Name: production of human norovirus protruding domains in e. coli for x-ray crystallography
Uploaded: 2016-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography at JoVE.com

The funding for this study was provided by the CHS foundation. We acknowledge the protein crystallization platform within the excellence cluster CellNetworks of the University of Heidelberg for crystal screening and the European Synchrotron Radiation Facility for provision of synchrotron radiation facilities.

1. P 도메인 복제 <ol><li> 노로 바이러스 균주의 서열 정렬하여 P 도메인 코딩 영역을 결정합니다 (예를 들어, GII.10 변형, GenBank 등록 : AF504671, PDB-ID : 3ONU) 6. 또한, P 영역 (도 2a)의 C 말단에있는가요 성 영역을 제거한다. E.위한 DNA를 코돈 - 최적화 대장균 발현 및 BamHI에 서브 클론을 위해 (터미널 N) 및 NotI을 (C 터미널) 제한 다음 사이트 pMalc2x 발현 벡터 6,7로 영역을 코딩 P 도메인을 포함한다. 참고 : P 도메인 코딩 영역은 최적화 된 상용 서비스에 의해 합성된다. 지역 (삽입)를 코딩 P 도메인은 약 1 길이 킬로바이트 및 표준 전송 벡터에서 제공합니다. </li><li> 각각의 1 μL를 BamHI (20,000 U / ㎖)을 NotI (10,000 U / ml)로 제한 제조업체 버퍼를 공급하여 37 ℃에서 1 시간 동안 효소로 전사 벡터의 2 μg의 다이제스트. </li><li> 1 % 아가로 오스 겔에서 분해 삽입 별개135 V에서 20 분 동안 시판 키트를 사용하여 겔로부터 삽입 DNA를 정제. </li><li> 각 1 μL를 BamHI (20,000 U / ㎖)을 NotI (10,000 U / ml)에 제한은 37 ° C에서 1 시간 동안 효소로이 벡터의 2 μg의 소화하여 pMalc2x 발현 벡터를 준비한다. (1.3) 상술 한 바와 같이, 아가 로스 젤에서 벡터를 정제. 참고 : 두 샘플 (1.2 및 1.4)는 -20 ° C에서 저장 될 수있다. </li><li> 실온 (RT) (그림 2B와 2C)에서 15 분 1 μL T4-DNA 리가 아제 (40 U / ㎖)와 BamHI 및 NotI에 제한 부위에서 절단 pMalc2x 벡터로 정제 인서트를 결찰. 삽입 비율 1 : 3 (분자량)를 pMalc2x 벡터와 벡터의 적어도 20 NG를 사용한다. 결찰 혼합물은 일반적으로 20 ~ μL이다. </li><li> 50 μL 화학적 관할 E.로 결찰 믹스 2㎕의 변형 대장균 DH5α 표준 변환 프로토콜 (얼음에서 10 분, 열 쇼크 42 ° C에서 45 초)을 이용하여 박테리아 세포 성장이 60037 ° C에서 1 시간 동안 ㎕의 SOC 배지. 원심 분리기는 형질 전환 된 세포는 1,000 XG에 3 분 동안, 상층 액을 제거하고, SOC 매체의 30 μL에 펠렛을 재현 탁. <ol><li> 선택에 100 ㎍ / ml 암피실린, LB 한천 플레이트 상 변환 혼합 플레이트, 37 ℃에서 하룻밤 동안 성장한다. 적어도 다섯 식민지를 선택합니다. </li></ol></li><li> 다섯 식민지의 각각에 대해, 50 μg의 / ㎖ 앰피 실린 (LB-A)로 보충 LB-매체의 2-3 ml의 문화를 접종하고 37 ℃에서 160 rpm으로 밤새 진탕 성장한다. </li><li> 상용 키트를 사용하여 야간 문화 플라스미드의 압축을 풉니 다. pMalc2x 정방향 프라이머 (5&#39;-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 &#39;)와 염기 서열에 의한 P 도메인 삽입의 존재를 확인하고 프라이머 역 (5&#39;-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3&#39;). </li></ol> 2. P 도메인 표현 <ol><li> MBP-그의-P 도메인에 대한 pMalc2x 벡터 코딩 - (400 NG / μL 150 NG / μL) 1 μl를 변환관할 E.의 50 μL에 융합 단백질 표준 변환 프로토콜 (얼음에서 10 분, 열 쇼크 42 ° C에서 45 초)을 이용하여 대장균 BL21 세포는 37 ° C에서 1 시간, 600 μL의 SOC 배지에서 자란다. 밤새 160 rpm으로 37 ° C에서 LB-A의 120 ml의에 하위 문화. </li><li> 차 배양 (100 일)와 LB-A의 (1.5 L 매체 각각 예를 들어, 6 × 5 L 플라스크) 구리터을 접종한다. 0.6 - 외경 (600)가 0.4에 도달 할 때까지 160 rpm으로 37 ° C에서 진탕 세포 성장. 그 후, ~ 1 시간 동안 22 ° C까지 온도를 낮추고 다음 이소 프로필 β-D-D- 티오 갈 락토 피 라노 시드의 0.66 밀리미터 (IPTG) 8 단백질 발현을 유도. 하룻밤 22 ° C (~ 18 시간)에서 세포를 성장. 온도는 다양 할 수 있지만, 우리는 22 ° C 이하를 사용하는 것이 좋습니다 있습니다. </li><li> 원심 분리 (10,543 XG, 15 분, 4 ° C)에 세​​포를 수확. 뜨는을 취소하고 -20 ° C에서 세포 펠렛을 동결. </li></ol>1 차 정제 단계 및 프로테아제 절단 <ol><li> 실험의 재현성 및 안정성을 보장하기 위해 재고 솔루션에서 단백질 정제 단계 동안 사용되는 버퍼를 준비합니다. 고정 된 금속 이온 친 화성 크로마토 그래피에 대 한 4 개의 서로 다른 버퍼 (IMAC), 이미 다졸의 다른 농도를 포함하는 각 (10 밀리미터, 20 밀리미터, 50 밀리미터, 250 밀리미터)를 준비합니다. SEC에 대해보다 높은 염 농도와 겔 여과 완충액 (GFB)을 제조하지만, 이미 다졸없이. 탈 이온수를 사용하여 0.45 ㎛의 공극 크기를 사용하기 전에 모든 버퍼를 필터링. 참고 : 자세한 버퍼 준비 방식은 표 1을 참조하십시오. </li><li> 아홉 리터의 문화에서 세포 펠렛을 해동하고 4 ° C에서 150 ml의 PBS에 용해. 세포를 파괴하는 세포 현탁액을 2 분 (파워 130 W, 20 %의 진폭, 펄스 주파수 50 %) 3 회 초음파 처리. 초음파 동안 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다. </li><li> CentrifuGE는 초음파 세포 현탁액 (43,667 × g으로 30 분, 39 ° C에서)이 발현 된 단백질을 함유하는 상청액으로부터 세포 찌꺼기를 분리한다. 상층 액을 수집하고 펠렛을 폐기합니다. </li><li> 세척 및 니켈 (Ni) 크로마토 그래피 컬럼에서 10 mM의 이미 다졸 버퍼 -NTA 아가 로스 비드 10 ㎖ (= 1 열 볼륨 [CV]) 슬러리를 평형. 단계 3.3에서 뜨는로 평형 니켈 구슬을 추가 MBP-그의-P 도메인 융합 단백질을 발현 느린 회전 4 ° C에서 30 분 동안 품어 함유. </li><li> 배양 후, 크로마토 그래피 컬럼에 전체 니켈 비드 단백질 혼합물을 적용합니다. 10 밀리미터, 20 밀리미터, 10 밀리미터, 다음 20 mM의 마지막 50 밀리미터 (그림 3A)로 시작하는 50 mM의 이미 다졸 버퍼, 각각 5 이력서와 함께 천천히 열을 씻으십시오. </li><li> 250 mM의 이미 다졸 완충액 (도 3a)을 사용하여 MBP-그의-P 도메인 융합 단백질을 용출시켰다. 용출 동안에, 융합 단백질의 용출 (OD (28)의 증가를 확인 OD를 280 ㎚를 점검를 0㎚). 외경의 280 ㎚가 ~ 0.1에 떨어질 때까지 용출을 계속합니다. 10 mM의 이미 다졸 버퍼의 적어도 10 약력이어서 250 mM의 이미 다졸 완충액 (적어도 10 CV들) 과량으로 비드를 세척 하였다. 두 번째 정제 단계 (섹션 4)의 구슬을 저장합니다. </li><li> 12 % SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 (10 × 8cm) (9) (도 3A)을 이용하여 SDS-PAGE로 MBP-그의-P 도메인 융합 단백질의 존재를 확인한다. 45에서 겔 전기 영동을 수행하고 45 분 동안 200 V. </li><li> ~ 3 mg / ml의 최종 농도로 (상업적 농축기를 사용하여, 예) 용출 MBP-그의-P 도메인 융합 단백질을 농축시킨다. (~ 1 : 100)을 10 mm의 2 L에 대해 투석하는 동안 이미 다졸 버퍼를 HRV-3C 프로테아제와 MBP-그의-P 도메인 융합을 절단 밤새 4 ° C (도 3A)에서. 농축 된 단백질의 최종 부피에 따라 투석 카세트 또는 투석 튜브로 투석을 수행한다. 주 : 단백질 HRV-3C 단백질 분해 효소의 양은분열은 특정 프로테아제 활성에 따라 계산되고, 발현 량에 변화하고, SDS-PAGE의 결과로부터 추정 될 수 용출 된 융합 단백질의 양 (3.7 (2 U / ㎕의 1 U 100 단백질 μg의을 절단하기에 충분하다) ). </li></ol> 4. 2 차 정화 단계 <ol><li> 10 mM의 이미 다졸 버퍼의 단계 3.6에서 니켈 구슬 평형. </li><li> 느린 회전으로 ​​39 ° C에서 30 분 동안 평형화 니켈 비드 (4.1)와 (P 절단 도메인 MBP 단백질 및 HRV 프로테아제 함유)을 단계 3.7에서 투석 된 단백질을 부화. </li><li> 컬럼에 니켈 비드 혼합물을 적용하고 흐름을 통해 (절단 P 도메인) (그림 3B)를 수집합니다. 외경의 280 ㎚가 ~ 0.1에 도달 할 때까지 열을 벗기으로 단백질 농도를 측정한다. 참고 : MBP-그분은 니켈 구슬 (그림 3B)에 결합 된 상태로 유지해야합니다. </li><li> 1과 함께 SDS-PAGE를 이용하여 절단 된 P 영역의 존재를 확인2 % 겔은 다음과 같이 (도 3b) 상술. ~ 3 ㎎ / ㎖로 용출 P 도메인을 집중 이후 SEC의 정제 GFB에 대한 4 ° C에서 하룻밤 투석. </li></ol> 제 3 차 정제 단계 <ol><li> 세척 펌프 및 HPLC 정화 시스템의 파이프 및 사전 평형 증권 거래위원회 (SEC) 열을 GFB와 (자료 목록 참조). </li><li> 농축 된 시료의 양에 따라, 1 ㎖ (3 ㎖까지)을 superloop (최대 12 ㎖) 또는 루프를 사용 / 분의 유속으로 컬럼에 P 도메인을 주입한다. 분사가 완료되면 / 분으로 2.5 ml의 유량을 증가시킨다. </li><li> 외경이 증가하고, P 도메인 열 벗기 같이, 1.5 ㎖로 분획을 수집한다. 12 % 겔 SDS-PAGE를 이용하여 분획을 확인 (도 4a 및도 4b). 수영장 만 순수한 분수와 ~ 3 ㎎ / ㎖하고 ~ 8 ㎎ / ㎖에 집중한다. 참고 : 110 ~ 후 ㎖ (공극 부피) 대부분의 불순물이 320 ml의 침대 볼륨과 SEC 컬럼에서 용출됩니다. 그만큼P 도메인은 일반적으로 이량 체로서 용출된다. 는 P 도메인 이량 체의 용출 시간 / 볼륨은 SEC 컬럼의 사전 등급 (PG)에 따라 달라집니다. </li></ol> 는 P 도메인 6. 결정화 <ol><li> 초기 결정화 스크리닝 ~ 3 ㎎ / ㎖, 8 ㎎ / ㎖에서 P 도메인을 사용합니다. 384 시중에서 판매하는 선별 조건을 초기 화면에 대한 농도 별 P 도메인의 최소 100 μl를 준비합니다. 리저버 어머니 용액 100 ㎕를 포함하는 96 웰 플레이트 형식에서 18 ° C에서 스크리닝을 수행하고 드롭 0.2 μL 머더 용액 0.2 μL 단백질로 구성된다. </li><li> 반복 성공적으로 결정화 조건을 최적화 할 수 있습니다. 따라서, 3 행을 포함 15 웰 플레이트를 사용합니다. 100 % 어머니 솔루션, 90 %의 어머니 용액과 10 %의 물과 80 %의 어머니 용액과 20 %의 물과 세 번째 행과 두 번째 행과 첫 번째 행을 설정합니다. 2 μL (1 μL 단백질 + 1 μl의 어머니 용액) 500의 방울 크기를 사용하여81, 저수지 볼륨으로 어머니 솔루션의 리터. </li><li> 공 결정화 리간드와 P 도메인에 최적화 된 결정 조건을 사용합니다. 6.2에 설명 된대로 판을 준비합니다. 대신에 2 ㎕의 방울 크기, 1 μL 모 용액 1 ㎕의 단백질 및 1 ㎎ / ㎖ 농도의 리간드 1 μl를 함유 방울을 설정. </li><li> 싱크로트론 방사선을 이용한 단결정의 데이터 세트를 수집한다. 초기 탐색 모델 6,10-13 같은 높은 서열 유사성과 출판 P 도메인 구조를 이용하여 분자량 교환을 수행한다. 참고 : 리간드의 존재는 전자 밀도의 취소 모델링 덩어리로 표시됩니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

여기, 우리는 높은 품질과 수량에서 노로 바이러스의 P 도메인의 발현 및 정제를위한 프로토콜을 설명합니다. Noroviruses 잘 연구되지 ​​않고 구조적 데이터가 지속적으로 필요하다. 우리의 지식에, 다른 프로토콜 (예를 들면, GST 태그가 P 영역)을 이용하여 P 영역 생성은 지금까지 문제가되고 있으며, 노로 바이러스 호스트 상호 작용에 충분한 구조적 데이터가 누락되어있다. 방법은 여기에...

인간의 noroviruses는 급성 위장염 전 세계적으로 하나의 주요 원인이다. 이 바이러스는 노로 바이러스, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus 및 Nebovirus 포함 적어도 다섯 장군이가있는의 Caliciviridae 제품군에 속한다. 의료 시스템과 다양한 유통에 높은 영향에도 불구하고, 인간의 noroviruses의 연구는 강력한 세포 배양 시스템의 부족에 의해 방해된다. 현재까지 사용 가능한 승인 된 백신이나 항 바이러스 전략이 없다. 노로 바이러스의 주요 캡시드 단백질, VP1이 되나, 쉘 (S) 영역 및 돌출부 (P)이 영역들로 분할 될 수있다. P 개의 도메인이가요 성 힌지 (H) 영역으로 S 도메인에 접속된다. P 개의 영역은 바이러스 캡시드의 최 외측 부분을 형성하는 반면, S 도메인은 바이러스 RNA의 주위에 지지체를 형성한다. 박테리아에서 발현 될 때 P 도메인은 생물학적으로 중요한 이합체로 어셈블. 는 P d를IMER은 탄수화물 구조와 상호 작용, 타액에 용해 항원으로 존재하는 특정 숙주 세포 3에서 볼 수 있습니다 히스 - 혈액형 항원 (HBGAs를)라고. 는 P 도메인 HBGA의 상호 작용은 감염 4 중요한 것으로 생각된다. 사실, 최근의 보고서는 합성 HBGAs 또는 시험 관내 5 인간의 노로 바이러스 감염 박테리아를 HBGA가 발현의 중요성을 밝혔다. noroviruses의 숙주 세포 부착에 관한 현재의 연구는 주로 곤충 세포 혹은 대장균 (대장균)에서 발현 된 재조합 P 도메인으로 표현 될 수있는 바이러스 입자 (VLP를)로 수행된다. 원 해상도의 P HBGA 도메인 상호 작용을 이해하기 위해, P-도메인 HBGA 복잡한 구조는 X 선 결정학을 이용하여 해결 될 수있다. 여기서, 우리는 높은 수량과 품질 P 도메인의 생산은 X 선 crystall 용으로 사용될 수 있도록 P 도메인 발현 및 정제를위한 프로토콜을 기술ography. 또한,이 방법은 다른 calicivirus의 P 영역과 비 구조 단백질에 적용 할 수있다. P 개의 도메인 E. 대한 코돈 최적화 대장균 발현과 표준 전송 벡터에 클로닝. P 개의 도메인이어서 폴리 히스티딘 (그의) 태그 및 프로테아제 절단 부위 다음된다 만노오스 결합 단백질 (MBP)를 코딩하는 발현 벡터로 재 클로닝된다. MBP-그의-P 도메인 융합 단백질로 표현 E. 대장균은 세 정제 단계 하였다. MBP-그의-P 도메인 융합 단백질은 고정화 된 금속 이온 친 화성 크로마토 그래피 (IMAC)를 이용하여 정제한다. 다음에, 융합 단백질은 인간 리노 바이러스 (HRV) -3C 프로테아제 및 P 영역이 분리되어로 절단된다 MBP-그의 부가 IMAC 정제 단계에 의해. 마지막으로, P 도메인은 크기 배제 크로마토 그래피 (SEC)를 이용하여 정제한다. 정제 된 P 영역은 X 선 결정학에 사용될 수있다. 단백질 결정화 조건의 스크리닝 PERFO 인다른 P 도메인 단백질 농도를 사용하여 시판의 스크리닝 키트 rmed. 결정 성장이 관찰되고, 가장 유망한 조건이 최적화된다. 방법은 여기에 설명과 함께, 그것은 미만 사주 내에서 구조화 단백질 유전자에서 갈 수 있습니다. 따라서, P 도메인의 발현, 정제, 결정화의 우리의 방법은 분자 수준에서 노로 바이러스 - 호스트 상호 작용을 연구하고 최신 백신 디자인 및 약물 검사를 지원하기 위해 중요한 데이터를 제공하기에 적합하다.

<table><tbody><tr><td>P domain DNA</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>GeneArt Gene Synthesis</td></tr><tr><td>pMalc2x&amp;nbsp; vector</td><td>On request</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136L</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. Medium</td><td>Life Technologies</td><td>15544-034</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Column Chromatography Column</td><td>Bio-Rad</td><td>7372512</td><td>2.5 x 10 cm, possible to use other size</td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20</td><td>GE Healthcare</td><td>various</td><td>cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used</td></tr><tr><td>Subcloning Efficiency DH5&amp;alpha; Competent Cells</td><td>Life Technologies</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>One Shot BL21(DE3) Chemically Competent &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Life Technologies</td><td>C6000-03</td><td></td></tr><tr><td>HRV 3C Protease</td><td>Merck Millipore</td><td>71493</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 26/600 Superdex 75 PG</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9893-34</td><td>SEC column</td></tr><tr><td>JCSG Core suites</td><td>Qiagen</td><td>various</td><td>4 screens with each 96 wells</td></tr><tr><td>Carbohydrates</td><td>Dextra Laboratories, UK</td><td>various</td><td>Blood group products</td></tr></tbody></table>

production of human norovirus protruding domains in e. coli for x-ray crystallography

노로 바이러스의 캡시드는 하나의 주요 구조 단백질로 구성되어, VP1 불린다. VP1은 쉘 (S) 영역 및 돌출부 (P) 영역으로 나누어진다. 의 S 도메인은 P 도메인 형태의 S 도메인에 바이러스 성 스파이크 반면, 바이러스 성 RNA 주위에 연속 골격을 형성하고 항원 및 호스트 세포의 상호 작용에 대한 결정을 포함한다. 는 P 영역, 즉., 생각된다 히스 - 혈액형 항원이, 노로 바이러스 감염에 대한 중요한 것으로, 탄수화물 구조를 결합한다. 이러한 프로토콜에서는, 고 수율 고품질 노로 바이러스의 P 영역의 제조 방법을 설명한다. 이러한 단백질은 항원 후 호스트 세포 상호 작용을 연구하기 위해 X 선 결정학 및 ELISA에 사용될 수있다. P 개의 도메인 우선 발현 벡터에 클로닝 한 다음 박테리아에서 발현된다. 단백질은 금속 이온 친 화성 크로마토 그래피 및 크기 배제 크로마토 그래피를 고정화 것을 포함 세 단계를 사용하여 정제한다. 에서원칙적으로, 명시 클론 정제,이 프로토콜 신흥 노로 바이러스 균주 분석을위한 신속하게 시스템 개 미만 주 단백질을 결정화 할 수있다.

기술 된 프로토콜의 개략도가도 2. 프로토콜은 표적 유전자의 클로닝, 발현, 세 단계의 정제 및 결정화 포함 6 주요 부분을 포함한다.도 1에 도시 된 식 구조의 설계를 도시한다 (EC) 및 pMalc2x 발현 벡터의 특징. pMalc2x 벡터의 다중 클로닝 부위 (MCS)의 순서는 제한 프로테아제 절단 부위를 나타낸다.도 3은 제 두개의 대응하는 회로도와 MBP-...

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Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

인간의 노로 바이러스 돌출 도메인의 생산에<em&gt; E. 대장균</em&gt; X 선 결정학에 대한

여기서는 표현 E.의 (P) 영역을 돌출 고품질 노로 바이러스를 정제하는 방법을 설명 대장균 X 선 결정학 연구에 사용. 이 방법은 다른 calicivirus의 P 영역뿐만 아니라, 비 구조 단백질에 적용 할 수있는 예. 바이러스 게놈의 단백질 - 결합 (VPG), 프로테아제 및 RNA 의존적 RNA 폴리머 라제 (RDRP).

The norovirus capsid is composed of a single major structural protein, termed VP1. VP1 is subdivided into a shell (S) domain and a protruding (P) domain. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Production of Human Norovirus Protruding Domains in E. coli for X-ray Crystallography

8.6K 조회수.  University of Heidelberg and the German Cancer Research Center.  여기서는 표현 E.의 (P) 영역을 돌출 고품질 노로 바이러스를 정제하는 방법을 설명 대장균 X 선 결정학 연구에 사용. 이 방법은 다른 calicivirus의 P 영역뿐만 아니라, 비 구조 단백질에 적용 할 수있는 예. 바이러스 게놈의 단백질 - 결합 (VPG), 프로테아제 및 RNA 의존적 RNA 폴리머 라제 (RDRP). 

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Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.

생산, 결정화 및 구조 결정의<em&gt; C. 남과 어울리지 않는</em&gt; PPEP-1 Microseeding 및 아연 SAD를 통해

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

연구

생화학

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, &#945;-helical and &#946;-barrel. While &#945;-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, &#946;-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite &#946;-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target &#946;-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

&#946;-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of &#946;-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

화학

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the disordered and protease labile C-terminus of the protein. This manuscript describes the methods to purify recombinant Nsa1 from S. cerevisiae for structural analysis by both X-ray crystallography and SAXS. X-ray crystallography was utilized to solve the structure of the well-ordered N-terminal WD40 domain of Nsa1, and then SAXS was used to resolve the structure of the C-terminus of Nsa1 in solution. Solution scattering data was collected from full-length Nsa1 in solution. The theoretical scattering amplitudes were calculated from the high-resolution crystal structure of the WD40 domain, and then a combination of rigid body and ab initio modeling revealed the C-terminus of Nsa1. Through this hybrid approach the quaternary structure of the entire protein was reconstructed. The methods presented here should be generally applicable for the hybrid structural determination of other proteins composed of a mix of structured and unstructured domains.

Combining X-Ray Crystallography with Small Angle X-Ray Scattering to Model Unstructured Regions of Nsa1 from S. Cerevisiae

This method describes the cloning, expression, and purification of recombinant Nsa1 for structural determination by X-ray crystallography and small-angle X-ray scattering (SAXS), and is applicable for the hybrid structural analysis of other proteins containing both ordered and disordered domains.

S. Cerevisiae 에서 Nsa1의 구조화 되지 않은 영역을 모델링 하는 데 작은 각 x 선 산란 된 x-선 결정학을 결합

Determination of the full-length structure of ribosome assembly factor Nsa1 from Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is challenging because of the ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and IKK&#946;. Upon activation, the IKK complex phosphorylates the I&#954;B molecules leading to NF-&#954;B nuclear translocation and activation of target genes. Inhibition of the NEMO/IKK interaction is an attractive therapeutic paradigm for the modulation of NF-&#954;B pathway activity, making NEMO a target for inhibitors design and discovery. To facilitate the process of discovery and optimization of NEMO inhibitors, we engineered an improved construct of the IKK-binding domain of NEMO that would allow for structure determination of the protein in the apo form and while bound to small molecular weight inhibitors. Here, we present the strategy utilized for the design, expression and structural characterization of the IKK-binding domain of NEMO. The protein is expressed in E. coli cells, solubilized under denaturing conditions and purified through three chromatographic steps. We discuss the protocols for obtaining crystals for structure determination and describe data acquisition and analysis strategies. The protocols will find wide applicability to the structure determination of complexes of NEMO and small molecule inhibitors.

We describe protocols for the structure determination of the IKK-binding domain of NEMO by X-ray crystallography. The methods include protein expression, purification and characterization as well as strategies for successful crystal optimization and structure determination of the protein in its unbound form.

NEMO의 IKK 결합 도메인의 생산, 결정화 및 구조 결정

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

We present a protocol on how to utilize high-throughput cryo-electron tomography to determine high resolution in situ structures of molecular machines. The protocol permits large amounts of data to be processed, avoids common bottlenecks and reduces resource downtime, allowing the user to focus on important biological questions.

Tomoauto 사용 : 프로토콜 높은 처리량 자동화 된 곳을 알아내는 - 전자 단층 촬영을 위해

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

생체공학

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine detection of the virus. The current detection and quantification techniques, which rely primarily on nucleic acid amplification, do not discriminate infectious from non-infectious viral particles. The purpose of this article is to present specific details on recent advances in techniques used together in order to acquire further information on the infectivity status of viral particles. One technique involves assessing binding of a norovirus ssDNA aptamer to capsids. Aptamers have the advantage of being easily synthesized and modified, and are inexpensive and stable. Another technique, dynamic light scattering (DLS), has the advantage of observing capsid behavior in solution. Electron microscopy allows for visualization of the structural integrity of the viral capsids. Although promising, there are some drawbacks to each technique, such as non-specific aptamer binding to positively-charged molecules from sample matrices, requirement of purified capsid for DLS, and poor sensitivity for electron microscopy. Nonetheless, when these techniques are used in combination, the body of data produced provides more comprehensive information on norovirus capsid integrity that can be used to infer infectivity, information which is essential for accurate evaluation of inactivation methods or interpretation of virus detection. This article provides protocols for using these methods to discriminate infectious human norovirus particles.

Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity

Routine detection methods utilizing viral genome amplification are limited by their inability to discriminate infectious from non-infectious particles. The purpose of this article is to provide detailed protocols for alternative methods to aid in discrimination of infectious norovirus particles using aptamer binding, dynamic light scattering, and transmission electron microscopy.

대체 체 외에 바이러스 성 Capsid 구조적 무결성의 결정에 대 한 방법

Human norovirus exacts considerable public health and economic losses worldwide. Emerging in vitro cultivation advances are not yet applicable for routine ...

면역학 및 감염병학

Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is responsible for altering infection for many of these viruses. Thus, characterizing the nature of virus-bacteria binding is a foundational step needed for elucidating the mechanism(s) by which bacteria alter viral infection. For human norovirus, commensal bacteria enhance B cell infection. The virus directly binds to these bacteria, indicating that this direct interaction is involved in the mechanism of infection enhancement. A variety of techniques can be used to quantify interactions between bacteria and viruses including scintillation counting of radiolabeled viruses and polymerase chain reaction (PCR). Both methods require the use of live virus, which may need to be generated in the laboratory. Currently, none of the established in vitro culture systems available for human norovirus are robust enough to allow for generation of highly concentrated viral stocks. In lieu of live virus, virus-like particles (VLPs) have been used to characterize the interactions between norovirus and bacteria. Herein a flow cytometry method is described with uses virus specific antibodies to quantify VLP binding to gram-negative and gram-positive bacteria. Inclusion of both bacteria only and isotype controls allowed for optimization of the assay to reduce background antibody binding and accurate quantification of VLP attachment to the bacteria tested. High VLP:bacterium ratios result in VLPs binding to large percentages of the bacterial population. However, when VLP quantities are decreased, the percent of bacteria bound also decreases. Ultimately, this method can be employed in future experiments elucidating the specific conditions and structural components that regulate norovirus:bacterial interactions.

The goal of this protocol is to quantify binding of the eukaryotic pathogen human norovirus to bacteria. After performing an initial virus-bacterium attachment assay, flow cytometry is used to detect virally-bound bacteria within the population.

유세포측정을 사용하여 공생 균에 결합하는 인간 노로바이러스 바이러스와 같은 입자 정량화

Commensal bacteria are well established to impact infection of eukaryotic viruses. Direct binding between the pathogen and the host microbiome is ...

바이러스에 감염된 인간 장 오가노이드 단층의 칼슘 이미징

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory activity, actin dynamics, inflammatory responses, stem cell proliferation, and many other uncharacterized cellular functions. As such, mapping calcium signaling dynamics within the intestinal epithelium can provide insight into homeostatic cellular processes and unveil unique responses to various stimuli. Human intestinal organoids (HIOs) are a high-throughput, human-derived model to study the intestinal epithelium and thus represent a useful system to investigate calcium dynamics. This paper describes a protocol to stably transduce HIOs with genetically encoded calcium indicators (GECIs), perform live fluorescence microscopy, and analyze imaging data to meaningfully characterize calcium signals. As a representative example, 3-dimensional HIOs were transduced with lentivirus to stably express GCaMP6s, a green fluorescent protein-based cytosolic GECI. The engineered HIOs were then dispersed into a single-cell suspension and seeded as monolayers. After differentiation, the HIO monolayers were infected with rotavirus and/or treated with drugs known to stimulate a calcium response. An epifluorescence microscope fitted with a temperature-controlled, humidified live-imaging chamber allowed for long-term imaging of infected or drug-treated monolayers. Following imaging, acquired images were analyzed using the freely available analysis software, ImageJ. Overall, this work establishes an adaptable pipeline for characterizing cellular signaling in HIOs.

저자 스포트라이트: 장 상피 신호의 바이러스 파괴 조사 – 연구 통찰력 및 향후 방향 

This protocol describes an approach for performing calcium imaging in virus-infected human intestinal organoids and offers an approach to analysis.

유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 사용한 바이러스 감염 인간 장 오가노이드 단층의 라이브 칼슘 이미징

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

인간의 노로 바이러스 돌출 도메인의 생산에

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생산, 결정화 및 구조 결정의

β-배럴 외부 막 단백질의 구조 결정을 향해 - 구축해에서 결정에

S. Cerevisiae 에서 Nsa1의 구조화 되지 않은 영역을 모델링 하는 데 작은 각 x 선 산란 된 x-선 결정학을 결합

NEMO의 IKK 결합 도메인의 생산, 결정화 및 구조 결정

Tomoauto 사용 : 프로토콜 높은 처리량 자동화 된 곳을 알아내는 - 전자 단층 촬영을 위해

대체 체 외에 바이러스 성 Capsid 구조적 무결성의 결정에 대 한 방법

유세포측정을 사용하여 공생 균에 결합하는 인간 노로바이러스 바이러스와 같은 입자 정량화

유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 사용한 바이러스 감염 인간 장 오가노이드 단층의 라이브 칼슘 이미징

유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 사용한 바이러스 감염 인간 장 오가노이드 단층의 라이브 칼슘 이미징

유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 사용한 바이러스 감염 인간 장 오가노이드 단층의 라이브 칼슘 이미징