AV wurde durch ein EMBO langfristigen Postdoc-Stipendium unterstützt. Die Forschung im Labor Martin wird durch einen ERC Starting Grant (GeometryCellCycle) und einer Schweizerischen National Science Foundation Grant (31003A_155944) zu SGM finanziert.

Mikroskopie Analyse von Spalthefe geschlechtliche Fortpflanzung 1. Medienvorbereitung <ol><li> Bereiten Minimum Sporulationsmedium (MSL-N) 15 durch Vermischen der folgenden Komponenten: Glucose: 10 g / L, KH 2 PO 4: 1 g / l, NaCl: 0,1 g / L, MgSO 4 · 7H 2 O: 0,2 g / L. Hinzufügen Spurenelemente (10.000X): 100 &amp; mgr; l / L, Vitamine (1,000x): 1 ml / L und 0,1 M CaCl 2 &#160; ml / L. Filter-sterilisieren einen 0,22 um Porengröße Filter und Speicher unter Verwendung von bei Raumtemperatur (RT). <ol><li> Verwenden Sie die folgenden Vitamine (1,000x) Lager: Pantothenate: 1 g / l, Nicotinsäure: 10 g / l, Inositol: 10 g / l, Biotin: 10 mg / l. Filter-sterilisieren einen 0,22 um Porengröße Filter und Speicher unter Verwendung bei 4 ° C. </li><li> Verwenden Sie die folgenden Spurenelemente (10.000fach) Lager: Borsäure: 5 g / l, MnSO 4: 4 g / l, ZnSO 4 · 7 H 2 O: 4 g / l, FeCl 2 · 6 H 2 O: 2 g / L , MoO 3: 0,4 g / L, KI: 1 g / l, CuSO 4· 5H &amp; sub2 ; O: 0,4 g / L, Zitronensäure: 10 g / L. Filter-sterilisieren einen 0,22 um Porengröße Filter und Speicher unter Verwendung bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Bereiten MSL-N 2% Agarose (Agarose verwendet pad Kammern bilden) durch Kombinieren von 10 ml MSL-N mit 0,2 g Agarose. Schmelzen Sie für ~ 2 min bei hoher Leistung in einem Mikrowellenofen bis Agarose löst und aliquote 0,5 ml in Mikrozentrifugenröhrchen. Lagern Sie bei RT. </li><li> Bereiten Minimum Sporulationsmedium mit Stickstoff (MSL + N) aus MSL-N durch Zugabe von (NH 4) 2 SO 4: 1 g / L, Leucin: 0.225 g / L, Adenin: 0,225 g / l, Uracil: 0.225 g / L . Filter-sterilisieren einen 0,22 um Porengröße Filter. Lagern Sie bei RT. Anmerkung: Leucine, Adenin und Uracil werden in diesem Medium zugesetzt, um das Wachstum von auxotrophen Stämmen zu ermöglichen. Zusätzliche Aminosäure Ergänzung sollte aufgenommen werden , wenn die verwendete Stamm einen deutlichen Auxotrophie trägt (zum Beispiel his3Δ). Bitte beachten Sie auch mit voll Prototroph Stämme, dass die Arbeit beachten wird empfohlen, da nursolche Stämme werden hohe Paarungseffizienz ermöglichen. </li><li> Bereiten Sie 200 ml VALAP für Kammerdichtung. In einem Becher hinzufügen gleichen Gewichten von Lanolin, Vaseline (oder andere Vaseline) und Paraffin. Wärme Mischung bei niedriger Temperatur und umrühren, bis sie gründlich vermischt. Aliquot der Mischung in mehrere kleine Petrischalen. Lagern Sie bei RT. </li></ol> 2. Anzucht Fission Hefestämmen für Mating Experimente (Abbildung 1). <ol><li> 1. Tag, Abend: Impfen frisch ausgestrichenen Stämme aus festen Medien in Kulturröhrchen mit 3 ml MSL + N. Verwenden Sie Flachbodenröhrchen von etwa 2,5 cm Durchmesser. Verwenden Sie andere Kulturröhrchen oder Flaschen mit angepassten Kulturvolumen. Inkubieren über Nacht (O / N) mit bei 25 ° C Schütteln, 200 UpM. Wenn mit heterothallisch Stämme arbeiten, impfen getrennt. <ol><li> Verdünnte Zellsuspensionen in Medien am nächsten Morgen um sicherzustellen , dass Kulturen optische Dichte bei 600 nm (OD 600) von 0,4 bis 0,8 am Abend , gemessen. Hinweis:OD 600 Messungen als Proxy der Zellkonzentration für Spalthefe sind linear im Bereich von etwa 0,1-1,0. Für unsere Spektrophotometer OD 600 = 0,1 entspricht 1,4 x 10 6 Zellen pro ml. Wenn also Anfangs - OD 600 liest sind außerhalb dieses Bereichs Proben müssen für zuverlässige Messungen verdünnt / konzentriert werden. </li></ol></li><li> Tag 2, Abend: Verdünnte Zellen in 20 ml MSL + N Medien 600 = 0,025 in 100 ml - Kolben zu Od. Inkubieren Stämme O / N bei 30 ° C, 200 Umdrehungen pro Minute. Hinweis: Wildtyp - Zellkulturen sollte OD 600 ~ 0,8 am nächsten Morgen (15 Stunden später) zu erreichen. Bei der Arbeit mit den Stämmen mit längeren Generationszeit entsprechend anpassen Verdünnung. </li><li> Tag 3, Morgen: Messen Sie 600 OD , um zu überprüfen , dass Kulturen Zelldichte von OD 600 ~ 0,8 haben. Wenn mit heterothallisch Stämme arbeiten, die gleiche Anzahl von Partnerzellen mischen. Pellet-Zellen bei 1000 × g und in ein 1,5 mlTube. Wasche die Zellen dreimal in 1 ml MSL-N-Medium. Re-suspendieren Zellen in 3 ml MSL-N Medium und Zellen zu verdünnen 600 = 1,5 bis Od. <ol><li> Zur Paarung zwischen Schwesterzellen Zellen direkt für die Bildgebung Halter (siehe Protokoll Abschnitt 2.4) zu überwachen. Verwenden Sie homothallisch H90 - Stämme, bei dem Paarungstyp Schalten findet während der mitotischen Teilungen nehmen nach dem Stickstoffentzug auftreten. Sofortige Montage von Zellen auf der Agarose-Pad ist sichergestellt, dass nach der Zellteilung, Schwester-Zellen nebeneinander bleiben. </li><li> Zellpolarisation (Sondierungsdynamik und shmooing) inkubieren 1-3 ml Zellkultur für die Bildgebung bei 30 ° C, 200 Upm für 3-4 Stunden vor der Montage Zellen zu überwachen. Innerhalb dieser 3-4 Stunden wird sich die letzte mitotische Teilung aufgetreten. Einige Zellen haben Polarisation eingeleitet, aber die meisten werden nur ihre Sondierungspolarisationsdynamik beginnen. </li><li> Zur Überwachung der Zell-Zell-Fusion 1-3 ml Zellkultur bei 30 ° C, 200 Upm für 4-6 h pri inkubierenoder an Zellen für die Bildgebung Montage. </li><li> Zu überwachen post-Fusionsereignisse inkubieren 1-3 ml der Zellkulturen bei 30 ° C, 200 Upm für 8 Stunden vor der Zellen für die Bildgebung Montage. </li><li> Zur Überwachung Reaktion auf eine bestimmte Pheromonkonzentration (nur für heterothallisch Stämme) inkubieren 3 ml der Zellkultur bei 30 ° C, 200 Upm für 3-4 Stunden vor der Zellen für die Bildgebung Montage. <ol><li> Entfernen Sie die MSL-N-haltige Mikrozentrifugenröhrchen aus dem 95 ° C Wärmeblock (siehe Protokoll Abschnitt 2.4.1. Unten). In P-Faktor oder M-Faktor bei der direkt im geschmolzenen MSL-N Agarose gewünschte Konzentration. Gut mischen durch Vortexen bevor sofortige Pad Vorbereitung. </li><li> Nach der Zellmontage, Inkubation vor der Bildgebung das Pad für 15-30 min bei 25 ° C. P-Faktor und Faktor M-Pheromone wurden aus einer Stammlösung von 1 mg / ml in Methanol verwendet. Hinweis: Wenn mit mutierten Arbeits Stämme Inkubationszeiten variieren. Verklumpung der Zellen kann nach längerer Inkubation in flüssiger m auftretenedia und kann besonders stark sein, in einigen mutierten Stämmen. Verklumpten Zellen können nicht auf Agarose-Pads in einer einzigen Schicht gesichtet werden und somit schwer zu Autofokus und Bild. Bei umfangreichen Zelle Verklumpung Halterung Zellen auf Agarose-Pads sofort nach Waschungen und Resuspension in Stickstoff-fehlt-Medien (wie im Protokoll Abschnitt 2.3.1.) Und inkubieren bei 30 ° C vor der Bildgebung. </li></ol></li></ol></li><li> Montagezellen für Imaging: <ol><li> Bereiten MSL-N Agarose Kissen 16 , indem ein Aliquot in einem 95 ° C-Wärmeblock für 10-15 min Aufschmelzen und Zugabe von 200 &amp; mgr; l zwischen zwei Glasobjektträger getrennt durch Abstandshalter (1B). Verwenden Abstandshalter mit einer Dicke von ~ 0,5 mm. Um Verbreiterungen machen, aus Pappe, wie die Verwendung Streifen mit Restriktionsenzymen geliefert geschnitten. </li><li> Pellet 100 ul Zellen bei 1.000 × g für 1 min, um den Überstand zu entfernen und erneut zu suspendieren Zellen in Rest 2-4 &amp; mgr; l Medium. Sie NICHT in frischem Medium erneut zu suspendieren, wie es verzögertPaarung. </li><li> Nach 2-3 min sorgfältig Abstandhalter entfernen und die obere Glasträger. Wenn mehrere Stämme zu montieren sind, bereiten die Zelle konzentriert sich vor der Agarose-Pad vor. </li><li> 1 &amp; mgr; l der Zellen mit dem Pad und warten, bis der Tropfen Trocknen beginnt (~ 1 min), bevor sie mit Deckglas bedeckt und Abdichten mit VALAP. </li><li> Lassen Sie die Unterlage für mindestens 30 min vor der Bilderzeugung bei 25 ° C oder RT sitzen. </li><li> Zu einer Mischung von Zellen in verschiedenen Stadien der Paarung zu erhalten, machen Sie ein Pad sofort nach Waschungen in MSL-N (siehe Abschnitt 2.3.) Und Inkubation bei 18 ° CO / N (~ 15 h). Dieser Ansatz ist nützlich für die Zellen an unterschiedlichen Paarungs Phasen mit hoher zeitlicher Auflösung oder Proben mit schwachem Signal Bildgebung. </li></ol></li></ol> 3. Bildgebung lebender Zellen von Mating-Hefezellen <ol><li> Justieren Sie Bildaufnahme-Einstellungen. Hinweis: Die Bildaufnahme-Einstellungen hier vorgestellt wurden für die Deltavision-Plattform optimiert, bestehend aus einem maßgeschneiderten Olympus IX-71inverses Mikroskop mit Plan Apo 60x / 1,42 NA oder U-Plan Apo 100X / 1.4 NA Ziele, eine CoolSNAP HQ2 Kamera und einen Einblick SSI 7 Farbe kombinierte Einheit Illuminator. Die Hardware wird durch Softworx V4.1.2 gesteuert, die auch digital Autofokus ermöglicht. <ol><li> Sicherzustellen, dass die Autofokus-Intervalle nicht überschreiten 15 min, da die Z-Drift über längere Zeit die Kapazität der Software Autofokussierungssystem übertreffen können. Bei Verwendung eines Hardware-basierten Autofokus-System, verwenden Sie größere Intervalle. </li><li> Stellen Sie Imaging-Intervall. Nehmen Sie Bilder alle 10 Minuten für ~ 15 Stunden als Ausgangspunkt, wenn sie mit einem fluoreszierend markierten Proteins zum ersten Mal arbeiten. Dieses Intervall bietet einen guten Überblick über den gesamten Paarung ohne umfangreiche Bleichen. <ol><li> Bild mit 5-Minuten-Intervallen oder zu verkürzen, genauer Zeitereignisse wie Fusion. Kürzere Intervalle erfordern starke Fluorophore ermöglicht niedrige Belichtungszeiten und wenig Bleichen. Für die Bildgebung mit Abständen von weniger als 1 min vermeiden O / N-Mikroskopieund stattdessen eine Mischung aller Paarungsstufen herzustellen, wie in Protokoll Abschnitt 2.4.6 beschrieben. </li></ol></li><li> Passen Sie die Bildbelichtungszeit. Test-Belichtungszeiten zwischen 50 und 300 ms. Richten Sie ein Gleichgewicht zwischen dem Signal-zu-Rausch-Verhältnis und Photobleaching zu schlagen, wie eine große Anzahl von Zeitpunkten mit einem wahrnehmbaren Signal (in der Regel mehr als 100) zu erreichen. </li><li> Stellen Sie Z-Schnitte. Abschnitte alle 0,3 &amp; mgr; m Abdeckung 5 &amp; mgr; m bieten eine gute Bildtiefe. Beachten Sie, dass Z-sectioning weitere Erhöhungen photo Schäden, die durch Verwendung der OAI (optische Achse Integration - eine einzige Sweep Erwerb der gesamten Probentiefe) minimiert werden kann. Gute Autofokus-System reduziert die Notwendigkeit von vielen Z-Abschnitte und ist sehr zu empfehlen. </li></ol></li><li> Tipps Paarungstyp-spezifischen Verhaltensweisen zu studieren: <ol><li> Für heterothallisch Stämme verwenden h- und h + Zellen unterschiedliche Fluorophore exprimieren, so daß die zwei Zelltypen unterschieden werden können. Verwenden Sie eine beliebige genetisch kodierte fluorophowieder als cytosolische Version oder Fusion an ein endogenes Protein exprimiert, obwohl wir mit sfGFP guten Erfolg gehabt haben, eine schnelle Faltungs Variante von GFP 17. Endogene Proteine ​​werden in der Regel an ihren endogenen genomischen Locus durch homologe Rekombination 14 markiert. </li><li> Für homothallischen Stämmen exprimieren, jeweils eine genetisch kodierte cytosolischen fluoreszierendes Protein unter der Kontrolle des Paarungstyp spezifischen Promotoren , wie jene der Pheromon - Rezeptor - Gene map3 und MAM2 die Expression in P und M - Zellen zu treiben. Die Promotoren von map3 und MAM2 inaktiv sind während des vegetativen Wachstums und zeichnen sich bei Stickstoffmangel 18,19 induziert. Konstrukten Antreiben der Expression der cytosolischen GFP oder mCherry unter der Kontrolle dieser Promotoren werden typischerweise in einer genomischen Locus (ura4, leu1) integriert ist, die nicht mit dem normalen Verlauf des Sexuallebens Zyklus 12 nicht stört. </li></ol></li&gt; <li> Verwendung Paarungstyp spezifischen zytosolischen Fluorophore (wie in Abschnitt 3.2.2 Protocol) genaue Zeitpunkt der Zellfusion als die Übertragung von Fluoreszenzsignals von einer Partnerzelle zur anderen sichtbar zu bestimmen. </li></ol> 4. Quantifizierung der Paarung und Fusion Effizienzen <ol><li> Paarung und Fusionseffizienzen 11,12, Spot - Zellen direkt nach der MSL-N waschen auf MSL-N Agarose - Pads, wie in Schritt 2.3.1 oben, und lassen Sie für 24 Stunden bei 25 ° C vor der Bildgebung (Abbildung 1A) zu quantifizieren. Unter Verwendung dieses Protokolls ein homothallisch Wildtyp-Stamm Paarungseffizienz ~ 60% und Fusionseffizienz von 99% erreicht. Um zu testen, ob eine Reduzierung dieser in mutierten Stämmen beobachteten Werte spiegeln ein Terminal Phänotyp oder eine Verzögerung, wiederholen Sie den Versuch mit einer 36 Stunden Inkubationszeit. </li><li> Berechnen Paarungseffizienz als <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/53801/53801eq1.jpg" /> Mating Paare umfassen Zygoten, Asci, und nicht fusionierten Zellpaare identifiziert ausihre Position und das Wachstum gegenüber der jeweils anderen. </li><li> Berechnen Fusionseffizienz als <img alt="Equation2" src="/files/ftp_upload/53801/53801eq2.jpg" /> Anmerkung: Fused Paarungspaare durch ihre Fähigkeit identifiziert werden, Sporen zu bilden, wenn bekannt ist, dass die Mutante zu untersuch nicht Sporulation nicht beeinflusst. Wenn Sporulation nicht als Auslesen verwendet werden, Fusion wird durch die Beobachtung der Ausbreitung eines cytosolischen Marker in nur einem Paarungspartner in die beiden Partner bestimmt. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Umweltbedingungen und Nährstoffverfügbarkeit insbesondere beeinflussen stark die Spalthefe Physiologie. Stickstoffmangel ist notwendig , um Engagement für die sexuelle Fortpflanzung und zunächst führt zu spektakulären Veränderungen in der mitotischen Zellzyklus - Progression (Ref. 21 und Abbildung 2). Bei Stickstoffentfernung aus exponentiell wachsenden Bevölkerung, bei Teilung der Zellgröße schnell abnimmt (2C) und die Mehrzahl der Zellen verhaften mitotischen Prog...

Obwohl genetische Austausch zwischen zwei das zentrale Ereignis in der sexuellen Fortpflanzung ist es, Zellen, stützt sie sich auf eine Kette von Ereignissen, die Zelldifferenzierung fördern, ermöglichen die Partnerwahl durchführen Zell-Zell-Fusion und genomische Stabilität aufrechtzuerhalten. So ist die sexuelle Lebenszyklus selbst als Modellsystem stellt eine Reihe von biologischen Fragen in Bezug auf Entwicklungs Schalter, als Reaktion auf extrinsische Reize, Plasmamembranfusion, die Chromosomensegregation zu studieren, usw. Erforschung der Spalthefe Sexualzyklus , diese Phänomene zu studieren , bringt die Vorteile der Modellsystem leistungsstarke Genetik, gut etablierte High-Throughput-Ansätze und anspruchsvolle Mikroskopie. Sex in Spalthefe ist ein heterotypic Ereignis zwischen einer P-Zelle und einer M-Zelle von unterschiedlichen Paarungstypen. Die beiden Zelltypen differentiell eine Reihe von Genen 1,2 einschließlich der für die Produktion des sekretierten P- und M-Pheromonen, Pheromon-Rezeptoren Map3 und MAM2 sowie Pheromon-protea auszudrückenses Sxa1 und Sxa2. Homothallischen Stämmen wie den H90 - Stamm häufig verwendet, tragen die genetische Information für beide Paarungstypen in einem einzigen Genom und Zellen durchlaufen ein komplexes Muster von Paarungstyp Schalt ganzen Lebenszyklus mitotische ( zusammengefasst in Ref. 3). Mehrere Isolate von heterothallisch Spalthefe , die selten oder nie Paarungstyp wechseln werden auch häufig 4, am deutlichsten die h + N (P-Typ) und h -S (M-Typ) Stämme verwendet. In Spalthefe, Eintritt in den sexuellen Lebenszyklus ist unter strengen Ernährungs Regulierung. Nur verhaften Stickstoff verhungert Spalthefezellen mitotischen Reproduktion und produzieren diffusionsfähig Pheromone Anwesenheit eines Paarungspartner zu signalisieren , und weitere Schritte des Sexualzyklus fördern ( beschrieben in Ref. 5). Stickstoffentzug de-reprimiert den Schlüssel Transkriptionsregulator der Paarung Ste11, die als Entwicklungs Schalter wirkt und fördert expression spezifischer Gene einschließlich des Pheromon - Rezeptor - Paarung und dem Pheromon Produktion Gene 6,7. Pheromon-Rezeptor Engagement aktiviert den Rezeptor-gekoppelten Protein G-alpha und Downstream - MAPK - Signalisierung , die eine weitere Verbesserung Ste11 Transkriptionsaktivität 8-10, somit Pheromonproduktion in einer positiven Rückkopplung zwischen Paarungspartner zu erhöhen. Pheromone Ebenen sind von entscheidender Bedeutung verschiedener Zellpolarisationszustände zu induzieren , indem die Master - Organisator der Zellpolarität Regulierung der Rho-Familie GTPase Cdc42 11. Bei Exposition gegenüber niedrigen Konzentrationen Pheromon ist aktiv Cdc42 in dynamischen patches visualisiert der Zellperipherie Erkundung und kein Zellwachstum in diesem Stadium beobachtet werden. Erhöhte Pheromon Ebenen, um die Stabilisierung der Cdc42-Aktivität zu einer einzigen Zone und das Wachstum eines polarisierten Projektion fördern, zu bezeichnen die shmoo, die Partnerzellen in Kontakt bringt. Anschließend verschmelzen die beiden haploiden Paarungspartnern einen diploiden Zygote zu bilden. Die jüngsten Arbeiten zeigt the Existenz eines neuartigen Aktin Struktur essentiell für die Fusion, die durch die Paarung induzierten formin Fus1 12 zusammengebaut ist. Dieses Fusions Fokus konzentriert Typ-V - Myosin abhängige Prozesse und positioniert die Abbaumaschinen Zellwand, wodurch Remodellierung der Zellwand ermöglicht 12 Plasmamembran Kontakt ohne Zell - Lyse zu ermöglichen. Bei der Zell-Zell-Fusion, kommen die Kerne in Kontakt und Karyogamie unterziehen. Ein prominentes dynein abhängigen Hin- und Her - Bewegung des Kerns in der Zygote (die Pferdeschwanzbewegung) fördert dann die Paarung von Chromosom Homologe 13,14, die durch Meiose folgt. Schließlich werden die vier Produkte der Meiose in einzelne Sporen während der Sporulation verpackt. Aufgrund seiner Komplexität und der zahlreichen Schritte, die eine detaillierte Überwachung der Paarung wurde herausfordernd. Zwei bemerkenswerte Schwierigkeiten sind, dass der gesamte Prozess dauert mehr als 15 Stunden und die Zellen sind schwierig zu synchronisieren. Diese difficulties werden durch Einzelzell-Mikroskopie Ansätze umgangen. Hier ein allgemeines Protokoll der sexuellen Lebenszyklus in Spalthefe zu untersuchen, wird präsentiert. Mit kleineren Anpassungen, dieses Protokoll die Studie über die verschiedenen Schritte des Verfahrens ermöglicht, nämlich die Induktion von Paarungs Genprodukts, Zellpolarisation und Paarung zwischen Schwester-Zellen nach der Paarungstyp Schalten und zwischen Nicht-Schwester Partner, Zell-Zell-Fusion, und nach der Fusion Pferdeschwanzbewegung, Meiose und Sporulation. Dieses Verfahren ermöglicht auf 1) leicht sichtbar fluoreszent markierte Proteine ​​im Laufe der Zeit vor, während und nach der Fusion; 2) unterscheiden, die das Verhalten von Zellen des entgegengesetzten Paarungstyps; und 3) messen und zu quantifizieren Parameter wie shmooing, Paarung, Fusion oder Sporulationseffizienz.

<table><tbody><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-10KG</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.05108.0050</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71381</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12095</td><td></td></tr><tr><td>Pantothenate</td><td>AppliChem</td><td>A2088,0025</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinic Acid</td><td>AppliChem</td><td>A0963,0100</td><td></td></tr><tr><td>Inositol</td><td>AppliChem</td><td>A1716,0100</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>AppliChem</td><td>A0967,0250</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>AppliChem</td><td>A1038,0250</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>AppliChem</td><td>A3514,0250</td><td></td></tr><tr><td>Molybdenum oxide (VI) (MoO&lt;sub&gt;3)&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69850</td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td>AppliChem</td><td>A3872,0100</td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>AppliChem</td><td>A1034,0500</td><td></td></tr><tr><td>Citric Acid&amp;nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A2344,0500</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Promega</td><td>V3125</td><td></td></tr><tr><td>(NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.01217.1000</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000-100G</td><td></td></tr><tr><td>Adenine Hemisulfat Salt, mini 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9126-100G</td><td></td></tr><tr><td>Uracil&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>Lanolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7387</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Reactolab</td><td>92045-74-4</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Reactolab</td><td>7005600</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopy of fission yeast sexual lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

Fission Yeast Wachstum und Mating Dynamics nach der Entfernung einer Stickstoffquelle Als Stickstoffmangel eine Voraussetzung für die Einleitung der sexuellen Fortpflanzung in Spalthefe ist, wurde Wildtyp homothallisch H90 - Stamm bei Verschiebung von stickstoffreichen bis 1 Stickstoff entzogen Medium (Abbildung 2), nach dem Protokoll skizziert in Abbildung überwacht. Kurz gesagt, Zellen O / N wurden auf exponentiellen ...

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Mikroskopie des sexuellen Lebenszyklus von Spalthefen | Biologie | Video

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Mikroskopie von Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

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14.4K Aufrufe.  University of Lausanne. We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process. 

Serie: Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

Einzigen Molekül Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (SmFISH) Analyse in Knospen Hefe vegetativen Wachstums und Meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Forschung

Genetik

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Die Analyse der Entwicklung eines morphologischen Phänotyp als Funktion der Protein-Konzentration in Hefezellen

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Biologie

Visualizing Yeast Organelles with Fluorescent Protein Markers

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have constructed fluorescent protein-based markers for major organelles and endomembrane structures, including the nucleus, endoplasmic reticulum (ER), Golgi apparatus, endosomes, vacuoles, mitochondria, peroxisomes, lipid droplets, and autophagosomes. The protocol presented here describes the procedures for using these markers in yeast, including DNA preparation for yeast transformation, selection and evaluation of transformants, fluorescent microscopic observation, and the expected outcomes. The text is geared toward researchers who are entering the field of yeast organelle study from other backgrounds. Essential steps are covered, as well as technical notes about microscope hardware considerations and several common pitfalls. It provides a starting point for people to observe yeast subcellular entities by live-cell fluorescent microscopy. These tools and methods can be used to identify protein subcellular localization and track organelles of interest in time-lapse imaging.

Here we describe the use of a set of fluorescent protein-based organelle markers in live-cell imaging of the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae.

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a classic model system in studying organelle function and dynamics. In our previous works, we have ...

Biochemie

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and development. Cytokinesis involves a series of events that are well coordinated in time and space. Cytokinesis involves the formation of an actomyosin ring at the division site, followed by ring constriction, membrane furrow formation and extra cellular matrix remodeling. The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe (S.&#160;pombe)&#160;is a well-studied model system that has revealed with substantial clarity the initial events in cytokinesis. However, we do not understand clearly how different cytokinetic events are coordinated spatiotemporally. To determine this, one needs to analyze the different cytokinetic events in great details in both time and in space. Here we describe a microscopy approach to examine different cytokinetic events in live cells. With this approach it is possible to time different cytokinetic events and determine the time of recruitment of different proteins during cytokinesis. In addition, we describe protocols to compare protein localization, and distribution at the site of cell division. This is a basic protocol to study cytokinesis in fission yeast and can also be used for other yeasts and fungal systems.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe&#160;is an excellent model system to study cytokinesis, the final stage in cell division. Here we describe a microscopy approach to analyze different cytokinetic events in live fission yeast cells.

Räumlich-zeitliche Analyse von zytokinetischen Events in Spalthefe

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Hochauflösende Bildgebung und Analyse einzelner Astral Dynamik der Mikrotubuli in Bäckerhefe

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Untersuchung der Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics durch Fluoreszenz-Livezellmikroskopie

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ultrastructure of cells; artifacts and extraction of cell contents are usually observed. Rapid freezing is a better alternative for the preservation of cell structure. Sandwich freezing of living yeast or bacteria followed by freeze-substitution has been used for observing the exquisite natural ultrastructure of cells. Recently, sandwich freezing of glutaraldehyde-fixed cultured cells or human tissues has also been used to reveal the ultrastructure of cells and tissues. 
These studies have thus far been carried out with a handmade sandwich freezing device, and applications to studies in other laboratories have been limited. A new sandwich freezing device has recently been fabricated and is now commercially available. The present paper shows how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. Also shown is the preparation of specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing and procedures for freeze-substitution, resin embedding, trimming of blocks, cutting of ultrathin sections, recovering of sections, staining, and covering of grids with support films.

Here we show how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. We also show how to prepare specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing.

Schnelles Einfrieren mit Sandwich-Gefriergerät zur guten ultrastrukturellen Konservierung biologischer Proben in der Elektronenmikroskopie

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ...

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often not seen by imaging fixed cells. Budding yeast has proved to be an important model organism to study meiotic chromosome segregation because many meiotic genes are highly conserved. Time-lapse microscopy of meiosis in budding yeast allows the monitoring of different meiotic mutants to show how the mutation disrupts meiotic processes. However, many proteins function at multiple points in meiosis. The use of loss-of-function or meiotic null mutants can therefore disrupt an early process, blocking or disturbing the later process and making it difficult to determine the phenotypes associated with each individual role. To circumvent this challenge, this protocol describes how the proteins can be conditionally depleted from the nucleus at specific stages of meiosis while monitoring meiotic events using time-lapse microscopy. Specifically, this protocol describes how the cells are synchronized in prophase I, how the anchor away technique is used to deplete proteins from the nucleus at specific meiotic stages, and how time-lapse imaging is used to monitor meiotic chromosome segregation. As an example of the usefulness of the technique, the kinetochore protein Ctf19 was depleted from the nucleus at different time points during meiosis, and the number of chromatin masses was analyzed at the end of meiosis II. Overall, this protocol can be adapted to deplete different nuclear proteins from the nucleus while monitoring the meiotic divisions.

Use of Time-Lapse Microscopy and Stage-Specific Nuclear Depletion of Proteins to Study Meiosis in S. cerevisiae

Time-lapse microscopy is a valuable tool for studying meiosis in budding yeast. This protocol describes a method that combines cell-cycle synchronization, time-lapse microscopy, and conditional depletion of a target protein to demonstrate how to study the function of a specific protein during meiotic chromosome segregation.

Einsatz von Zeitraffer-Mikroskopie und stadienspezifischer Kerndepletion von Proteinen zur Untersuchung der Meiose bei S. cerevisiae

Time-lapse fluorescence microscopy has revolutionized the understanding of meiotic cell-cycle events by providing temporal and spatial data that is often ...

Identifizierung von Medikamenten, die die Polymerisation von bakteriellen Zytoskelettproteinen beeinflussen

Fission Yeast as a Platform for Antibacterial Drug Screens Targeting Bacterial Cytoskeleton Proteins

Bacterial cytoskeletal proteins such as FtsZ and MreB perform essential functions such as cell division and cell shape maintenance. Further, FtsZ and MreB have emerged as important targets for novel antimicrobial discovery. Several assays have been developed to identify compounds targeting nucleotide binding and polymerization of these cytoskeletal proteins, primarily focused on FtsZ. Moreover, many of the assays are either laborious or cost-intensive, and ascertaining whether these proteins are the cellular target of the drug often requires multiple methods. Finally, the toxicity of the drugs to eukaryotic cells also poses a problem. Here, we describe a single-step cell-based assay to discover novel molecules targeting bacterial cytoskeleton and minimize hits that might be potentially toxic to eukaryotic cells. Fission yeast is amenable to high-throughput screens based on microscopy, and a visual screen can easily identify any molecule that alters the polymerization of FtsZ or MreB. Our assay utilizes the standard 96-well plate and relies on the ability of the bacterial cytoskeletal proteins to polymerize in a eukaryotic cell such as the fission yeast. While the protocols described here are for fission yeast and utilize FtsZ from Staphylococcus aureus and MreB from Escherichia coli, they are easily adaptable to other bacterial cytoskeletal proteins that readily assemble into polymers in any eukaryotic expression hosts. The method described here should help facilitate further discovery of novel antimicrobials targeting bacterial cytoskeletal proteins.

Autor im Rampenlicht: Erforschung der Dynamik des Zytoskeletts zur Enthüllung neuartiger Antibiotika durch innovative zellbasierte Assays

Fission yeast is used here as a heterologous host to express bacterial cytoskeletal proteins such as FtsZ and MreB as translational fusion proteins with GFP to visualize their polymerization. Also, compounds that affect polymerization are identified by imaging using a fluorescence microscope.

Spalthefe als Plattform für antibakterielle Wirkstoffscreenings, die auf bakterielle Zytoskelettproteine abzielen

Bacterial cytoskeletal proteins such as FtsZ and MreB perform essential functions such as cell division and cell shape maintenance. Further, FtsZ and MreB ...