AV foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado de longo prazo EMBO. Pesquisa no laboratório de Martin é financiado por uma bolsa ERC Starting (GeometryCellCycle) e uma subvenção Science Foundation Nacional Suíço (31003A_155944) para SGM.

análise de microscopia de reprodução sexual levedura 1. Preparação de Meios <ol><li> Prepare meio de esporulação Mínimo (MSL-N) 15 por mistura dos seguintes componentes: Glucose: 10 g / l, KH 2 PO 4: 1 g / L, NaCl: 0,1 g / L, MgSO4 · 7H 2 O: 0,2 g / EU. Adicionar oligoelementos (10.000x): 100 uL / L, vitaminas (1.000X): 1 mL / L, e 0,1 M de CaCl2 &#160; ml / L. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de tamanho de poro de 0,22 e armazenar a temperatura ambiente (RT). <ol><li> Utilize a seguinte Vitaminas (1.000x) da: Pantotenato: 1 g / L, ácido nicotínico: 10 g / l, inositol: 10 g / L, Biotina: 10 mg / L. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de tamanho de poro de 0,22 um e armazenar a 4 ° C. </li><li> Use os seguintes elementos-traço (10.000 vezes) inventário: Ácido Bórico: 5 g / L, MnSO4: 4 g / L, ZnSO4 · 7H 2 O: 4 g / L, FeCl 2 · 6H 2 O: 2 g / l , MoO 3: 0,4 g / L, KI: 1 g / L, CuSO4· 5H 2 O: 0,4 g / l, ácido cítrico a 10 g / L. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de tamanho de poro de 0,22 um e armazenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Prepare MSL-N de agarose a 2% (utilizado para fazer câmaras bloco de agarose) combinando 10 ml de N-MSL com 0,2 g de agarose. Derreta para ~ 2 min em alta potência em um forno de microondas até dissolver agarose e alíquotas de 0,5 ml em tubos de microcentrífuga. Armazenar à temperatura ambiente. </li><li> Prepare meio de esporulação mínima com azoto (MSL + N) do MSL-N através da adição de (NH 4) 2 SO 4: 1 g / L, leucina: 0,225 g / L, adenina: 0,225 g / L, uracilo: 0,225 g / L . Filtro-esterilizar utilizando um filtro de tamanho de poro de 0,22 um. Armazenar à temperatura ambiente. Nota: leucina, adenina e uracilo são adicionados a este meio para permitir o crescimento de estirpes auxotróficas. Suplemento de amino-ácido adicional deve ser incluído se a cepa utilizada carrega uma auxotrofia distinta (por exemplo his3Δ). Observe também que o trabalho com cepas plenamente prototrófica é recomendado, já que apenastais estirpes vai permitir alta eficiência de acoplamento. </li><li> Prepare 200 ml valap para vedação de câmara. Numa proveta de adicionar pesos iguais, de lanolina, vaselina (ou outro vaselina), e parafina. mistura de calor a baixa temperatura e mexa ocasionalmente até ficar bem misturado. Alíquota da mistura em vários pequenos pratos de petri. Armazenar à temperatura ambiente. </li></ol> 2. Cepas A cultura de fissão de levedura para Experimentos de acoplamento (Figura 1). <ol><li> Dia 1, Evening: Inocular estirpes recém-listradas de meios sólidos em tubos de cultura contendo 3 ml de MSL + N. Use tubos de fundo plano de diâmetro de cerca de 2,5 cm. Use outros tubos de cultura ou de frascos de cultura com um volume adaptado. Incubar durante a noite (O / N) com agitação a 25 ° C, 200 rpm. Se trabalhar com linhagens heterotálicas, inocular separadamente. <ol><li> Dilui-se suspensões de células em meios na manhã seguinte para assegurar que as culturas possuem uma densidade óptica medida a 600 nm (DO600) de 0,4-0,8 durante a noite. Nota:OD 600 medições como um proxy de concentração de células de levedura são lineares no intervalo de cerca de 0,1-1,0. Para o nosso espectrofotómetro OD 600 = 0,1 corresponde a 1,4 x 10 6 culas por ml. Assim, se OD inicial de 600 leituras são fora deste intervalo amostras precisa ser diluído / concentrada para medições confiáveis. </li></ol></li><li> Dia 2, Evening: Dilui-se as células em 20 ml de meio MSL + N para DO600 = 0,025 em frascos de 100 ml. Incubar estirpes de O / N a 30 ° C, 200 rpm. Nota: culturas de células do tipo selvagem deve chegar a OD 600 ~ 0,8 na manhã seguinte (15 horas depois). Se estiver a trabalhar com estirpes com maior tempo de geração ajustar diluição em conformidade. </li><li> Dia 3, Manhã: Medida OD600 para verificar que as culturas têm densidade celular de OD600 ~ 0,8. Se trabalhar com linhagens heterotálicas, misture um número igual de células parceiras. células de pelotas em 1000 xg e transferir para um 1,5 mltubo. Lave as células três vezes em 1 ml de meio MSL-N. Re-suspender as células em 3 ml de meio MSL-N e diluir as células a OD 600 = 1,5. <ol><li> Para monitorar o acasalamento entre as células irmã células montar diretamente para geração de imagens (ver Protocolo Secção 2.4). Use estirpes H90 homotálico, em que tipo de acasalamento de comutação terá lugar durante as divisões mitóticas que ocorrem após a privação de azoto. montagem imediata de células sobre a almofada de agarose assegura que, após a divisão celular, associado células permanecer ao lado do outro. </li><li> Para monitorar a polarização celular (dinâmica exploratórios e shmooing) incubar 1-3 ml de cultura de células a 30 ° C, 200 rpm durante 3-4 h antes de células de montagem para imagiologia. Dentro destas 3-4 horas, terá ocorrido a última divisão mitótica. Algumas células vão ter iniciado a polarização, mas a maioria só vai estar começando sua dinâmica de polarização exploratórios. </li><li> Para monitorizar a fusão célula-célula incubar 1-3 ml de cultura de células a 30 ° C, 200 rpm durante 4-6 h priou a células de montagem para imagiologia. </li><li> Monitorar eventos de fusão pós-incubar 1-3 ml de culturas celulares a 30 ° C, 200 rpm, durante 8 h antes de células de montagem para imagiologia. </li><li> Para monitorar a resposta a uma concentração de feromonas específicas (apenas para estirpes heterotálicas) incubar 3 ml de cultura de células a 30 ° C, 200 rpm durante 3-4 h antes de células de montagem para imagiologia. <ol><li> Retire o tubo de microcentrífuga MSL-N contendo a partir do bloco de calor C 95 ° (ver secção Protocolo 2.4.1. Abaixo). Adicionar P-factor ou factor-M na concentração desejada directamente na agarose MSL-N derretido. Misture bem em vortex antes da preparação pad imediata. </li><li> Após a montagem da célula, a almofada incubar durante 15-30 min a 25 ° C antes da imagiologia. -Factor P e factor-M feromonas foram usadas a partir de uma solução stock de 1 mg / ml em metanol. Nota: Se o trabalho com estirpes mutantes tempos de incubação podem variar. A aglomeração das células pode ocorrer após incubação prolongada em m líquidaEDIA e pode ser particularmente forte em algumas estirpes mutantes. células aglutinados não podem ser manchadas sobre almofadas de agarose em uma única camada e, assim, são difíceis de focagem automática e imagem. Em caso de extenso aglutinação celular células em almofadas de agarose montagem imediatamente após lavagens e re-suspensão em meios-falta de azoto (como no protocolo Secção 2.3.1.) E incubar a 30 ° C antes da imagiologia. </li></ol></li></ol></li><li> Montagem Cells for Imaging: <ol><li> Prepare MSL-N almofadas de agarose a 16 por fusão de uma alíquota num bloco de calor a-95 ° C durante 10-15 min e adicionar 200 ul entre duas lâminas de vidro separadas por espaçadores (Figura 1B). Use espaçadores com uma espessura de 0,5 mm ~. Para fazer os espaçadores, de uso tiras cortadas de cartão, como a que está fornecido com enzimas de restrição. </li><li> Pellet 100 ul de células a 1000 x g durante 1 min, remover o sobrenadante e as células em meio de 2-4 ul residual re-suspender. Não re-suspensão em meio fresco em que atrasaacasalamento. </li><li> Após 2-3 min remova cuidadosamente os espaçadores e a lâmina de vidro superior. Se várias cepas são para ser montado, prepare a célula se concentra antes de preparar a almofada de agarose. </li><li> Adicionar 1 ml de células para a almofada e esperar até a queda começa secagem (~ 1 min) antes de cobrir com tampa de deslizamento e selando com valap. </li><li> Deixe que a almofada de se sentar durante pelo menos 30 min antes de imagem a 25 ° C ou TA. </li><li> Para se obter uma mistura de células em vários estágios de acasalamento, fazer uma almofada imediatamente após lavagens em MSL-N (ver secção 2.3.) E incuba-se a 18 ° CO / N (~ 15 h). Essa abordagem é útil para geração de imagens de células em fases distintas de acasalamento com alta resolução temporal ou amostras com sinal fraco. </li></ol></li></ol> Imagem 3. Em células vivas de células de levedura de acoplamento <ol><li> Ajustar as Definições de aquisição. Nota: As configurações de aquisição de imagem aqui apresentados foram otimizados para a plataforma DeltaVision composto por uma personalização Olympus IX-71microscópio invertido com o Plano de Apo 60X / 1,42 NA ou U-Plano de Apo 100X / 1,4 objectivos de NA, uma câmera CoolSnap HQ2 e um 7 cores introspecção SSI unidade combinada iluminador. O equipamento é controlado por softWoRx v4.1.2 que também permite a auto-focagem digital. <ol><li> Assegure-se que os intervalos de focagem automática não excedam 15 min uma vez que o Z-tração sobre um tempo mais longo pode ultrapassar a capacidade do sistema de auto-focagem de software. Se estiver usando um sistema de focagem baseada em hardware, use intervalos maiores. </li><li> Ajuste o intervalo de imagem. Captar imagens a cada 10 minutos para ~ 15 hr como ponto de partida quando se trabalha com uma proteína fluorescente etiquetado pela primeira vez. Este intervalo fornece uma boa visão geral de todo o processo de acasalamento, sem branqueamento extensivo. <ol><li> Imagem com intervalos de 5 min ou mais curtas para mais precisamente eventos de tempo, como a fusão. intervalos mais curtos exigem fluoróforos fortes que permitam baixos tempos de exposição e pouco branqueamento. Para geração de imagens com intervalos inferiores a microscopia de 1 min evitar O / Ne em vez disso se preparar uma mistura de todas as fases de acoplamento tal como detalhado na Secção 2.4.6 Protocolo. </li></ol></li><li> Ajustar a imagem tempo de exposição. tempos de exposição de teste entre 50 e 300 ms. Destinam-se a estabelecer um equilíbrio entre a relação sinal-ruído e fotodegradação de alcançar um grande número de pontos de tempo com um sinal perceptível (normalmente mais de 100). </li><li> Ajustar Z-seccionamento. Secções cada 0,3 pm, cobrindo 5 uM fornecer uma boa profundidade da imagem. Note-se que aumenta ainda mais foto-lesão de corte Z, que podem ser minimizados através da utilização do OAI (integração eixo óptico - aquisição de um único varrimento da profundidade total da amostra). Bom sistema de foco automático reduz a necessidade de muitas Z-seções e é altamente recomendado. </li></ol></li><li> Dicas para estudar comportamentos específicos-Type Acasalamento: <ol><li> Para as estirpes heterotálicas, usar H- e H + células expressando fluoróforos diferentes, de modo que os dois tipos de células podem ser distinguidas. Use qualquer fluoropho geneticamente codificadoestá expresso como uma versão citosólica ou fusão de uma proteína endógena, embora tenhamos tido um bom sucesso com sfGFP, uma variante de dobrar rápida de GFP 17. Proteínas endógenas são geralmente etiquetado no seu local genómico endógeno por recombinação homóloga 14. </li><li> Para as estirpes homotálico, expressar uma proteína citosólica fluorescente geneticamente codificado sob o controlo de promotores específicos do tipo de acasalamento, tais como os dos genes de receptores de feromonas map3 e mam2 para conduzir a expressão em células P e M, respectivamente. Os promotores de map3 e mam2 estão inativas durante o crescimento vegetativo e são induzidas mediante privação de nitrogênio 18,19. Constructos de condução da expressão de GFP citosólico ou mCherry sob o controlo de um destes promotores são tipicamente integrados num locus genómico (ura4, Leu1) que não interfere com a progressão normal do ciclo de vida sexual 12. </li></ol></li&gt; <li> Use tipo de acasalamento fluoróforos citosólicas específicas (como na Seção Protocolo 3.2.2) para determinar o sincronismo preciso de fusão celular visualizado como a transferência de sinal fluorescente de uma célula parceiro para o outro. </li></ol> 4. Quantificação de acasalamento e fusão Eficiências <ol><li> Para quantificar a eficiência de fusão e de acoplamento 11,12, células no local directamente após MSL-N de lavagem sobre MSL-N almofadas de agarose, tal como no passo 2.3.1, supra, e deixar durante 24 horas a 25 ° C antes da imagiologia (Figura 1A). Usando este protocolo um tipo selvagem estirpe eficiência de acoplamento homotálico ~ atinge 60% e a eficiência de fusão de 99%. Para testar se qualquer redução nestes valores observados em estirpes mutantes reflectir um fenótipo terminal ou um atraso, repetir a experiência com um tempo de incubação 36 h. </li><li> Calcular a eficiência de acasalamento como <img alt="equação1" src="/files/ftp_upload/53801/53801eq1.jpg" /> pares de acasalamento incluem zigotos, asco, e pares de células não fundidas identificados a partir desua posição e crescimento para cada um dos outros. </li><li> Calcular a eficiência de fusão como <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/53801/53801eq2.jpg" /> Nota: pares de acasalamento fundidas são identificados pela sua capacidade de formar esporos, se for conhecido que o mutante sob estudo não influencia a esporulação. Se a esporulação não pode ser utilizado como leitura para fora, a fusão é determinada através da observação da propagação de um marcador citosólica expressa em apenas um dos parceiros de acoplamento em ambos os parceiros. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

condições ambientais e disponibilidade de nutrientes em particular, afetam fortemente a fisiologia da levedura de fissão. Privação de nitrogênio é necessário para compromisso com a reprodução sexual e, inicialmente, leva a mudanças marcantes na progressão do ciclo celular mitótico (Ref. 21 e Figura 2). Após a remoção do azoto população em crescimento exponencial, o tamanho das células em divisão diminui rapidamente (Figura 2C) e a maioria das células dete...

Apesar de intercâmbio genético entre duas células é o evento central na reprodução sexual, ele depende de uma cadeia de eventos que promovem a diferenciação celular, permitem a escolha do parceiro, realizar a fusão célula-célula e manter a estabilidade genômica. Assim, o ciclo de vida sexual se apresenta como um sistema modelo para estudar uma série de questões biológicas sobre interruptores de desenvolvimento, resposta a estímulos extrínsecos, a fusão da membrana plasmática, segregação cromossômica, etc. Explorando a levedura ciclo sexual para estudar esses fenômenos traz os benefícios da genética poderosos do sistema modelo, bem estabelecida abordagens de alto rendimento e de microscopia sofisticado. Sexo em levedura é um evento heterotípica entre uma célula e um P-célula M de tipos de cruzamento distintos. Os dois tipos de células expressam diferencialmente uma série de genes de 1,2, incluindo aqueles para a produção do ácido P- segregada e M-feromonas,-receptores de feromonas map3 e Mam2 bem como feromona-Proteases Sxa1 e Sxa2. Homotálico estirpes, tais como a estirpe H90 comumente utilizado, transportar a informação genética para os dois tipos de acasalamento em um único genoma e as células sofrem um padrão complexo de tipo de acasalamento de comutação ao longo do ciclo de vida do mitótico (revisto em Ref. 3). Vários isolados de levedura heterotálicas que raramente ou nunca mudar tipo de acasalamento também são comumente utilizados 4, o mais proeminente o h + N (P-tipo) e as cepas h S (M-tipo). Em levedura, a entrada no ciclo de vida sexual está sob regulação nutricional rigorosa. Apenas células de levedura de fissão deficientes em nitrogênio prender reprodução mitótico e produzir feromônios difusï¿½eis para sinalizar a presença de um parceiro de acasalamento e promover novas etapas do ciclo sexual (revisto em Ref. 5). privação de azoto de-reprime o regulador transcricional chave de Ste11 de acoplamento que funciona como um interruptor de desenvolvimento e promove expression de acasalamento genes específicos, incluindo o receptor de feromônio e o feromônio genes de produção de 6,7. Engajamento-receptor de feromônio ativa a proteína-acoplado receptor G-alfa e de sinalização MAPK a jusante que aumenta ainda mais Ste11 atividade transcricional 8-10, aumentando assim a produção de feromônio em um feedback positivo entre os parceiros de acasalamento. Níveis de feromonas são cruciais para induzir diferentes estados de polarização celular, regulando o organizador mestre da polaridade celular, a Rho-família GTPase Cdc42 11. Após a exposição a baixas concentrações de feromonas, Cdc42 activo é visualizado em manchas dinâmicos explorando a periferia da célula, e nenhum crescimento de células é observada nesta fase. níveis de feromônio aumento promover a estabilização da actividade Cdc42 a uma única zona e crescimento de uma projeção polarizada, denominado o shmoo, que traz células parceiras em contato. Posteriormente, os dois parceiros de acasalamento haplóide fundir para formar um zigoto diplóide. Um trabalho recente revela the existência de uma estrutura nova actina essencial para a fusão que é montado pela formin induzida por acasalamento FUS1 12. Este enfoque de fusão concentra processos dependentes tipo V-miosina e posiciona a maquinaria degradação da parede celular, permitindo, assim, a remodelação da parede celular para permitir o contacto da membrana plasmática, sem lise celular 12. Após a fusão célula-célula, os núcleos entram em contato e passam por cariogamia. Um movimento de vai-e-vem dependente da dineína proeminente dentro do núcleo do zigoto (o movimento do cavalo-cauda), em seguida, promove o emparelhamento de homólogos do cromossoma 13,14, que é seguido por meiose. Finalmente, os quatro produtos de meiose são embalados em esporos individuais durante a esporulação. Devido à sua complexidade e os numerosos passos envolvidos, monitoramento detalhado do acasalamento tem sido um desafio. Duas dificuldades notáveis ​​são que todo o processo leva bem mais de 15 horas e que as células são difíceis de sincronizar. estes difficulties são contornadas por abordagens de microscopia de uma única célula. Aqui um protocolo geral para investigar o ciclo de vida sexual na levedura de fissão é apresentado. Com pequenos ajustes, este protocolo permite o estudo de todas as diferentes etapas do processo, ou seja, a indução de produto do gene de acasalamento, a polarização celular e emparelhamento entre irmãos células após tipo de acasalamento de comutação e entre os parceiros não-irmã, a fusão célula-célula, e pós-fusão horse-tail movimento, a meiose e esporulação. Este método permite 1) visualizar facilmente fluorescente etiquetado proteínas ao longo do tempo pré, durante e pós-fusão; 2) discriminar o comportamento das células do tipo de cruzamento oposto; e 3) medir e quantificar parâmetros como shmooing, mating, fusão ou eficiência esporulação.

<table><tbody><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-10KG</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05108.0050</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71381</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12095</td><td></td></tr><tr><td>Pantothenate</td><td>AppliChem</td><td>A2088,0025</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinic Acid</td><td>AppliChem</td><td>A0963,0100</td><td></td></tr><tr><td>Inositol</td><td>AppliChem</td><td>A1716,0100</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>AppliChem</td><td>A0967,0250</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>AppliChem</td><td>A1038,0250</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>AppliChem</td><td>A3514,0250</td><td></td></tr><tr><td>Molybdenum oxide (VI) (MoO&lt;sub&gt;3)&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69850</td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td>AppliChem</td><td>A3872,0100</td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>AppliChem</td><td>A1034,0500</td><td></td></tr><tr><td>Citric Acid&amp;nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A2344,0500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Promega</td><td>V3125</td><td></td></tr><tr><td>(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.01217.1000</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000-100G</td><td></td></tr><tr><td>Adenine Hemisulfat Salt, mini 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9126-100G</td><td></td></tr><tr><td>Uracil&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>Lanolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7387</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Reactolab</td><td>92045-74-4</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Reactolab</td><td>7005600</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopy of fission yeast sexual lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

Fissão crescimento do fermento e Acasalamento Dynamics após a remoção da fonte de nitrogênio Como privação de nitrogênio é um pré-requisito para o início da reprodução sexual na levedura de fissão, estirpe de tipo selvagem H90 homotálico foi monitorada mediante mudança de para médio privado de azoto rico em nitrogênio (Figura 2), seguindo o protocolo apresentado na Figura 1. Resumidamente, as células foram cultivadas O ...

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Microscopia do ciclo de vida sexual da levedura de fissão | Biologia | Vídeo

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Microscopia do ciclo de vida sexual por fissão de levedura

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

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14.4K visualizações.  University of Lausanne. We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process. 

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Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

Única molécula fluorescência In Situ Hybridization (smFISH) análise em Budding fermento crescimento vegetativo e meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Genética

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Análise do desenvolvimento de um fenótipo morfológico como uma função da concentração de proteínas em levedura de brotamento

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Biologia

Visualizing Yeast Organelles with Fluorescent Protein Markers

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have constructed fluorescent protein-based markers for major organelles and endomembrane structures, including the nucleus, endoplasmic reticulum (ER), Golgi apparatus, endosomes, vacuoles, mitochondria, peroxisomes, lipid droplets, and autophagosomes. The protocol presented here describes the procedures for using these markers in yeast, including DNA preparation for yeast transformation, selection and evaluation of transformants, fluorescent microscopic observation, and the expected outcomes. The text is geared toward researchers who are entering the field of yeast organelle study from other backgrounds. Essential steps are covered, as well as technical notes about microscope hardware considerations and several common pitfalls. It provides a starting point for people to observe yeast subcellular entities by live-cell fluorescent microscopy. These tools and methods can be used to identify protein subcellular localization and track organelles of interest in time-lapse imaging.

Here we describe the use of a set of fluorescent protein-based organelle markers in live-cell imaging of the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have ...

Bioquímica

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitativas de células vivas de Análise de microscopia de fluorescência de levedura

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and development. Cytokinesis involves a series of events that are well coordinated in time and space. Cytokinesis involves the formation of an actomyosin ring at the division site, followed by ring constriction, membrane furrow formation and extra cellular matrix remodeling. The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe (S.&#160;pombe)&#160;is a well-studied model system that has revealed with substantial clarity the initial events in cytokinesis. However, we do not understand clearly how different cytokinetic events are coordinated spatiotemporally. To determine this, one needs to analyze the different cytokinetic events in great details in both time and in space. Here we describe a microscopy approach to examine different cytokinetic events in live cells. With this approach it is possible to time different cytokinetic events and determine the time of recruitment of different proteins during cytokinesis. In addition, we describe protocols to compare protein localization, and distribution at the site of cell division. This is a basic protocol to study cytokinesis in fission yeast and can also be used for other yeasts and fungal systems.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe&#160;is an excellent model system to study cytokinesis, the final stage in cell division. Here we describe a microscopy approach to analyze different cytokinetic events in live fission yeast cells.

Análise espacial e temporal da Cytokinetic Eventos na levedura de fissão

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Imagens de alta resolução e Análise de individuais Astral microtúbulos Dynamics em brotamento Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Examinação da dinâmica nuclear do fermento mitotic e Meiotic da fissão pela microscopia viva-pilha da fluorescência

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ultrastructure of cells; artifacts and extraction of cell contents are usually observed. Rapid freezing is a better alternative for the preservation of cell structure. Sandwich freezing of living yeast or bacteria followed by freeze-substitution has been used for observing the exquisite natural ultrastructure of cells. Recently, sandwich freezing of glutaraldehyde-fixed cultured cells or human tissues has also been used to reveal the ultrastructure of cells and tissues. 
These studies have thus far been carried out with a handmade sandwich freezing device, and applications to studies in other laboratories have been limited. A new sandwich freezing device has recently been fabricated and is now commercially available. The present paper shows how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. Also shown is the preparation of specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing and procedures for freeze-substitution, resin embedding, trimming of blocks, cutting of ultrathin sections, recovering of sections, staining, and covering of grids with support films.

Here we show how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. We also show how to prepare specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing.

Congelamento rápido usando dispositivo de congelamento de sanduíches para boa preservação ultraestrutural de espécimes biológicos em microscopia eletrônica

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often not seen by imaging fixed cells. Budding yeast has proved to be an important model organism to study meiotic chromosome segregation because many meiotic genes are highly conserved. Time-lapse microscopy of meiosis in budding yeast allows the monitoring of different meiotic mutants to show how the mutation disrupts meiotic processes. However, many proteins function at multiple points in meiosis. The use of loss-of-function or meiotic null mutants can therefore disrupt an early process, blocking or disturbing the later process and making it difficult to determine the phenotypes associated with each individual role. To circumvent this challenge, this protocol describes how the proteins can be conditionally depleted from the nucleus at specific stages of meiosis while monitoring meiotic events using time-lapse microscopy. Specifically, this protocol describes how the cells are synchronized in prophase I, how the anchor away technique is used to deplete proteins from the nucleus at specific meiotic stages, and how time-lapse imaging is used to monitor meiotic chromosome segregation. As an example of the usefulness of the technique, the kinetochore protein Ctf19 was depleted from the nucleus at different time points during meiosis, and the number of chromatin masses was analyzed at the end of meiosis II. Overall, this protocol can be adapted to deplete different nuclear proteins from the nucleus while monitoring the meiotic divisions.

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse microscopy is a valuable tool for studying meiosis in budding yeast. This protocol describes a method that combines cell-cycle synchronization, time-lapse microscopy, and conditional depletion of a target protein to demonstrate how to study the function of a specific protein during meiotic chromosome segregation.

Uso de microscopia Time-Lapse e Depleção Nuclear Específica de Estágio de Proteínas para Estudo da Meiose em S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

Identificando drogas que afetam a polimerização de proteínas bacterianas do citoesqueleto

Fission Yeast as a Platform for Antibacterial Drug Screens Targeting Bacterial Cytoskeleton Proteins

Bacterial cytoskeletal proteins such as FtsZ and MreB perform essential functions such as cell division and cell shape maintenance. Further, FtsZ and MreB have emerged as important targets for novel antimicrobial discovery. Several assays have been developed to identify compounds targeting nucleotide binding and polymerization of these cytoskeletal proteins, primarily focused on FtsZ. Moreover, many of the assays are either laborious or cost-intensive, and ascertaining whether these proteins are the cellular target of the drug often requires multiple methods. Finally, the toxicity of the drugs to eukaryotic cells also poses a problem. Here, we describe a single-step cell-based assay to discover novel molecules targeting bacterial cytoskeleton and minimize hits that might be potentially toxic to eukaryotic cells. Fission yeast is amenable to high-throughput screens based on microscopy, and a visual screen can easily identify any molecule that alters the polymerization of FtsZ or MreB. Our assay utilizes the standard 96-well plate and relies on the ability of the bacterial cytoskeletal proteins to polymerize in a eukaryotic cell such as the fission yeast. While the protocols described here are for fission yeast and utilize FtsZ from Staphylococcus aureus and MreB from Escherichia coli, they are easily adaptable to other bacterial cytoskeletal proteins that readily assemble into polymers in any eukaryotic expression hosts. The method described here should help facilitate further discovery of novel antimicrobials targeting bacterial cytoskeletal proteins.

Autor em destaque: explorando a dinâmica do citoesqueleto para revelar novos antibióticos por meio de ensaios inovadores baseados em células

Fission yeast is used here as a heterologous host to express bacterial cytoskeletal proteins such as FtsZ and MreB as translational fusion proteins with GFP to visualize their polymerization. Also, compounds that affect polymerization are identified by imaging using a fluorescence microscope.

Levedura de fissão como plataforma para triagens de drogas antibacterianas direcionadas a proteínas do citoesqueleto bacteriano

Bacterial cytoskeletal proteins such as FtsZ and MreB perform essential functions such as cell division and cell shape maintenance. Further, FtsZ and MreB ...