. 여기에 일반적인 프로토콜은 분열 효모의 성적 라이프 사이클이 제시 조사합니다. 약간의 조정으로,이 프로토콜은 프로세스의 모든 다른 단계, 상대 유전자 산물, 비 자매 파트너 짝짓기 형 스위칭 후 자매 세포 사이 사이에 셀 편광 및 페어링, 세포 - 세포 융합, 즉 유도의 연구를 허용, 및 사후 융합 말 꼬리 운동, 감수 분열과 포자. 이 방법은 쉽게 시각화 형광 동안 및 사후 융합, 시간 사전을 통해 단백질 태그)을 1로 할 수 있습니다; 2) 대향 결합 형 세포의 행동을 식별; 3) 측정 및 shmooing, 결합, 융합 또는 포자 효율과 같은 매개 변수를 정량화.

<table><tbody><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-10KG</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05108.0050</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71381</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12095</td><td></td></tr><tr><td>Pantothenate</td><td>AppliChem</td><td>A2088,0025</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinic Acid</td><td>AppliChem</td><td>A0963,0100</td><td></td></tr><tr><td>Inositol</td><td>AppliChem</td><td>A1716,0100</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>AppliChem</td><td>A0967,0250</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>AppliChem</td><td>A1038,0250</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>AppliChem</td><td>A3514,0250</td><td></td></tr><tr><td>Molybdenum oxide (VI) (MoO&lt;sub&gt;3)&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69850</td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td>AppliChem</td><td>A3872,0100</td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>AppliChem</td><td>A1034,0500</td><td></td></tr><tr><td>Citric Acid&amp;nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A2344,0500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Promega</td><td>V3125</td><td></td></tr><tr><td>(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.01217.1000</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000-100G</td><td></td></tr><tr><td>Adenine Hemisulfat Salt, mini 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9126-100G</td><td></td></tr><tr><td>Uracil&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>Lanolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7387</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Reactolab</td><td>92045-74-4</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Reactolab</td><td>7005600</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopy of fission yeast sexual lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

질소 소스를 제거하면 분열 효모의 성장과 결합 역학 질소 기아는 분열 효모에서 유성 생식의 시작을위한 전제 조건이기 때문에, 야생형 homothallic H90 균주는 그림 1에 설명 된 프로토콜에 따라 질소가 풍부한 질소 박탈 매체 (그림 2)에서 변화에 따라 측정 하였다. 요약하면, 세포를 , MSL + N 매체에 지수 상 (OD = 0.5 (600))에 O / N 성...

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Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

분열 효모 성적 라이프 사이클의 현미경

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

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14.4K 조회수.  University of Lausanne. We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process. 

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Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (smFISH) 신진 효 모 무성 한 성장 및 감수 분열 분석

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

연구

유전학

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

버딩 효모에서 단백질 농도의 함수로 형태학의 표현형의 발전 분석

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

생물학

Visualizing Yeast Organelles with Fluorescent Protein Markers

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have constructed fluorescent protein-based markers for major organelles and endomembrane structures, including the nucleus, endoplasmic reticulum (ER), Golgi apparatus, endosomes, vacuoles, mitochondria, peroxisomes, lipid droplets, and autophagosomes. The protocol presented here describes the procedures for using these markers in yeast, including DNA preparation for yeast transformation, selection and evaluation of transformants, fluorescent microscopic observation, and the expected outcomes. The text is geared toward researchers who are entering the field of yeast organelle study from other backgrounds. Essential steps are covered, as well as technical notes about microscope hardware considerations and several common pitfalls. It provides a starting point for people to observe yeast subcellular entities by live-cell fluorescent microscopy. These tools and methods can be used to identify protein subcellular localization and track organelles of interest in time-lapse imaging.

Here we describe the use of a set of fluorescent protein-based organelle markers in live-cell imaging of the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have ...

생화학

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

분열 효모의 양적 라이브 세포 형광 - 현미경 분석

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and development. Cytokinesis involves a series of events that are well coordinated in time and space. Cytokinesis involves the formation of an actomyosin ring at the division site, followed by ring constriction, membrane furrow formation and extra cellular matrix remodeling. The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe (S.&#160;pombe)&#160;is a well-studied model system that has revealed with substantial clarity the initial events in cytokinesis. However, we do not understand clearly how different cytokinetic events are coordinated spatiotemporally. To determine this, one needs to analyze the different cytokinetic events in great details in both time and in space. Here we describe a microscopy approach to examine different cytokinetic events in live cells. With this approach it is possible to time different cytokinetic events and determine the time of recruitment of different proteins during cytokinesis. In addition, we describe protocols to compare protein localization, and distribution at the site of cell division. This is a basic protocol to study cytokinesis in fission yeast and can also be used for other yeasts and fungal systems.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe&#160;is an excellent model system to study cytokinesis, the final stage in cell division. Here we describe a microscopy approach to analyze different cytokinetic events in live fission yeast cells.

분열 효모의 Cytokinetic 이벤트의 시공간 분석

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

고해상도 이미징 및 개인 별이 미세 소관 역학의 분석 신진 효모에서

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

형광 라이브 세포 현미경 검사법에 의한 미토틱 및 Meiotic 핵분열 효모 핵 역학의 검사

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ultrastructure of cells; artifacts and extraction of cell contents are usually observed. Rapid freezing is a better alternative for the preservation of cell structure. Sandwich freezing of living yeast or bacteria followed by freeze-substitution has been used for observing the exquisite natural ultrastructure of cells. Recently, sandwich freezing of glutaraldehyde-fixed cultured cells or human tissues has also been used to reveal the ultrastructure of cells and tissues. 
These studies have thus far been carried out with a handmade sandwich freezing device, and applications to studies in other laboratories have been limited. A new sandwich freezing device has recently been fabricated and is now commercially available. The present paper shows how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. Also shown is the preparation of specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing and procedures for freeze-substitution, resin embedding, trimming of blocks, cutting of ultrathin sections, recovering of sections, staining, and covering of grids with support films.

Here we show how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. We also show how to prepare specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing.

전자 현미경 검사에서 생물학적 표본의 좋은 초구조 보존을 위한 샌드위치 동결 장치를 사용하여 급속한 동결

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often not seen by imaging fixed cells. Budding yeast has proved to be an important model organism to study meiotic chromosome segregation because many meiotic genes are highly conserved. Time-lapse microscopy of meiosis in budding yeast allows the monitoring of different meiotic mutants to show how the mutation disrupts meiotic processes. However, many proteins function at multiple points in meiosis. The use of loss-of-function or meiotic null mutants can therefore disrupt an early process, blocking or disturbing the later process and making it difficult to determine the phenotypes associated with each individual role. To circumvent this challenge, this protocol describes how the proteins can be conditionally depleted from the nucleus at specific stages of meiosis while monitoring meiotic events using time-lapse microscopy. Specifically, this protocol describes how the cells are synchronized in prophase I, how the anchor away technique is used to deplete proteins from the nucleus at specific meiotic stages, and how time-lapse imaging is used to monitor meiotic chromosome segregation. As an example of the usefulness of the technique, the kinetochore protein Ctf19 was depleted from the nucleus at different time points during meiosis, and the number of chromatin masses was analyzed at the end of meiosis II. Overall, this protocol can be adapted to deplete different nuclear proteins from the nucleus while monitoring the meiotic divisions.

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse microscopy is a valuable tool for studying meiosis in budding yeast. This protocol describes a method that combines cell-cycle synchronization, time-lapse microscopy, and conditional depletion of a target protein to demonstrate how to study the function of a specific protein during meiotic chromosome segregation.

S. cerevisiae에서 감수 분열을 연구하기 위해 타임 랩스 현미경 및 단백질의 단계 별 핵 고갈 사용

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

박테리아 세포골격 단백질의 중합에 영향을 미치는 약물 식별

Fission Yeast as a Platform for Antibacterial Drug Screens Targeting Bacterial Cytoskeleton Proteins

Bacterial cytoskeletal proteins such as FtsZ and MreB perform essential functions such as cell division and cell shape maintenance. Further, FtsZ and MreB have emerged as important targets for novel antimicrobial discovery. Several assays have been developed to identify compounds targeting nucleotide binding and polymerization of these cytoskeletal proteins, primarily focused on FtsZ. Moreover, many of the assays are either laborious or cost-intensive, and ascertaining whether these proteins are the cellular target of the drug often requires multiple methods. Finally, the toxicity of the drugs to eukaryotic cells also poses a problem. Here, we describe a single-step cell-based assay to discover novel molecules targeting bacterial cytoskeleton and minimize hits that might be potentially toxic to eukaryotic cells. Fission yeast is amenable to high-throughput screens based on microscopy, and a visual screen can easily identify any molecule that alters the polymerization of FtsZ or MreB. Our assay utilizes the standard 96-well plate and relies on the ability of the bacterial cytoskeletal proteins to polymerize in a eukaryotic cell such as the fission yeast. While the protocols described here are for fission yeast and utilize FtsZ from Staphylococcus aureus and MreB from Escherichia coli, they are easily adaptable to other bacterial cytoskeletal proteins that readily assemble into polymers in any eukaryotic expression hosts. The method described here should help facilitate further discovery of novel antimicrobials targeting bacterial cytoskeletal proteins.

저자 스포트라이트: 혁신적인 세포 기반 분석을 통해 새로운 항생제를 공개하기 위한 세포골격 역학 탐구

Fission yeast is used here as a heterologous host to express bacterial cytoskeletal proteins such as FtsZ and MreB as translational fusion proteins with GFP to visualize their polymerization. Also, compounds that affect polymerization are identified by imaging using a fluorescence microscope.

박테리아 세포골격 단백질을 표적으로 하는 항균 약물 스크리닝을 위한 플랫폼으로서의 핵분열 효모

Bacterial cytoskeletal proteins such as FtsZ and MreB perform essential functions such as cell division and cell shape maintenance. Further, FtsZ and MreB ...