This work was supported by startup funds from The University of Tennessee and TN-SCORE, a multi-disciplinary research program sponsored by NSF-EPSCoR (EPS-1004083).

예제 1. 준비 <ol><li> 8 세대에 32 ° C에서 YE 액체 미디어 스핀들 극 몸 마커 SAD1-mCherry (23)와 유형 II 마이 오신 규제 경쇄 Rlc1 - 토마토 (24)을 표현 분열 효모 세포를 성장. 참고 : 온도에 민감한 돌연변이를 들어, 25 ° C에서 세포를 성장. YE 0.5의 OD 600 중반 로그 단계로 세포를 성장. 핵분열에 대한 자세한 내용은 효모의 성장 조건은 분열 효모 실험 매뉴얼 (25)을 참조하십시오. </li><li> 0.6 % 아가로 오스와 YE (또는 최소) 미디어를 준비 (아가로 오스 기반 미디어는 한천에 비해 적은 형광 배경을 표시). 용융 된 미디어에 아스 코르 빈산의 1 ㎜ (비타민 C)를 추가합니다. 비타민 C 따라서 사진 독성을 최소화, 사진 표백으로 인해 방출되는 활성 산소를 소멸. </li><li> C는 유리 바닥 배양 접시에에 미디어를 용융 레이스 비타민의 4 mL의 - 3를 따르십시오. 미디어 멋진하자 응고. 참고 :배양 접시에 유리의 두께는 현미경에 적합한 커버 슬립 두께에 따라 달라집니다. 여기에서 사용 coverslip에 제 1.5. </li><li> 부드럽게 날카로운 메스의 도움으로 배양 접시에서 응고 미디어를 올립니다. 미디어 슬래브와 접시 (그림 1)에 다시 떨어지는 슬래브를 방지하기 위해 배양 접시 사이에 피펫 팁을 배치합니다. </li><li> 위의 1.1에 설명 된대로 갓 성장하는 세포의 1 mL를 취하여. 30 초 동안 300 XG에 부드럽게 세포를 스핀. 상층 액을 버린다. 상청액을 폐기 한 후, 튜브에 남아있는 잔여 미디어 소량의 세포를 재현 탁. </li><li> 로드 2 - 미디어 슬래브 및 배양 접시의 유리 바닥 사이에 재 부유 세포 배양의 5 μL. 세포는 유리에 있어야합니다. 미디어와 요리 사이에 피펫 팁은 세포 배양 쉽게 적재 할 수 있습니다. </li><li> 아주 부드럽게 세제곱에 원래의 위치에 다시 미디어 슬래브를 피펫 팁을 제거하고 배치lture 요리입니다. 공기 방울을 방지해야합니다. 경우 부드럽게 미디어 슬라브 위에 피펫 팁의 후방으로 밀어 기포를 누르 될 필요가있다. </li><li> 세포를 현미경이 수행 될 때의 온도에서 30 분간 어둠 속에서 시간에 대한 한 배양 접시에 앉게. 세포에 대한 성장 조건의 변경이 때문에 어떤 충격을 방지하기 위해 중요하다. </li></ol> 2. 이미지 인식 <ol><li> 배양 접시에 유리의 외측에 기름 한 방울을 놓습니다. 거꾸로 현미경의 배양 접시를 놓습니다. </li><li> (- 535 내지 520)이 좁은 파장 범위의 GFP 필터를 사용 YE 매체 자동 형광을 최소화한다. </li><li> 세포의 안쪽면에 초점이 너무 붐비는 잘 간격이 아닌 것을 확인합니다. 세포주기의 적절한 단계에서 세포의 이미지 획득을 시작해야합니다. 이 실험을 위해, 후반 G2에서 세포를 따릅니다. </li><li> 화상 획득 소프트웨어 t 프로그램오 GFP, RFP 및 세포의 DIC 이미지를 가져 가라. <ol><li> 이 실험을 위해 DIC 100 밀리 노출 시간과 GFP 및 RFP 필터 75 밀리 노출 시간을 사용합니다. 노출 시간은 현미경 연구중인 단백질 및 실험 기간의 설정에 의존한다. 주어진 현미경 설정에 대해서는 50 %의 레이저 파워를 사용한다. </li><li> 3 차원 Z 스케일 이미징 프로그램 화상 획득 소프트웨어 이미지를 캡처한다. 셀의 중앙 포커스 포인트 약 0.4 ㎛의 단계 크기 및 3.0 ㎛의 (총 Z의 절반)의 거리를 사용한다. 이 6 ㎛의 총 Z 거리와 시점 당 16 Z-프레임 캡처로 연결됩니다. 참고 : Z 시리즈 이미지 수집 스핀들 극 기관의 캡처를 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 이미지마다 2 분 가져 가라. 실험의 요구에 따라, 노광 시간을 변경한다. 노출 시간은 관심 및 신호 강도의 단백질에 따라 변경 될 수있다. 그러나, 짧은주의ER 간격 또는 탈색으로 인한 긴 노출 시간 증가 광 독성이 때문에 셀은 단지 짧은 시간 동안 추적 될 수있다. </li><li> DIC 이미지에 의해 관찰 물리적으로 분리 된 세포까지 이미지를 획득, 90 분 후 획득을 정지 할 수있는 소프트웨어 프로그램. </li></ol> 3. 이미지 분석 <ol><li> cytokinetic 사건의 시간적 분석 <ol><li> 화상 획득 소프트웨어를 사용하여 각 시간 점에 대해 Z 프레임의 돌기를 만든다. 획득 된 이미지의 각 파장에 대해 서로 다른 파일을 확인합니다. </li><li> .TIFF 파일로이 투사 시간 소수점 시리즈를 보냅니다. </li><li> ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석한다. 파장 중 어느 하나의 이미지 시리즈를 연다. </li><li> 셀을 선택하는 공부합니다. 도구 모음의 줄 옵션을 더블 클릭합니다. 이 선 폭을 조정하는 또 다른 창이 열립니다. 셀의 폭에 해당하는 라인 폭을 조정한다. 50 픽셀 - WT 세포의 경우이 약 40이다. 을 따라 선을 그립니다관심있는 셀의 장축. </li><li> 분석&gt; 도구&gt; 투자 수익 (ROI) 관리자를 클릭하고 추가를 클릭합니다. 이것은 나중에 사용하기 위해 투자 수익 (ROI) 창에 선택한 행을 추가합니다. 이 창을 닫지 마십시오. </li><li> 직선화&gt; 관심있는 이미지를 클릭하고 편집&gt; 선택을 선택합니다. 이것은 또 다른 창이 열립니다. &quot;전체 스택을 처리&quot;확인합니다. 이는 가로 셀 정돈된다. </li><li> 이미지를 클릭&gt; 변형&gt; 90도 오른쪽으로 돌립니다. 이 이미지는 이제 수직으로 곧게된다. </li><li> 이미지를 클릭&gt; 스택&gt; 몽타주를 확인합니다. 이 스택에 대한 행과 열의 개수를 할당하는 창이 열리고, 화상 크기에 대한 스케일 팩터의 몽타주 처음과 마지막 조각 (프레임)와 몽타주 프레임 증가. 라벨 조각을 확인하고 Enter 키를 누릅니다. </li><li> 관심 셀의 몽타주와 윈도우가 도시 된 바와 같이, 다른 파장에 대한 화상 시리즈를 연다. </li><li> 투자 수익 (ROI) 관리자의 라인 식별자를 클릭합니다. 이 선택한다두 번째 화상 파일에 대해 동일한 셀. 3.1.8 - 반복 3.1.6 단계를 반복합니다. 이것은 두 번째 이미지의 몽타주를 엽니 다. </li><li> 스핀들 극 몸 마커 SAD1-mCherry와 이미지에, 스핀들 극 몸 마커의 분리의 발병을 찾을 시간이 0으로 그 시점을 표시합니다. </li><li> 시간이 지남에 따라 이미지에 Rlc1 - 토마토 신호에 따라 Rlc1 - 토마토의 패치는 달리 뚜렷한 선으로 표시되는 신호를 찾습니다. 이 시간-점은 액토 마이 오신 링 조립 / 성숙 단계의 시작의 완료를 표시합니다. </li><li> Rlc1 - 토마토 링의 크기가 감소하기 시작하면 시간이 지남에 따라 영화를 통해 다음 스크롤 확인합니다. 이것은 링 수축의 성숙 단계 / 시작의 끝으로 표시됩니다. </li><li> 이 셀 축의 중간에 점으로 표시 될 때까지 수축을 통해 시간에 Rlc1 - 토마토 신호를 따르십시오. 이는 격벽 ingression의 링 수축 / 끝의 끝으로 표시됩니다. </li><li> DIC 이미지의 몽타주 후, 최종 세포 결정할분리. 세포가 물리적으로 분리 할 때 시각을 기록한다. </li><li> 스핀들 기둥 체 분리 ImageJ에의 선 도구를 사용하여 시간에 따른 두 개의 스핀들 자극 체 사이의 거리를 측정한다. 시간이 지남에 따라 스핀들 극 몸에 거리를 플롯. </li><li> 다른 cytokinetic 이벤트가 각 cytokinetic 단계의 기간을 계산하고 시간이 지남에 따라 스핀들 극 신체 분리와 비교하기 위해 서로 다른 시간 포인트를 기록합니다. </li></ol></li><li> cytokinetic 이벤트 공간 분석 <ol><li> 눈에 보이는 액토 마이 오신 반지와 셀을 선택합니다. ImageJ에 도구 모음의 줄 옵션을 더블 클릭합니다. 이 선 폭을 조정하는 또 다른 창이 열립니다. (- 20 픽셀 15), 링의 두께에 대응하여 선폭을 조정한다. 반지의 전체 두께를 보장하기 위해 돌보는 링을 따라 선을 그립니다 것이 포함되어 있습니다. </li><li> 분석&gt; 도구&gt; 투자 수익 (ROI) 관리자를 클릭하고 추가를 클릭합니다. 이것은 나중에 사용하기 위해 투자 수익 (ROI) 창에 선택한 행을 추가합니다.이 창을 닫지 마십시오. </li><li> 직선화&gt; 관심있는 이미지를 클릭하고 편집&gt; 선택을 선택합니다. 이것은 또 다른 창이 열립니다. &quot;전체 스택을 처리&quot;확인합니다. 이 수평 반지를 똑 바르게됩니다. </li><li> 이미지를 사용하여 (3.1.6에서) 곧게 Z 스택의 밝은면의 강도를 재설정&gt; 조정&gt; 밝기 / 대비&gt; 재설정합니다. </li><li> 탭 STK&gt; 3D 프로젝트를 클릭합니다. 이 대화 상자가 열립니다. 밝은 포인트 투영 방법 및 2 또는 3 픽셀로 슬라이스 간격을 변경합니다. 마지막으로, X 또는 Y 축 회전의 변화 축 (이 원하는 시야각에 따라 변경됩니다), 보간 클릭하고 이미지의 3D 프로젝션을 생성하기 위해 확인을 클릭합니다. 이미지를 회전하는 이미지 아래에있는 스크롤 막대를 사용합니다. </li><li> ImageJ에를 사용하여 다른 파장의 이미지 시리즈를 엽니 다. </li><li> 투자 수익 (ROI) 관리자의 라인 식별자를 클릭합니다. 이 제 2 화상 파일의 동일한 고리를 선택할 것이다. 반복 4.2.4와 4.2.5 단계를 반복합니다.이것은 다른 파장 이미지의 3 차원 링을 엽니 다. </li><li> 열린 두 3D 이미지 링으로, 채널 병합&gt; 색상&gt; 이미지를 클릭하십시오. 이 상자가 열립니다. 원하는 해당 색상에 대한 드롭 다운 메뉴에서 각 이미지를 선택하고 확인을 클릭합니다. 이것은 서로 다른 파장의 이미지를 모두의 합성을 엽니 다. </li><li> cytokinetic 링에서 현지화에 관해서 또는 ingressing 막 서로 다른 마커의 현지화를 비교. Rlc1-GFP는 cytokinetic 링 마커입니다. 단백질은 ingressing 막에 지역화 Rlc1-GFP 신호 뒤에 현지화하는 동안 단백질은 공동 현지화 Rlc1-GFP로하면 링에 지역화. 주 : 관심 단백질 링 마커의 상이한 형광 물질로 할 필요가있다. </li><li> 모든 세포질 분열을 통해 단백질의 공간 지역화 비교 세포질 분열의 다른 단계 동안 3 차원 고리를 생성한다. </li></ol></li><li> 단백질 DISTRI 분석cytokinetic 링에서 bution <ol><li> 링 단백질 분포의 분산의 공동 효율을 측정 따라 비교해 단백질의 분포를 분석한다. 높은 CO 효율적인 분산은 분할 부위에 따라서 단백질의 불균일 한 분포를 나타내고 상이 결상되고 분석에 따라, 부적절한 링 조립체 성숙 또는 격벽의 형성을 제안한다. </li><li> (3.2.2)에서 3 차원 재구성 cytokinetic 링을 사용하여 링의 4 분의 각 사분면에 표시되도록 적어도 4 사분면으로 이미지를 나눕니다. 이를 위해 이미지에 수직으로 선을 그립니다 줄 도구를 사용합니다. 각 라인 이미지를 클릭 한 후&gt; 오버레이&gt; 선택을 추가 지름길 Ctrl 키 +의 B를 사용합니다. </li><li> &gt; 설정 측정 분석로 이동합니다. 열린 상자에 평균 회색 값을 선택합니다. 확인을 클릭합니다. </li><li> 가이드 직사각형 직사각형 도구를 사용하여 각각의 사분면을 정의하는 그릴 위에 그려진 선을 사용. </li><li> 각 사분면 클릭의 평균 강도를 측정하기 위해,분석에&gt; 측정하거나 바로 가기 Ctrl 키 + M을 사용합니다. </li><li> 네 개의 사분면에 대한 평균 회색 값 (MG 1 -mg 4)를 기록한다. </li><li> 배경 선택과 같은 링 밖에서 각 사분면에있는 작은 영역을 선택합니다. </li><li> 네 사분면의 배경 선택을위한 평균 회색 값 (BG 1 -bg 4)을 측정한다. </li><li> 각 사분면 (IRQ)에서 = 링의 강도 다음 공식에 MG 1 - 평균 (BG 4 BG 1) 다음 각 사분면을위한 배경 공제 리&gt;. 이 단계에서 4 IRQ 값, 각 사분면에 대해 하나가 있습니다. </li><li> / 평균 (IRQ 1 : IRQ 4) : 다음 다음 제형 표준 편차를 사용하여 각 반지 (IRQ 4 IRQ 1) 분산의 계수를 계산한다. 각 변형에 대한 분산의 평균 공동 효율을 계산하고 다른 균주에 비교합니다. 주 : 제어 IND 비교 균주 분산 공동 효율적인 통계적으로 유의 한 증가세포질 분열의 단계에서 분할 사이트를 따라 고르지 단백질 배포 / 전달을 icates. </li></ol></li></ol>

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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+light-sheet+microscopy:+imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution.">Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998 (2014).</li><li>Huang, Y. S., Karashima, T., Yamamoto, M., Hamaguchi, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular-level+investigation+of+the+structure,+transformation,+and+bioactivity+of+single+living+fission+yeast+cells+by+time-+and+space-resolved+Raman+spectroscopy.">Molecular-level investigation of the structure, transformation, and bioactivity of single living fission yeast cells by time- and space-resolved Raman spectroscopy.</a> Biochemistry. 44 (30), 10009-10019 (2005).</li><li>Huang, C. K., Ando, M., Hamaguchi, H. O., Shigeto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disentangling+dynamic+changes+of+multiple+cellular+components+during+the+yeast+cell+cycle+by+in+vivo+multivariate+Raman+imaging.">Disentangling dynamic changes of multiple cellular components during the yeast cell cycle by in vivo multivariate Raman imaging.</a> Anal Chem. 84 (13), 5661-5668 (2012).</li><li>Le Goff, X., Woollard, A., Simanis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+cps1+gene+provides+evidence+for+a+septation+checkpoint+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Analysis of the cps1 gene provides evidence for a septation checkpoint in Schizosaccharomyces pombe.</a> Mol Gen Genet. 262 (1), 163-172 (1999).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언합니다.

여기서 우리는 시간적인 방식으로 분열 효모에서 cytokinetic 이벤트를 연구하기 위해 프로토콜을 설명했다. 여기에 설명 된 프로토콜은 서로 다른 참조 cytokinetic 이벤트의 시간 해상도를 제공한다; 단백질 모집 또는 cytokinetic 위상을 참조하여 손실의 타이밍; 세포질 분열의 여러 단계에 걸쳐 반지의 구조; 유사 분열을 참조하여 세포질 분열의 진행. 이 프로토콜로 정확히 cytokinetic하여 다른 단계에 ?...

세포질 분열, 세포 분열의 마지막 단계는 유기체의 적절한 분화, 발달과 생존에 대한 복소 공정 필수적이다. 세포질 분열는 게놈 무결성 1을 유지하면서 성공적인 세포 분리를 보장하기 위해 조직 된 여러 이벤트를 포함한다. 세포질 분열 한번 조립 액토 마이 오신 링 마침내 세포 이탈 1, 2, 3,이어서 막 팽창 furrowing 및 세포 외 기질 재 형성, 동시 인 수축을 거쳐 이벤트를 포함한다. cytokinetic 이벤트 부적절한 조직 세포 분리 및 배수성 결함으로 이어질 수 있으며, 암 4, 5, 6, 7, 8과 같은 질환을 유발할 수있다. 활성화 기본 원리 오cytokinetic 이벤트 rganization 잘 따라서 이러한 질병의 원인에 대한 우리의 이해에 장애물로 이어지는 이해되지 않습니다. 분열 효모, 분열의 pombe (S.의 pombe)이 때문에 1 관련 단백질의 보존 된 자연 세포질 분열을 연구하는 훌륭한 모델 시스템입니다. 분열 효모에서, 링 어셈블리를 액토 마이 오신 후, 링은 9 수축하지 않는 성숙 / 드웰 단계로 들어갑니다. 성숙은 막 furrowing 및 격벽 ingression와 동시 액토 마이 오신 링 수축의 시작과 끝납니다. 지난 몇 년 동안 독창적 인 작품은 분열 효모 1, 9, 10, 우리에게 액토 마이 오신 링 어셈블리의 상당히 좋은 이해를 주었다. 분열 효모 등 일부 진핵 생물에서의 액토 마이 오신 링을 성공적으로 조립 막 furrowing 충분하지 않습니다. F에서ission 효모는, 링 수축 혼자 고랑 형성 (11) 내부 팽압을 극복하기에 충분한 힘을 제공하지 않습니다. 최근 모델이 힘 대신 격벽 ingression (11)에 의해 제공되는 것을 나타냅니다. 다른 모델에있어서, 세포막 연장 부의 역할을 형성 (12, 13)를 밭고랑에 기여 제안되었다. 반지의 수축과 막 furrowing는 Bgs1 / CPS1 온도에 민감한 돌연변이 cps1-191, 주 격벽 형성 (14), (15)의 주요 효소 발생하지 않습니다. Bgs1 부족한 세포에 결함이 주 격벽 및 연장 링 수축 (15, 16)을 보여줍니다. Bgs1은 링 어셈블리 (17), (18) 액토 마이 오신 후 성숙 중에 격벽 ingression 대한 세포 분열 사이트에 채용된다. SimilarlY는 초파리 배아에서 cellularization 동안, 링 수축은 분열 효모에서 관찰 된 성숙 단계를 닮은 상당히 느린 초기 수축 속도 (19)과 이상성입니다. 바이 페이 링 수축이 충분 막 확장 (20)과 세포 외 기질의 수정을 허용하는 막 furrowing 느려질 수 있습니다. 이것은 링 조립체 액토 마이 오신 후에, 링이 수축 셀 고랑 형성을위한 요구 사항을 만족할 효율적 때만 발생하는 것을 의미한다. 잘 액토 마이 오신 링 링 조립 한 후 수축 없으며,이 과정을 조절하는 분자 이벤트에 필요한 어떤 조건 이해되지 않습니다. 우리는 최근 액토 마이 오신 링을 다음을 조립 소는 GTPase Cdc42 고유 시공간 활성화 패턴 (21)을 겪는 것으로 나타났습니다. 이 패턴은 Cdc42 구아니딘 뉴클레오타이드 교환 인자의 고유 파악 패턴 (기준 확립Cdc42을 활성화 GEFs). 지구 환경 기금 (GEF) Gef1는 조립 액토 마이 오신 링에 지역화 및 Scd1가 furrowing 막에 지역화 정상 격벽 형성을 촉진하면서, 링 수축 및 격벽 ingression의 발병을 촉진한다. 우리는 그 GEFs에 의해 설립 된 Cdc42 활성화 패턴이 독특한 cytokinetic 이벤트의 규제로 이어질 것을 찾을 수 있습니다. 결국 액토 마이 오신 링 조립체 다음 세포 분리가 발생할 이벤트의 분자 메커니즘을 이해하기 위해, 하나의 시간과 공간의 고유 cytokinetic 이벤트를 수행 할 필요가있다. 분열 효모에서 세포질 분열 먼저 결국 유형 II 미오신의 formin Cdc12 및 액토 마이 오신 링 조립에 필요한 다른 단백질을 모집 핵 주위 전구체 노드의 어셈블리를 포함한다. 시간으로 구별 cytokinetic 이벤트 및 참조 프레임을 제공는 스핀들 극 몸 마커 (스핀들 형성)의 분리는 시간 0 (22)로 간주됩니다. 일의 조립전자 액토 마이 오신 링은 형광 태그 액토 마이 오신 링 단백질의 강도와 같은 타입 II 규제 미오신 경쇄 Rlc1 시간이 지남에 모니터링 하였다 될 수있다. 여기에서 우리는 시간이 지남에 따라 세포질 분열의 다른 단계를 분석하는 미시적 접근 방법을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Yeast extract media</td>
			<td>Sunrise Science Products</td>
			<td>YES 225</td>
			<td>0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>SeaKem LE agarose, Lonza</td>
			<td>50001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottomed culture dish</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td>Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system</td>
			<td>Visitech International, UK</td>
			<td></td>
			<td>with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatiotemporal analysis of cytokinetic events in fission yeast

세포질 분열, 세포 분열의 마지막 단계는 게놈 무결성을 유지하기 위해 중요합니다. 적절한 세포질 분열은 세포 분화 및 개발을위한 중요합니다. 세포질 분열이 아니라 시간과 공간에서 조정되는 일련의 사건을 포함한다. 세포질 분열 링 수축 멤브레인 고랑 형성 및 세포 외 기질 재 형성 하였다 분할 부위에서 액토 마이 오신 고리의 형성을 포함한다. 분열 효모,, 분열의 pombe (S.의 pombe)는 상당한 명확성과 세포질 분열의 초기 이벤트를 공개했다 잘 공부 모델 시스템입니다. 그러나, 우리는 cytokinetic 이벤트가 시공간으로 조정된다 명확 얼마나 다른지 이해하지 않습니다. 이를 확인하기 위해, 하나는 모두 시간과 공간에 훌륭한 세부에있는 다른 cytokinetic 이벤트를 분석 할 필요가있다. 여기에서 우리는 다른 cytokinetic EV를 조사하기 위해 현미경 접근 방식을 설명살아있는 세포에서 행군. 이 방법으로 다른 cytokinetic 이벤트 시간과 세포질 분열 동안 다른 단백질을 채용하는 시간을 결정하는 것이 가능하다. 또한, 우리는 세포 분열의 부위에서 단백질 지역화 및 분포를 비교하는 프로토콜을 기술한다. 이 분열 효모 세포질 분열을 연구하는 기본 프로토콜 및 다른 효모 및 곰팡이 시스템에 사용될 수있다.

링 마커를 발현하는 분열 효모 세포는 Rlc1-GFP (녹색, 그림 2)와 스핀들 극 몸 마커 SAD1-mCherry (빨강, 그림 2) 세포질 분열하는 동안 몇 군데 있었다. 스핀들 극 몸 마커의 발병 (빨간색 화살표 2A, 2B 피규어) 0 Rlc1-GFP 신호가 극 몸의 분리를 스핀들 참조하여 시간 -4 분에 나타납니다 시간으로 간주된다 (흰색 화살표, B, 2A 피규어). Rlc1-GFP 신호...

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Spatiotemporal Analysis of Cytokinetic Events in Fission Yeast

분열 효모는, 분열의 pombe는 세포질 분열을 연구하는 훌륭한 모델 시스템, 세포 분열의 마지막 단계입니다. 여기에서 우리는 라이브 분열 효모 세포에서 다른 cytokinetic 이벤트를 분석하기 위해 현미경 방법을 설명합니다.

분열 효모의 Cytokinetic 이벤트의 시공간 분석

Cytokinesis, the final step in cell division is critical for maintaining genome integrity. Proper cytokinesis is important for cell differentiation and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

7.3K 조회수.  University of Tennessee.  분열 효모는, 분열의 pombe는 세포질 분열을 연구하는 훌륭한 모델 시스템, 세포 분열의 마지막 단계입니다. 여기에서 우리는 라이브 분열 효모 세포에서 다른 cytokinetic 이벤트를 분석하기 위해 현미경 방법을 설명합니다. 

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Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

버딩 효모에 Replicative 수명 측정

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

연구

생물학

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

버딩 효모에서 단백질 농도의 함수로 형태학의 표현형의 발전 분석

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

분열 효모의 양적 라이브 세포 형광 - 현미경 분석

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

초기 자식 작용 이벤트의 셀 이미징 라이브 : Omegasomes을 넘어

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, and membrane potential. All of these approaches depend on measurement of activity at one or multiple locations along the gut simultaneously which are then interpreted to provide a sense of overall motility patterns. Recently, the development of video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques have made it possible to observe and analyze complex patterns in ex vivo whole segments of colon and intestine. Once recorded and digitized, video records can be converted to STmaps in which the luminal diameter is converted to grayscale or color [called diameter maps (Dmaps)]. STmaps can provide data on motility direction (i.e., stationary, peristaltic, antiperistaltic), velocity, duration, frequency and strength of contractile motility patterns. Advantages of this approach include: analysis of interaction or simultaneous development of different motility patterns in different regions of the same segment, visualization of motility pattern changes over time, and analysis of how activity in one region influences activity in another region. Video recordings can be replayed with different timescales and analysis parameters so that separate STmaps and motility patterns can be analyzed in more detail. This protocol specifically details the effects of intraluminal fluid distension and intraluminal stimuli that affect motility generation. The use of luminal receptor agonists and antagonists provides mechanistic information on how specific patterns are initiated and how one pattern can be converted into another pattern. The technique is limited by the ability to only measure motility that causes changes in luminal diameter, without providing data on intraluminal pressure changes or muscle tension, and by the generation of artifacts based upon experimental setup; although, analysis methods can account for these issues. When compared to previous techniques the video recording and STmap approach provides a more comprehensive understanding of gastrointestinal motility.

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Recently available video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques make it possible to visualize and quantify both propagating and mixing patterns of intestinal motility. The goal of this protocol is to explain the generation and analysis of STmaps using the GastroIntestinal Motility Monitoring (GIMM) system.

운동성의 시공간 매핑<em&gt; 전의 VIVO</em내장의&gt; 준비

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

분열 효모 성적 라이프 사이클의 현미경

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

고해상도 이미징 및 개인 별이 미세 소관 역학의 분석 신진 효모에서

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

효모의 4D 현미경 검사법

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

형광 라이브 세포 현미경 검사법에 의한 미토틱 및 Meiotic 핵분열 효모 핵 역학의 검사

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...