우리는 의견 박사 윌리엄 Margolin 감사합니다. 우리는 박사에서 SerialEM의 지원에 감사합니다. 데이비드 Mastronarde과 첸 쑤. DM, BH와 JL은 웰치 재단 알레르기 및 전염병 국립 연구소, 일반 의료 과학 국립 연구소 (NIGMS)에서 보조금 R01GM110243과 R01GM107629, 그랜트 AU-1714에서 그랜트 R01AI087946에 의해 지원되었다. 직접 전자 검출기는 건강 상 S10OD016279의 국립 연구소에 의해 투자되었다.

1. Minicell 준비 <ol><li> S.을 만들려면 flexneri minicells는 구조적으로 스펙 티노 마이신 내성 플라스미드 5 μL electrocompetent 스트렙토 마이신 내성 혈청 형 5A (M90T-SM) 전기에 의해 세포로 낮은 복사본에서 대장균 세포 분열 유전자 ftsQ, ftsA 및 ftsZ을 표현 플라스미드 pBS58, 1 μl를 변환 1mm 큐벳에 5 밀리 2.5 kV의에. </li><li> 1.5 ml의 극저온 마이크로 튜브 15 % 글리세롤에서 -80 ° C에서 보관 minicell 샘플. 사용하기 위해, 4 ml의 세포를 피펫 팁을 사용하여 unthawed 마이크로 튜브에서 세포의 약 5 μl를 긁어 일시 중지 준비가되면 스펙 티노 마이신과 트립신 간장 국물 / ㎖ 농도 100 μg의 추가. 37 ° C에서 O / N 성장. </li><li> 피펫 다시 100 μg의 / ml의 농도에 추가 스펙 티노 마이신 1.2 (200)에 ㎖의 트립신 간장 국물의 문화 2 ㎖. 늦은 로그 상에 37 ℃에서 성장한다. </li><li> minicells, 원심 분리 농축5 분 1,000 XG에 1.3에서 문화 200 ㎖. 조심스럽게 10 분 동안 20,000 XG에 새로운 원심 분리 튜브에서 원심 분리로 상청액 분획을 붓는다. 조심스럽게 부어과 상청액 분획을 폐기하고, 부드럽게 피펫 팁을 이용하여 잔여 액체로 펠릿을 혼합하여 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 펠릿의 혼합물을 약 100 μl를 옮긴다. </li></ol> 2. EM 그리드 준비 <ol><li> 유리 슬라이드에 R2 / 2 구멍 투성이의 탄소 필름 200 메쉬 구리 그리드 탄소 측면을 놓습니다. 주 : R2 / 2의 200 메시 그리드는 여전히 표본을지지하고 카메라의 분야에서 탄소막의 에지를 배치하는 동안 하나의 그리드 사각형은 취득하기 위해서 설정 될 수 틸트 계의 수를 최대화하도록 선택된다 원하는 배율로. 미세한 메쉬 그리드 및 R1.2 같은 작은 구멍 투성이 탄소막 / 1.3 400 메쉬 높은 배율에서 영상화 시료에 사용될 수있다; 같은 R3.5으로 더 큰 구멍 투성이의 탄소 필름 / 1 200 메쉬 사용 할 수 있습니다샘플 D는 낮은 배율에서 영상화 또는 현미경은 R1과 같은 큰 간격 탄소 에지 구멍 투성이 탄소막 없어야한다면 / 4 200 메쉬 관심 영역으로 스테이지를 정렬로부터 지역을 보호 돕기 위해 사용될 수있다 과다 노출 루틴을 집중하고 추적한다. </li><li> 글로우 방전 장치의 플랫폼에서 슬라이드를 놓습니다. 주 : 우리는 양극과 플랫폼이 진공 데시 케이 터로 가공되었고, 고주파 발생기에 의해 구동되는 내부 소자를 사용한다. 진공을 생성 한 후, 글로우 방전 그리드 1 분간 프로브에 양극과 전원에 고주파 발생기 프로브를 부착. 필요한 시간은 그리드 분 몇 초에 이르기까지 다양 글로우 방전합니다. 글로우 방전 시간을 가변하는 시료 농도없이 유리체 얼음 건조 나타나는 격자의 문제를 진단하는데 사용될 수있다. </li><li> 집게 세트와 그리드를 제거하고 집게가 탄성 B와 닫힌 된 자물쇠과. </li><li> 1.4에서 제조 된 minicells와 microcentrifuge 관에 10 나노 콜로이드 금 용액 100 μl를 추가하고 부드럽게 손가락으로 튜브를 쓸어 넘겨 섞는다. 2.2 제조 그리드 혼합물의 새로운 피펫 장소 4 μL와. 주 : 콜로이드 금 크기와 치료의 다양한 가능 금의 크기는, 획득 된 확대 크기로 처리 될 현미경의 화소 사이즈 주어진보다 5 화소 인 것을주의해야한다 모호한 기능에 너무 크게되지 않는 반면 관심. </li><li> 플 런지 동결 장치를 준비; 액체 질소와 외부 냉동 컨테이너를 작성 후 액체 에탄과 내부 챔버를 입력합니다. 플런저로드에 그리드와 집게를 부착하고 상승 된 위치로 플런저로드를 잠급니다. 주 : 20 Iancu 등을 상업적 런지 냉동 장치의 사용을 설명하기위한 프로토콜.. </li><li> 신중 t하는 ​​여과지를 터치함으로써 그리드를 가릴그는 즉시 그리드를 동결, 플런저로드를 해제, 그리드 및 필터 종이 분리하여 정지 필터 종이에 심지 사이의 메 니스 커스 (meniscus)까지의 샘플 놓습니다. 조심스럽게 플런저로드에서 집게를 제거하고 그리드 홀더에 그리드를 배치합니다. </li><li> 액체 질소로 적재 영역과 흡수 펌프 용기를 충전함으로써 크라이 EM 전송 스테이션을 준비한다. 적재 영역은 그리드 홀더 적재 영역에서 현미경 시편 카트리지가 액체 질소 온도 장소되면. </li><li> 조심스럽게 이전 Polara 현미경 이상 모델에 C 스타일의 클립 링에 작은 나사 잠금 고리 중 하나 인 잠금 링을 제거; 집게를 사용하여 카트리지에 EM 그리드를 배치하고 부드럽게 그리드를 고정하는 카트리지에 다시 잠금 고리를 다시 연결합니다. </li><li> 현미경에서 여러 시편 홀더를 제거하고 전송 스테이션에 연결합니다. 카트리지 집게를 사용하여 표본 홀더에 카트리지를 배치적재 영역에서 홀더를 후퇴하고 현미경으로 다시 여러 시험편 홀더를 전송 거라고. 참고 :. 첸 등 21 2.1-2.9을 자세히 설명하는 시각적 프로토콜을 참조하십시오. </li></ol> 3. 높은 처리량 자동 기울기 시리즈 컬렉션 <ol><li> 낮은 배율지도의 컬렉션 <ol><li> SerialEM (10)의 &#39;네비게이터&#39;메뉴에서 &#39;열기&#39;를 클릭하여 새 탐색기 창을 엽니 다 (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM) </li><li> 허용 이미징 조건을 포함 그리드 사각형 찾기 (즉, 얇은 얼음, 아니 오염, 관심의 대상이) 낮은 배율에서 형광 스크린을 사용하여 (~ 2,300X minicell 표본에 대한). 참고 : [선택 :.이 단계는 전체 그리드를 montaging에 의해 SerialEM으로 자동화 할 수 있습니다, 그러나 그것은 단순히 수동으로 몇 지역을 선택 빠를 수 있습니다] </li><li> 다음 조정 50 °에 시편 홀더를 기울여 eucentric 높이로 단계를 조정XY 스테이지의 번역까지 Z-높이 기울어 기울지보기간에 최소이다. </li><li> 그리드 광장의 중심으로 이동하고 현재 단계의 위치를​​ 저장하기 위해 탐색기 창에서 &#39;추가 단계 순위&#39;버튼을 클릭합니다. </li><li> 모두 허용 그리드 사각형 무대 위치가 저장 될 때까지 위의 단계 3.1.1-4를 계속합니다. </li><li> &#39;파일&#39;메뉴에서 &#39;새 몽타주&#39;를 클릭하여 새 몽타주 MRC 파일을 엽니 다. 열어 몽타주 설정 대화 상자에서 전체 그리드 광장 (표준 200 메쉬 그리드에 대한 예를 들어, 10 × 10)을 취득한다 X와 Y의 조각의 수를 선택합니다. &#39;대신 이미지 쉬프트의 스테이지를 이동&#39;및 라디오 버튼 &#39;조각 정렬하는 데 사용되는 상관 관계 건너 뛰기&#39;를 8 등 높은 비닝 (binning)을 사용하여 선택합니다. </li><li> 네비게이터 창에서 첫 번째 단계 위치를 클릭하고는 &#39;획득&#39;확인란을 선택하여 얻을 수 설정. 탐색기 창에서 각 단계의 위치에 대해이 작업을 반복합니다. </li><li> 네비게이터는 &#39;네비게이터&#39;메뉴에서 &#39;포인트에서 획득&#39;를 클릭하여 대화 상자를 획득 엽니 다. &#39;획득 맵 이미지&#39;와 &#39;거친 eucentricity&#39;확인란을 선택하고 다른 모든 확인란이 체크되어 있는지 확인하십시오. 각 단계의 위치에서 몽타주를 수집하기 위해 &#39;진행&#39;을 클릭합니다. </li></ol></li><li> 틸트 - 시리즈 수집 <ol><li> 네비게이터 창에서 획득 한지도 중 하나를 선택하고 &#39;로드 맵&#39;버튼을 클릭합니다. </li><li> 네비게이터 창에서 틸트 - 시리즈를 취득하는지도에있는 버튼 &#39;점 추가&#39;를 선택 점을 클릭합니다. 그런 다음 버튼 &#39;포인트 추가 중지&#39;를 클릭합니다. 수집 된 각 맵에 대해 반복합니다. </li><li> 카메라 메뉴에서 &#39;매개 변수&#39;를 선택하고 초점, 시험 및 기록 모드에 대한 매개 변수를 정의합니다. [선택 :. 데이터가 기록 모드에 대한 매개 변수를 지정할 수 있습니다 투여 량 - 분획] </li><li> 탐색기 창에서 지점을 선택하고 &#39;틸트 - 시리즈를 확인9; 상자를 선택합니다. 매개 변수를 선택 열리는 틸트 - 시리즈 설정 대화 창에서 틸트 시리즈 수집을 위해 원하는. 탐색기 창에서 선택된 지점의 나머지 부분에 대한 반복하지만,지도를 선택하지 마십시오. </li><li> 탐색기 메뉴에서 다시 &#39;지점에서 취득&#39;을 선택합니다. 네비게이터 대화 선택 &#39;항목을 다시 정렬&#39;, 자동 초점 &#39;과&#39;거친 eucentricity 취득 &#39;예비 작업 등을하고&#39;틸트 시리즈를 취득 &#39;기본​​ 작업으로, 선택&#39;할 때 모든 열을 닫습니다 &#39;끝에 닫기 열 밸브 점으로 수집되었다. 틸트 - 시리즈를 진행하면 각 맵의 각 지점에서 수집됩니다. </li></ol></li></ol> 4. 높은 처리량 자동 기울기 시리즈 처리 및 재건 Tomoauto 사용 <ol><li> 용량 - 분획 데이터 빔에 의한 모션의 보정 [선택 사항] 참고 : Tomoauto는 MOTIONCORR 22 (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.ht를 사용㎖) 용량 분획 현미경 사진에서 빔 유도 동작을 제거합니다. NOTIONCORR (16)이 시스템에 설치되어 있어야합니다. <ol><li> 명령을 실행 터미널에서 원래의 기울기 시리즈, 현재 작업 디렉토리에 SerialEM (10)의 출력 로그 및 개별 용량 분별 이미지 모두와 함께 : dose_fractioned_to_stack &lt;filename.st&gt; &lt;filename.st&gt; 처리 할 수있는 틸트 시리즈의 이름입니다. </li></ol></li><li> 틸트 - 시리즈의 정렬 및 재건 참고 : 기본적으로는 틸트 Tomoauto 계 자동화 기점 모델 생성, 정렬, 콘트라스트 전송 기능 (CTF), CTF 정정 (23)의 판정 처리 (http://bio3d.colorado.edu/imod/) IMOD (13)을 사용하고 재건. 또한 사용자는 자동 기점 모델 생성, CTF에 대한 (IMOD에 포함) RAPTOR (24)를 사용하는 tomoauto의 옵션이 있습니다FIND4 25 (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf) CTF을 결정하고, tomo3d 26 (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) 재건 또는 소프트웨어 패키지의 조합에 의한에 구성. 각각의 패키지로 제공이 구성뿐만 아니라, 매개 변수는 로컬 구성 파일은 또한 특정 시료에 사용 세부 파라미터 수집하기 위해 생성 될 수 있지만 가장 일반적으로 실험실에서 사용 된 값에 맞게 편집 할 수있는 전역 구성 파일에서 처리 설정 또는 개별 틸트 시리즈. 사용하고자하는 모든 패키지는 시스템에 설치되어 있어야합니다. <ol><li> 현재 작업 디렉토리의 기울기 시리즈로, 터미널에서 명령을 실행 tomoauto --CTF --mode = 정렬 &lt;filename.st&gt; &lt;fid_diam&gt; &lt;filename.st&gt; 처리 할 수있는 틸트 시리즈 및 &lt;fid_diam&gt;는 diame입니다나노 미터의 기준 마커의 터. 이 명령은 정렬과 자동 기울기 시리즈의 CTF을 추정됩니다. 이 명령 --CTF 옵션을 제거하여 CTF 처리를 건너 뛸 수있다. </li><li> 배향 처리에있어서 임의의 에러를 시각적으로 두드러진 경사 배향 계를 조사하고 명령을 실행함으로써 추정 CTF 검사 : 3dmod &lt;파일 이름&gt; .ali submfg &lt;파일 이름&gt; _ctfplotter.com 각각, 여기서 &lt;파일 이름&gt; 접미사없이 기울기 시리즈의 이름입니다. 또한 얼라인먼트 품질 통계치 정량적 인 배향에 의해 생성 평균 예측 오차를 표시 tomoauto 명령의 출력을 확인. </li><li> 허용 정렬 주어진 명령을 실행하여 처리를 진행합니다 : tomoau에 --CTF --mode = 재구성 &lt;filename.st&gt; &lt;fid_diam&gt; 4.2.1에서와 같은 사용자와 대체. 이 명령은, CTF를 해결 기울기 시리즈에서 기준 마커를 지우고 재건을 계산합니다. 다시 CTF 처리는 4.2.1에서와 같이 건너 뛸 수 있습니다. </li><li> [선택] 육안 검사 단계를 건너 뛰고 완전히 처리 및 복원 명령을 실행 자동화하는 tomoauto --CTF &lt;filename.st&gt; &lt;fid_diam&gt; </li><li> [선택] 로컬 구성 파일을 생성하는 방법에 대한 tomoauto 문서를 참조하십시오, 특정 로컬 구성을 사용하여 다음 명령을 실행합니다 tomoauto [옵션] -L &lt;local_config&gt; &lt;filename.st&gt; &lt;fid_diam&gt; 여기서 &lt;local_config&gt;는 지역의 conf의 이름입니다프린터의 구성 파일. </li></ol></li></ol> 5. 하위 단층 평균화 참고 : 15은 (http://www.electrontomography.org/) 서브 단층 평균화 실험을 처리하기 위해, 그러나 프로토콜 설명 I3 패키지를 사용하는 대부분의 사용 가능한 서브 - 단층 평균화 소프트웨어 packages16to 프로세스 서브 단층 평균화 실험에 일반적으로 적용 그러나 대부분의 프로토콜은 사용 가능한 서브 단층 평균화 된 소프트웨어 패키지에 일반적으로 적용되는 16 ~ 18 기재. <ol><li> 현재 작업 디렉토리에 복원 된 단층 촬영으로 명령을 실행하여 입자 따기위한 단층 촬영을 엽니 다 tomopick &lt;파일 이름&gt; .rec 여기서 &lt;파일 이름&gt; 4.2.2과 같다. injectisome을 선택하고 tomogra의 조각을 통해 서민 위쪽 및 아래쪽 화살표 키를 사용하여 먼저 기초 신체 후 바늘 끝을 클릭 마우스 왼쪽 버튼을 사용하여 열리는 창에서엠. 이러한 방식으로 모든 볼 injectisomes을 선택합니다. 이 구조의 장축을 정의뿐만 아니라 세 개의 오일러의 두 구조의 배향을 나타내는 각도 추정 텍스트 파일의 좌표를 저장한다. </li><li> 계산적 추출 명령을 실행하여 정의 장축의 중앙에 중심을 단층 400 3 복셀 큐브 : 클립 크기 조정 -cx &lt;X&gt; -cy &lt;Y&gt; -cz &lt;Z&gt; -ix 400 -iy 400 -iz 400 &lt;파일 이름&gt; .rec &lt;파일 이름&gt; _001.mrc 여기서 &lt;X&gt;, &lt;Y&gt;, &lt;Z&gt; 구조의 중간 좌표는과 &lt;파일 이름&gt; 4.2.2과 같다. 추출 된 입방체의 크기는 사용 된 구조와 배율에 따라 다양해야하고, 충분히이 샘플 (400) 3 인 관심 복셀 구조를 묶 할만큼 충분히 커야한다. </li><li> 다운 샘플 (BIN) 명령을 실행함으로써, 초기 배향을위한 연산 시간을 줄이기 위해 4 배수로 서브 단층 : binvol -b 4 &lt;파일 이름&gt; _001.mrc &lt;파일 이름&gt; _001.bin4.mrc 여기서 &lt;파일 이름&gt; 5.2과 같다. </li><li> 결정된 오일러 서브 단층 촬영 각도에 적용하고 명령을 실행하여 초기 템플릿을 생성하기 위해 세계 평균을 계산한다. I3totsum.sh </li><li> 정렬하고 세포질 영역의 이진 분류 마스크를 사용하여 다운 샘플링 하위 단층 촬영을 분류합니다. 단층의 특성 누락 쐐기 아티팩트를 최소화하기 위해 푸리에 공간에서 서브 단층 평균을 수행합니다. 4 데이터를 비닝를 들어, SAMPFACT = &quot;4 4 4&quot;를 이용하시기 바랍니다. i3mramsacls.sh </li><li> 5.5 단계를 반복하여 서브 두 단층 촬영 (SAMPFACT = 배만큼 다운 샘플링# 34 2 2 2 &quot;)과 다시 한번 원래 데이터 (SAMPFACT =&quot;1 1 1 &quot;). i3mramsacls.sh </li></ol>

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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryotomography+sample+preparation+using+the+Vitrobot.">Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 2813-2819 (2007).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Cryoelectrontomography+of+Bacterial+Cells.">Electron Cryoelectrontomography of Bacterial Cells.</a> J. Vis. Exp. (39), e1943 (2010).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM.">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nat. Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li><li>Xiong, Q., Morphew, M. K., Schwartz, C. L., Hoenger, A. H., Mastronarde, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTF+determination+and+correction+for+low+dose+tomographic+tilt+series.">CTF determination and correction for low dose tomographic tilt series.</a> J. Struct. Biol. 168 (3), 378-387 (2009).</li><li>Amat, F., Moussavi, F., Comolli, L. R., Elidan, G., Downing, K. H., Horowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markov+random+field+based+automatic+image+alignment+for+electron+tomography.">Markov random field based automatic image alignment for electron tomography.</a> J. Struct. Biol. 161 (3), 260-275 (2008).</li><li>Rouhou, A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTFFIND4:+Fast+and+accurate+defocus+estimation+from+electron+micrographs.">CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs.</a> bioRxiv. , (2015).</li><li>Agulleiro, J. I., Fernandez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomo3D+2.0+&#8211;+Exploitation+of+Advanced+Vector+eXtensions+(AVX)+for+3D+reconstruction.">Tomo3D 2.0 &#8211; Exploitation of Advanced Vector eXtensions (AVX) for 3D reconstruction.</a> J. Struct. Biol. 189 (2), 147-152 (2015).</li><li>Zhao, X., Zhang, K., Boquoi, T., Hu, B., Motaleb, M. A., Miller, K., James, M., Charon, N. W., Manon, M. D., Norris, S. J., Li, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-Electron+Tomography+Reveals+the+Sequential+Assembly+of+Bacterial+Flagella+in+Borrelia+burgdorferi.">Cryo-Electron Tomography Reveals the Sequential Assembly of Bacterial Flagella in Borrelia burgdorferi.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14390-14395 (2013).</li><li>Hu, B., Margolin, W., Molineux, I. J., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bacteriophage+T7+Virion+Undergoes+Extensive+Structural+Remodeling+during+infection.">The Bacteriophage T7 Virion Undergoes Extensive Structural Remodeling during infection.</a> Science. 339 (6119), 576-579 (2013).</li><li>Liu, J., Hu, B., Morado, D. R., Jani, S., Manson, M. D., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=W:+Molecular+architecture+of+chemoreceptor+arrays+revealed+by+cryoelectron+tomography+of+Escherichia+coli+minicells.">W: Molecular architecture of chemoreceptor arrays revealed by cryoelectron tomography of Escherichia coli minicells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (23), e1481-e1488 (2012).</li><li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy:+Ultrastable+gold+substrates+for+electron+cryomicroscopy.">Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy.</a> Science. 346 (6215), 1377-1380 (2014).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에 기술 된 고 처리량 방법이 1,917 크라이 틸트 계를 처리하고 그대로 S. 4,500 이상의 서브 단층 촬영을 생성 할 수있었습니다 flexneri 19 injectisome. 수집 된 데이터는 복잡한 정렬 세포질을 포함하여 현장 injectisome에서의 세부 특성화되었다. 방법은 또한 injectisome의 정렬 플랫폼의 구성을 명료하게 도왔다 추정의 단백질 성분의 특정 결실, 여러 돌연변이 세포를 ...

유형 III 분비 시스템 (T3SS)는 많은 그람 음성 병원균에 필수적인 독성 결정이다. 또한 바늘 ​​착체라고도 injectisome은 진핵 숙주 세포를 1, 2로 박테리아에서 이펙터 단백질의 직접적인 전좌 필요한 중앙 T3SS 기계이다. injectisome가 외 바늘 기저 체 및 세포질 착체를 포함라고도 정렬 복잡한 3 등. 이전의 연구는 중요한 기초 체 단백질 (4, 5)의 원자 구조와 함께, 살모넬라 및 시겔로부터 정제 injectisomes의 3 차원 구조를 해명했다. 살모넬라, 시겔 라 (Shigella), 및 예 르시 니아에서 injectisomes의 동일계 구조 최근-ET 크라이 (6)에 의해 드러난 7. 그러나, 이펙터 선택 및 니들 어셈블리에 필수적인 세포질 단지는, 그 구조에 가시화되지 않았습니다. 곳을 알아내는 - 동부 MOS입니다(원위치) 네이티브 휴대 맥락 나노 해상도 기계 분자 이미징에 적합한 기술을 t. 그럼에도 불구하고, 극저온 동부에 의해 달성 해상도는 시편의 두께에 의해 제한된다. 단점을 극복하기 위해, 우리는 유 전적으로 크라이 동부 충분히 얇은 minicells을 생산하기 위해 수정 된 악성 시겔 flexneri 변형에 그대로 injectisomes 군데. 극저온 ET의 또 다른 한계는 매우 신속하게 샘플 고해상도 정보를 파괴 전자빔에 의한 조사에 시료의 감도이다. 적합한 투여 량은 전체 기울기 계 사이에 분산 될 수 있도록 그 결과, 매우 낮은 투여 량은 개개의 틸트 - 이미지에 사용된다. 이것은 매우 어려운 단층 소음의 다량에서 피사체의 구조적 특징을 구별 할 수있게하고 cryo-에 의해 달성 될 수있는 해상도를 제한 최종 재구성 된 신호 대 잡음비 (SNR)를 낮춘다 동부. Conventi이러한 푸리에 리얼 공간 필터로서뿐만 아니라, 다운 샘플링 ONAL 화상 처리는 콘트라스트를 높이기 위해 사용하지만, 고해상도 많은 정보를 필터링을 희생 할 수있다. 최근에는, 서브 - 단층 평균화 가능 크게 SNR을 증가시키고 서브 - 나노 미터 수준 (8, 9)에 어떤 경우에는 이후에 최종 해상도로했다. 착물의보다 상세한 분석이 가능해진다 계산적 함유 서브 단층 촬영 수천 추출하여 정렬하고 하위 단층 촬영을 평균 원래 단층 촬영 및 관심 분야는 높은 SNR 및 높은 해상도와 현장 복잡한 구조에서 결정합니다. 이러한 방법은 거대 분자 어셈블리와 네이티브 휴대 문맥에서의 동적 배좌에 더욱 통찰력을 제공하는 유전자 접근법과 통합 될 수있다. 일반적으로 수십 또는 서브 - 단층 촬영 천 수백 고 판정하기 위해 평균화 될 필요현장에서 -resolution 구조. 틸트 시리즈의 충분한 수의 인수는 서브 단층 촬영이 많은 빠르게 병목 현상이 생산하는 데 필요한. 그 결과 틸트 시리즈는 종종 재건하기 전에 정렬로 기울기 시리즈를 가지고 해결해야 빔에 의한 변화, 무대 반발뿐만 아니라, 확대, 회전 및 기울이기 결함에 의해 영향을 받는다. 틸트 시리즈는 일반적으로 또 다른 병목 현상을 일으키는 원인이 전통적으로 수동 기울기 시리즈의 검사를 통해 선택 추적 금 기준 마커,에 의해 정렬됩니다. 많은 소프트웨어 패키지 (11), (12), 틸트 계 정렬 및 재구성 (13) (14)와 서브 - 단층은 평균 15-18 컴퓨터 제어 전자 현미경 (10)을 통해 자동 기울기 계 획득을 위해 개발되어왔다. 이러한 패키지는 극저온 ET의 흐름에서 개별 작업을 처리, 그것은 SYSTEMA에 프로세스에 높은 레벨의 추상화를 구축하는 것이 바람직하게학적으로 하나의 파이프 라인으로 전체 체계를 간소화. 따라서 집중적으로 각 성분의 전체 구성을 유지하면서 간단한 사용자 조작을 허용 하나 반 자동화 기기에이 패키지의 번호를 정리하기위한 &quot;tomoauto&quot;소프트웨어 래퍼 라이브러리를 개발했다. 도서관은 온라인 원격 소스 코드 저장소 (http://github.com/DustinMorado/tomoauto)에 의해 오픈 소스, 잘 문서화 지속적으로 개발 및 사용을위한 자유롭게 사용할 수, 맞춤형 개발 또는 추가 통합이다. 이 높은 처리량 크라이 동부 파이프 라인 (S)에 그대로 injectisomes을 시각화하기 위해 이용되고있다 flexneri minicells. 1,917 단층 촬영의 총 서브 단층 (19)을 평균함으로써 결정 세포질 정렬 플랫폼을 포함한 컴퓨터 본래의 동일계 구조 고해상도을 드러내는,이 방법을 사용하여 생성 하였다. 함께 야생 타입 및 m-의 분자 모델링utant 기계는, 우리의 높은 처리량 파이프 라인은 네이티브 휴대 컨텍스트 손상 injectisome의 구조와 기능을 이해하기위한 새로운 수단을 제공한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="651">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">Glycerol</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">G9012</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">Tyrptic Soy Broth</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">22092</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">Spectinomycin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">S0692</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:160px;">Electroporation Apparatus</td>
			<td style="width:211px;">Bio-rad</td>
			<td>165-2100</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">1 mm Cuvette</td>
			<td style="width:211px;">BTX</td>
			<td>45-0124</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">1.5 mL Cryogenic Tube</td>
			<td style="width:211px;">Thermoscientific</td>
			<td>5000-1020</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:160px;">1.5 mL Microcentrifuge Tube</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z336769</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:160px;">Holey Carbon Grids</td>
			<td style="width:211px;">Quantifoil 
			(Electron Microscopy Sciences)</td>
			<td style="width:116px;">Q2100CR2</td>
			<td style="width:164px;">R2/2 200 Cu</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:160px;">Glow Discharge Device</td>
			<td style="width:211px;">In-House</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:164px;">Commercial Alternative Available</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:160px;">Vacuum Desiccator</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:116px;">Z119016&#160;</td>
			<td style="width:164px;">Used in In-House Glow Discharge Device</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:160px;">High-Frequency Generator</td>
			<td style="width:211px;">Electro-Technic Products</td>
			<td style="width:116px;">BD-10A</td>
			<td style="width:164px;">Used in In-House Glow Discharge Device.&#160; CAUTION: This device generates high voltages.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:160px;">Forceps</td>
			<td style="width:211px;">Dumont 
			(Electron Microscopy Sciences)</td>
			<td style="width:116px;">72705-D</td>
			<td style="width:164px;">Style 5 Anti-magnetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">Colliodal Gold</td>
			<td style="width:211px;">Aurion</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:164px;">BSA 10nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">Filter Paper</td>
			<td style="width:211px;">Whatman</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:164px;">#2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">Ethane&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Matheson Tri-Gas</td>
			<td style="width:116px;">UN1035</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">Nitrogen</td>
			<td style="width:211px;">Matheson Tri-Gas</td>
			<td style="width:116px;">UN1977</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:160px;">Plunger Device</td>
			<td style="width:211px;">In-House</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:164px;">Commercial Alternative Available</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:160px;">Cryogenic Grid Storage Box</td>
			<td style="width:211px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:116px;">71166-30</td>
			<td style="width:164px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:160px;">Transmission Electron Microscope</td>
			<td style="width:211px;">FEI</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:164px;">Tecnai Polara F30 
			(300 KeV)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:160px;">Direct Detection Device Camera</td>
			<td style="width:211px;">Gatan</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:164px;">K2 Summit</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:160px;">Tomogram Acquisiton Software</td>
			<td style="width:211px;">SerialEM</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:164px;">http://bio3d.colorado.eud/SerialEM Alternatives: UCSF Tomography, Leginon, FEI Batch Tomography</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:160px;">Beam-induced Motion Correction Software</td>
			<td style="width:211px;">MOTIONCORR</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:164px;">http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html Requires &#62;2GB Nvidia GPU</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:160px;">Tilt-Series Alignment Software</td>
			<td style="width:211px;">IMOD</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:164px;">http://bio3d.colorado.edu/IMOD Alternatives: XMIPP, Protomo</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:160px;">Automatic Fiducial Marker Modelling Software</td>
			<td style="width:211px;">IMOD</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:164px;">Alternatives: RAPTOR (Included in IMOD0 
			(Usable in tomoauto)</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:160px;">CTF Determination Software</td>
			<td style="width:211px;">IMOD</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:164px;">Alternatives: CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf 
			(Usable in tomoauto)</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:160px;">Tilt-Series Reconstruction Software</td>
			<td style="width:211px;">tomo3d</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:164px;">https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d Alternatives: IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es , Protomo</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:160px;">Tilt-Series Automated Processing Software</td>
			<td style="width:211px;">tomoauto</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:164px;">https://github.com/DustinMorado/tomoauto</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:160px;">Particle Picking Software</td>
			<td style="width:211px;">i3</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:164px;">http://www.electrontomography.org Alternatives: IMOD</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:160px;">Subvolume Averaging Software</td>
			<td style="width:211px;">i3</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:164px;">Alternatives: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch , PyTom http://pytom.org</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using tomoauto: a protocol for high-throughput automated cryo-electron tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native context at a molecular level. The technique involves initially preserving the sample in its native state by rapidly freezing the specimen in vitreous ice, then collecting a series of micrographs from different angles at high magnification, and finally computationally reconstructing a 3-D density map. The frozen-hydrated specimen is extremely sensitive to the electron beam and so micrographs are collected at very low electron doses to limit the radiation damage. As a result, the raw cryo-tomogram has a very low signal to noise ratio characterized by an intrinsically noisy image. To better visualize subjects of interest, conventional imaging analysis and sub-tomogram averaging in which sub-tomograms of the subject are extracted from the initial tomogram and aligned and averaged are utilized to improve both contrast and resolution. Large datasets of tilt-series are essential to understanding and resolving the complexes at different states, conditions, or mutations as well as obtaining a large enough collection of sub-tomograms for averaging and classification. Collecting and processing this data can be a major obstacle preventing further analysis. Here we describe a high-throughput cryo-ET protocol based on a computer-controlled 300kV cryo-electron microscope, a direct detection device (DDD) camera and a highly effective, semi-automated image-processing pipeline software wrapper library tomoauto developed in-house. This protocol has been effectively utilized to visualize the intact type III secretion system (T3SS) in Shigella flexneri minicells. It can be applicable to any project suitable for cryo-ET.

minicells S의 샘플 flexneri 수집 및 그림 2에 설명 된 파이프 라인을 다음 tomoauto 사용하여 회로도 그림 1에서 보여로 처리했다. 틸트 시리즈는 낮은 배율 몽타주 맵에 사용자가 지정한 지점에서 높은 처리량 틸트 계 취득 가능 SerialEM (10) (도 3)를 사용하여 수집 하였다. 현미경은 빔 유도 모션 22 ...

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Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

우리는 분자 기계 구조의 동일계에서 높은 해상도를 결정하기 위해 높은 처리량 극저온 전자 단층을 활용하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 일반적인 병목 현상을 회피, 대용량의 데이터가 처리 될 수있게하고, 사용자가 중요한 생물학적 질문에 집중할 수 있도록 자원 중단 시간을 감소시킨다.

Tomoauto 사용 : 프로토콜 높은 처리량 자동화 된 곳을 알아내는 - 전자 단층 촬영을 위해

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.8K 조회수.  University of Texas Health Science Center at Houston.  우리는 분자 기계 구조의 동일계에서 높은 해상도를 결정하기 위해 높은 처리량 극저온 전자 단층을 활용하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 일반적인 병목 현상을 회피, 대용량의 데이터가 처리 될 수있게하고, 사용자가 중요한 생물학적 질문에 집중할 수 있도록 자원 중단 시간을 감소시킨다. 

비디오: Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Biomaterials 높은 처리량 발견을위한 폴리머 Microarrays

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

연구

생체공학

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and high-fidelity measurements of large systems. Microfluidics promises to fulfill many of these requirements, such as performing high-throughput screening experiments on-chip, encompassing biochemical, biophysical, and cell-based assays1. Since the early days of microfluidics devices, this field has drastically evolved, leading to the development of microfluidic large-scale integration2,3. This technology allows for the integration of thousands of micromechanical valves on a single device with a postage-sized footprint (Figure 1). We have developed a high-throughput microfluidic platform for generating in vitro expression of protein arrays (Figure 2) named PING (Protein Interaction Network Generator). These arrays can serve as a template for many experiments such as protein-protein 4, protein-RNA5 or protein-DNA6 interactions.
The device consist of thousands of reaction chambers, which are individually programmed using a microarrayer. Aligning of these printed microarrays to microfluidics devices programs each chamber with a single spot eliminating potential contamination or cross-reactivity Moreover, generating microarrays using standard microarray spotting techniques is also very modular, allowing for the arraying of proteins7, DNA8, small molecules, and even colloidal suspensions. The potential impact of microfluidics on biological sciences is significant. A number of microfluidics based assays have already provided novel insights into the structure and function of biological systems, and the field of microfluidics will continue to impact biology.

We present a microfluidic approach for the expression of protein arrays. The device consists of thousands of reaction chambers controlled by micro-mechanical valves. The microfluidic device is mated to a microarray-printed gene library. These genes are then transcribed and translated on-chip, resulting in a protein array ready for experimental use.

마이크로 유체 플랫폼을 사용하여 높은 처리량 단백질 표현 생성기

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. The geometry of the monolith can be adapted for specific pipette tips ranging in volume from 1.0 to 5.0 ml. The large porosity of the monolith enables viscous or complex samples to readily pass through it with minimal fluidic backpressure. Bi-directional flow maximizes residence time between the monolith and sample, and enables large sample volumes to be processed within a single TruTip. The fundamental steps, irrespective of sample volume or TruTip geometry, include cell lysis, nucleic acid binding to the inner pores of the TruTip monolith, washing away unbound sample components and lysis buffers, and eluting purified and concentrated nucleic acids into an appropriate buffer. The attributes and adaptability of TruTip are demonstrated in three automated clinical sample processing protocols using an Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR and STARplus liquid handling robots, including RNA isolation from nasopharyngeal aspirate, genomic DNA isolation from whole blood, and fetal DNA extraction and enrichment from large volumes of maternal plasma (respectively).

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. Consequently, the sample preparation format is compatible with most liquid handling instruments, and can be used for many medium to high-throughput clinical applications and sample types.

일반적인 액체 취급 로봇에 TruTip 기술을 사용하여 임상 샘플에서 DNA와 RNA의 높은 처리량, 자동 추출

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip : Microarrayed 인간의 세포에서 DNA 손상을 측정하기위한 높은 처리량 96 글쎄 플랫폼

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

높은 처리량 단일 세포의 분리 및 문화를위한 미세 유체 플랫폼

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.

폴리 디메틸 실록산 박막을 사용하여 자동화 지질 이중층 제막

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

의료 기기에 대한 박테리아의 높은 처리량 식별 구충제 폴리머

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of bioprocess conditions. One important aspect is the improvement of cultivation medium to provide an optimal environment for microbial formation of the product of interest. It is well accepted that the media composition can dramatically influence overall bioprocess performance. Nutrition medium optimization is known to improve recombinant protein production with microbial systems and thus, this is a rewarding step in bioprocess development. However, very often standard media recipes are taken from literature, since tailor-made design of the cultivation medium is a tedious task that demands microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, fast product analytics, as well as support by lab robotics to enable reliability in liquid handling steps. Furthermore, advanced mathematical methods are required for rationally analyzing measurement data and efficiently designing parallel experiments such as to achieve optimal information content.
The generic nature of the presented protocol allows for easy adaption to different lab equipment, other expression hosts, and target proteins of interest, as well as further bioprocess parameters. Moreover, other optimization objectives like protein production rate, specific yield, or product quality can be chosen to fit the scope of other optimization studies. The applied Kriging Toolbox (KriKit) is a general tool for Design of Experiments (DOE) that contributes to improved holistic bioprocess optimization. It also supports multi-objective optimization which can be important in optimizing both upstream and downstream processes.

This manuscript describes a generic approach for tailor-made design of microbial cultivation media. This is enabled by an iterative workflow combining Kriging-based experimental design and microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, which is supported by lab robotics to increase reliability and speed in liquid handling media preparation.

자동화 된 Microbioreactor 기술을 사용 하 여 분리 단백질 생산의 최적화를 위한 일반 프로토콜

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

높은 처리량의 사용 모델 IgG1 조 세포에서의 생산을 위한 Microbioreactor 시스템 자동화

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain selection and by developing bioprocess parameters. Shake flasks have been used for this purpose. They, however, lack the capability to control the process parameters such as pH and dissolved oxygen (DO). This limitation can be overcome with the help of an automated micro-bioreactor. These bioreactors mimic cultivation at a larger scale. One of the major advantages of this system is the integration of the Design of Experiment (DOE) in the software. This integration enables establishing a design where multiple process parameters can be varied simultaneously. The critical process parameters and optimum bioprocess conditions can be analyzed within the software. The focus of the work presented here is to introduce the user to the steps involved in process design in the software and incorporation of the DOE within the cultivation run.

Here, we present a detailed procedure to run a Design of Experiment in an automated micro-bioreactor followed by cell harvest and protein quantification using a Protein A column.

중국 햄스터 난소 세포 재배에서 고처리량 자동화 마이크로 바이오리액터를 사용한 공정 최적화

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...