Name: epigenetic regulation of cardiac differentiation of embryonic stem cells and tissues
Uploaded: 2016-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues at JoVE.com

The authors acknowledge funding agencies, the IMI StemBANCC European community programme, the leducq Foundation (SHAPEHEART) and the Agence Nationale de la Recherche (Genopath)

1. DNA 단백질 교차 결합 <ol><li> ES 세포와 배아 심장 조직에서 생성 된 15 ml의 튜브에 고정 수확-ES 세포 (일반 칩 2 × 10 6 세포, 마이크로 칩 2 × 10 5 세포), 배아 체 (사채)을 E9.5 마우스 배아에서 해부 (방실 운하, 유출 기관 및 뇌실) 세포 또는 배아 조직에 대한 permeabilization의 PB2 버퍼에 PBS에 1 %의 포름 알데히드를 사용하여. 정확히 10 분 동안 실온에서 60 rpm의 속도로 진탕에 튜브를 놓는다. </li><li> 125 mM의 최종 농도 글리신을 첨가하여 가교 반응을 정지하고 60 rpm의 속도로 진탕 기에서 실온에서 5 분 동안 배양한다. </li></ol> 2. 세포 용해 및 염색질 조각화 <ol><li> PBS 1X 또는 배아 조직을 1 ml의 PB2에 재현 탁 ml의 두 배 (10)에 재현 탁 가교 세포를 씻으십시오. 4 ℃에서 5 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버린다. &lt;/ 리&gt; <li> PB1 또는 PB2 (2 μg의 / ㎖ 류 펩틴, 1 μg의 / ㎖ 아프로 티닌, 0.1 mM의 PMSF) (표 1) 버퍼 프로테아제 억제제를 추가합니다. 각각 버퍼 PB1 또는 PB2 1 ml의 2.1 단계에서 세포 펠렛 또는 배아 조직을 재현 탁. 피펫 상하과 세포 나 조직을 재현 탁. 세포 나 조직을 균질화 21 게이지 바늘로 1 ML의 주사기를 사용합니다. 10 분 동안 (바퀴)에 4 ° C에서 품어. </li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 3,000 XG에 스핀 다운 및 상층 액을 버린다. </li><li> 깨끗한 튜브 프로테아제 억제제가 보충 각 SB 버퍼 (표 1) 300 μL에 펠렛을 재현 탁 (RNA 분해 효소, DNase- 인증 및 발열원이없는)의 모든 DNA 저하를 방지 할 수있다. 얼음에 15 ~ 30 분 동안 품어. </li><li> 각 재료에 대해, 표 2에 나열된 프로그램에 따른 초음파 처리기를 사용하여 염색질 전단 4 ℃에서 샘플을 초음파 처리. &lt;(다음의 용도에 따라 초음파 처리 시간을 조정EM&gt; 즉, PCR 또는 시퀀싱). 전단 DNA 크기는 PCR 500 bp의 시퀀싱 300 bp의 주위해야한다. </li><li> 원심 분리기는 깨끗한 1.5 ML 튜브에 뜨는 (염색질)을 전송하고 펠렛을 폐기, 4 ° C에서 6,000 XG에 10 분 동안 세포 용 해물을 초음파. </li><li> 물로 10 회 용액 염색질 (상등액을 완충액 B)을 희석하고, 나노 분광 1.5 μL를 사용하여 광학 밀도를 평가한다. 0.76 X OD 260-1.55 X OD 280 : 다음 공식을 사용하여 μg의 / ㎕의 단백질의 농도를 얻습니다. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 완충기 </td><td> 이용 </td><td colspan="4"> 구성 </td><td> 재료 </td></tr><tr><td rowspan="2"> 에이 </td><td rowspan="2"> Permeabilization </td><td colspan="4"> PB1 : 5 밀리미터 파이프의 pH 8; 85mM의 KCl; 0.5 % NP40 </td><td> 모든 </td></tr><tr><td colspan="4"> PB2 : 15 mM의 HEPES pH가 7.6, 15 mM의 NaCl을 4 mM의 MgCl2를 60 mM의 KCl을 0.5 % 트리톤 X-100 </td><td> 배아 조직 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 비 </td><td rowspan="3"> 용해 / 초음파 처리 </td><td colspan="4"> SB1 : 1 % SDS; 10 mM의 EDTA; 50mM 트리스 - 염산 pH를 8 </td><td> ESC </td></tr><tr><td colspan="4"> SB2는 50mM HEPES-KOH pH7.9; 140 밀리미터; 를 1mM EDTA; 0.1 % 데 옥시 콜레이트; 0.1 % SDS </td><td> 사채 </td></tr><tr><td colspan="4"> SB3 : 15 mM의 HEPES pH7.6, 15 mM의 염화나트륨; 60 밀리미터의 KCl, 1mM의 EDTA, 0.5 mM의 EGTA; 1 % 트리톤 X100 0, 0.1 % SDS, 0.5 % laurylsarcosine </td><td> 배아 조직 </td></tr><tr><td> 기음 </td><td> 칩 버퍼 </td><td colspan="4"> 150 mM의 NaCl을; 50mM 트리스 - 염산 pH를 7.5; 5 mM의 EDTA; 0.5 % NP40; 1 % TRITON-X100. </td><td> 모든 </td></tr><tr><td> 디 </td><td> DNA / 단백질 용출 </td><td colspan="4"> D1 : 1 % SDS; (100)밀리미터의 NaHCO3 D2 : 50 mM 트리스 pH를 7.6 / 5 mM의 EDTA, 15 mM의 DTT, 2 % SDS </td><td></td></tr><tr><td> 이자형 </td><td> DNA 바인딩 비드 준비 </td><td colspan="4"> E : 20 % PEG 8000; 2.5 M의 NaCl; 10 mM 트리스 - 염산 pH를 8; 를 1mM EDTA </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 칩 버퍼. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 자료 </td><td> 초음파 프로그램 </td></tr><tr><td> 배아 줄기 세포 </td><td> 30 초 ON의 15주기와 OFF 30 초 </td></tr><tr><td> 배아 체 </td><td> 30 초 ON의 30주기와 OFF 30 초 </td></tr><tr><td> 배아 조직 </td><td> 30 초 ON의 21주기와 OFF 30 초 </td></tr></tbody></table> 표 2. 초음파 처리 프로그램. 3. 면역 침전 및세척 <ol><li> 버퍼 C로 3 회 단백질 A-복합 구슬을 씻으십시오. 깨끗한 1.5 ML 튜브에 비즈 100 μl를 타고 버퍼 C (표 1) 1 ㎖를 추가합니다. 튜브는 다음에 자석로 전사되고; 1 분 동안 기다린 뜨는을 대기음. 두 번 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 깨끗한 1.5 ㎖의 튜브에 프로테아제 억제제가 보충 20 ㎕의 세정 된 단백질 공역 비즈 완충액 C 1 ㎖ 변성 히스톤 또는 전사 인자 (표 3 농도)에 대해 발생 된 항체를 부화. 4 ° C에서 최소 2 시간 동안 40 rpm으로 회 전자에 샘플을 설정합니다. </li><li> 워시 항체 - 비드를 완충액 C 1 ㎖ (3.1에 ​​기재된 조작)로 3 회 복합체. </li><li> 준비 2 튜브를 함유 한 150 염색질 항체 - 구슬 단지의 μg의 세척 구슬 150 염색질의 μg의 20 μl를 포함하는 다른 관; 각 튜브에 프로테아제 억제제가 보충 완충액 C 1 ㎖를 추가4 ℃에서 하룻밤 동안 40 rpm으로 회전하는 바퀴에 샘플을 품어. 참고 : 염색질의 농도는 적어도 300 μg의는 전사 인자 또는 순차적 칩을 면역 침전 할 수 있어야합니다. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 표준 </td><td> 농도 (NG / μL) </td><td> 볼륨 (μL) </td><td> 총 DNA 농도 (NG) </td></tr><tr><td> 에이 </td><td> 10.0 </td><td> 1 </td><td> 10.0 </td></tr><tr><td> 비 </td><td> 5.00 </td><td> 1 </td><td> 5.00 </td></tr><tr><td> 기음 </td><td> 2.50 </td><td> 1 </td><td> 2.50 </td></tr><tr><td> 디 </td><td> 1.25 </td><td> 1 </td><td> 1.25 </td></tr><tr><td> 이자형 </td><td> 0.625 </td><td> 1 </td><td> 0.625 </td></tr><tr><td> 에프 </td><td> 0.3125 </td><td> 1 </td><td> 00.3125 </td></tr><tr><td> 지 </td><td> 0.156 </td><td> 1 </td><td> 0.156 </td></tr><tr><td> H </td><td> 0.0 </td><td> 1 </td><td> 0.0 </td></tr></tbody></table> 표 3. 표준 농도. 4. DNA 용출, 크로스 링크 취소 및 테 K 소화 <ol><li> 자기 랙에 샘플을 설정합니다. 언 바운드 항체 염색질을 포함하는 상층 액을 복구 할 수 있습니다. 주의 : 샘플을 신속하게 스텝 액체 질소에 냉동 -80 ℃에서 저장 될 수있다. 염색질 다른 항체와 다른 면역 분석법에 사용할 수있다. 버퍼 C 1 ㎖ (전술 조작)와 각 샘플 3 회 반복한다. </li><li> 순차 칩 세정 칩의 재료 (표 1)을 수행 할 경우 버퍼 D1 또는 D2의 150 μl를 첨가하여 항체 - 결합 된 단백질을 용출하고, 가열 블럭에서 50 ℃에서 20 분 동안 샘플을 배양한다. </li><li> 에서 튜브를 제거가열 블록 및 자기 랙에 샘플을 넣어, (RNA 분해 효소, DNase- 및 발열 물질이없는 인증) 깨끗한 1.5 ML 튜브에 뜨는을 복구하고 구슬을 버린다. </li><li> 버퍼 C 2 권 제 3 μg의 항체에 1을 가산 순차 칩 상층 액을 사용하여 200 mM의 최종 농도를 얻기 위해 5 M NaCl을 첨가하여 가교 역방향. </li><li> 깨끗한 1.5 ㎖의 튜브에 염색질의 입력 샘플을 제조 (RNA 분해 효소, DNase- 인증 및 발열 성)을 물 150 μL의 최종 부피에서 IP 샘플 (150 μg의)의 것과 염색질 동일한 양의 복용 (의 RNase DNase의 무료 물). 200 mm의 최종 농도 500의 NaCl을 추가합니다. 65 ℃에서 하룻밤 샘플을 품어. </li><li> 다음날, 가열 블록으로부터 샘플을 분리 칩 재료 250 μg / ML의 최종 농도를 수득하고, 2 시간 동안 55 ° C에서 소화 12.5 mM 내지 티나 제 K를 최종 농도를 얻기 위해 250 mM의 EDTA를 추가 가열 블록. </li></ol><ol><li> 구슬의 준비 <ol><li> 적어도 30 분, 와류에 대한 비드 철저히을 실온에서 비드를 가지고 시작한다. 비즈 정착, 그래서 피펫 팅 할 때 빠르게 작동합니다. 깨끗한 1.5 ML 튜브에 전송 구슬 1 ㎖ (RNA 분해 효소, DNase- 및 발열 물질이없는 인증). </li><li> 이 솔루션은 명확히하기 위해 3 분, 폐기 뜨는 - 자석에 설정이 기다립니다. 자석에서 제거 0.5 M EDTA 1 ㎖를 추가하고 간단한 텍싱하여 혼합한다. </li><li> 단계를 반복 5.1.2 두 번, 그리고 마지막에 상층 액을 버린다. </li><li> 자석에서 제거 버퍼 E 1 ㎖를 추가하고 천천히 구슬을 재현 탁. 쉐이커에 버퍼 E. 놓고 50 ㎖로 전 혼합 (버퍼 E 구슬)를 전송하고 실온에서 1 시간 동안 서서히 혼합 하였다. </li><li> 비드를 50 μL / DNA (1 부피 / 1 부피) 50 μL, 비드 100 ㎕ : 시험 3의 실험 조건을 이용하여 후술하는 정제 프로토콜 다음 비드 DNA 결합/ DNA의 50 μL (2 권 / 1 볼륨) 및 구슬 125 μL / DNA의 50 μL (2.5 볼륨 / 1 볼륨). 조각 (도 1a)의 크기를 확인하기 위해 1.5 % 아가 로즈 겔에서 정제 된 DNA를 이전하자. </li></ol></li><li> DNA 정제 <ol><li> 각각의 DNA 샘플 (약 170 μL)에 자석 구슬을 결합 DNA의 425 μL (2.5 권)를 추가합니다. 하 (약 10 배)를 피펫 팅에 의해 서서히 재현 탁하고 실온에서 10 분간 배양한다. </li><li> 다음 뜨는 기음과 (자석에) 폐기, 5 분 동안 자석에 놓습니다. </li><li> 1 분, 기음 뜨는를 기다리고 폐기 한 후 한 번 더 이전 단계를 반복 자석에 튜브에 갓 80 % 에탄올 600 μl를 추가합니다. </li><li> 빠른 스핀을주고 5 초 (미세 원심 분리)를 위해, 자석에 튜브를 놓고 에탄올의 마지막 방울을 제거합니다. 실온에서 1 분 동안 건조하자 </li><li> DNase의 자유의 RNase 물 20 μl를 첨가하여 DNA를 용출시킨다. 자석에서 제거하고 샘플을 소용돌이. </li><li> 실온에서 3 분 동안 품어 다음 자석에 샘플을 배치합니다. 새로운 튜브에 대기음 용출 된 DNA는 (RNA 분해 효소, DNase- 및 발열 물질이없는 인증). </li><li> DNA 단편 (도 1b)의 크기를 확인하기 위해 1.5 % 아가 로즈 겔의 입력 부분으로부터 DNA를 실행. </li></ol></li></ol> 6. DNA 정량은 형광 탐지 장비를 사용하여 <ol><li> 직렬 7 희석 플러스 노 DNA 포인트 (표 3에 모여 희석)의 총을주고 물 1 μg의 DNA를 (1킬로바이트 사다리)에 희석. </li><li> PCR 그린 I 염료 용액을 제조, 모든 샘플 (정제 DNA 및 표준 희석 AH)에 대한 충분한 : 1X TE 버퍼에서 녹색 염료를 10000 희석. </li><li> 모세 혈관의 큐벳에 10 ㎕의 1 배 녹색 염료 믹스 각각의 DNA 샘플 (정제 DNA 및 표준 희석 AH) 1 μl를 추가는 488 nm 파장에서 형광 계에서 읽을 수 있습니다. 무 DNA 분석의 경우, 1X TE 완충액 1 μl를 사용한다. </li><li> 짓다검량선 그래픽 소프트웨어를 사용하여 NG / μL의 DNA 샘플들의 범위에 대한 상대 농도를 결정한다. DNA를 PCR을위한 다음 준비 또는 시퀀싱 라이브러리를 만들 수 있습니다. </li></ol> 7. PCR <ol><li> 프라이머의 선택 <ol><li> 관심의 디자인 프라이머는 관심의 게놈 영역을 심문한다. 프라이머 디자인은 UCSC 게놈 브라우저를 사용하여 유전자의 인핸서 영역을 증폭한다. 증강은 더 GEO 데이터 세트에서 9 자료 없음 H3K4me1 또는 P300 칩-서열을 이용하여 예측된다. </li></ol></li><li> PCR <ol><li> 45 사이클 (8 초 ~ 95 ° C, 8 초, 60 ℃, 8 초 72 ° C) 25 μL 녹색 색소 혼합이 NG의 DNA 및 0.5 ㎕를 프라이머 믹스 실시간 PCR 용 열 순환기를 사용하는 실행 PCR 반응 (20 μM 원액) 10. </li></ol></li><li> 농축 분석 <ol><li> 뉴 클레오의 최대 1 %가 11 면역 있다고 가정하고 절대 농축을 계산합니다. </li><li> ConsideR 입력 DNA의 0.1 NG에 비해 10 NG의 IP 샘플이 큰 농축을 보여 주면 농축으로 게놈. </li><li> 비특이적 대조군 샘플과 입력 및 조정을 정상화 비 농후 영역 위에 농축의 배 증가와 같은 결과를 표현한다. </li><li> 입력 DNA가 100 (희석 배수 또는 DF)에 의해 희석 될 것이 좋습니다. </li><li> 코네티컷 [DF X 입력] - 다음의 수학 식 2 -ΔCt × 100 % -ΔCt = 코네티컷 [IP]를 사용하여 입력을 정상화. </li><li> 다음 식을 이용하여 제어를 조정 (ΔCT [IP] -ΔCt [NS]) NS는 비특이적 샘플 (항체없는 IP 또는 IgG의 IP)는이다. </li><li> 2 -ΔΔCt로 샘플의 배 농축을 계산합니다. 각 PCR 샘플 결과의 분석을 용이하게 입력 할 수있는 방식으로 모든 계산 단계를 포함하는 파일. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

후성 유전학이 발달 생물학 연구의 중요한 분야가되고있다. 유전 적 프로그램이 배아 혈통 내에서 특정 ID를 인수로 셀 수 있도록 배아 세포에서 활성화하는 방법을 오랜 시간 동안 발달 생물 학자에 대한 핵심적인 질문이었다. 칩은 크게 마지막 년 이내에 사용 순서의 해상도 향상 다음 DNA 염기 서열에 결합하고있다. 이 넓은 의존적으로 게놈의 셀 또는 특정 배아 및 성인 조...

<html> 심장은 제 장기가 형성 될 상기 배아 기능하게하는 것이다. 심장은 제 1 및 제 2 배아 심장 필드 1에서 발생하는 많은 세포 계통에서 만들어집니다. 후 시비 배반포는 모양의 마음까지 무대에서 배아 세포는 많은 세포 운명 결정을하는 것이 있습니다. 유전자 전사는 시간과 공간에 의존하는 방식으로 규제 및 배아 개발하는 동안 세포 운명 결정의 기초가 중요한 생물학적 과정이다. 이러한 공정은 증강 및 심근 구조적 유전자의 프로모터를 포함하는 게놈 내에서 조절 영역을 특정 결합 전사 인자에 의해 매개된다. DNA는 예컨대 아세틸 화, 메틸화, ubiquitinylation 및 / 또는 인산화와 같은 변형을 실시 히스톤 감싸된다. 히스톤 변형 히스톤의 리신 잔기 (2) 개질 된 따라 활성화 또는 억압 태세 유전자 전사를 이끈다. jove_content &quot;&gt; 염색질 면역 분석법 (칩) 년전 3 설정된 가장 광범위하게 사용되는 기술은 수정 된 히스톤 또는 전사 인자 4. 히스톤 또는 전사 인자의 면역 따라 하나의 타겟을 식별하기 위해 현재, 결합 된 DNA 일 수있다 어느 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭 또는 염기 서열. 칩은 기술적으로 어려운 겔 지연 분석법 (5)를 극복하고있다. 그러나 칩 DNA 겔 지연 분석법의 장점에 대한 전사 인자의 결합을 직접적으로 암시하지 않는다. 한편, 칩상의 DNA 염기 서열에 결합하여 유전자 조절에 대한 새로운 게놈 넓은 시각을 열었습니다. ES 세포 (ES 세포) 배양체 내 요점을 되풀이 (즉. 세포 응집체) 또는 2D 배양 심근 6 개발의 초기 단계에서 및 칩 원리 충분한 재료에 제공한다. 또한, 인간 ES 세포는 CA의 인간 세포 모델을 나타낸다자신의 심인성 가능성이 있지만 rdiogenesis은 후생 유전 학적 서명 (7)에 따라 달라집니다. 개발의 나중 단계에서 마우스 배아 조직 세포 정체성의 결정에 필요한 특정 후생 유전 학적 풍경을 조사를 허용합니다. 그러나, 게놈은 시간과 세포 유형 특정 방식으로 8 전사된다. 유전자 전사의 성적인 규제는 지역화 된 영역 내에서 연구되어야한다. 여기서, 우리는 PCR 또는 시퀀싱 ES 세포, 배아 체 심장 특정 배아 영역을 사용하여 다음 칩, 연속 칩의 프로토콜을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 심장 유전자 전사의 후생 유전 학적 조절 조사를 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Formaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>Cell Fixation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>Cross-link stop</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Fluka</td><td>10820</td><td>Proteases inhibitor</td></tr><tr><td>Leupeptin hemisulfate</td><td>Sigma</td><td>L2882</td><td>Proteases inhibitor</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>Proteases inhibitor</td></tr><tr><td>Protein A magnetic beads&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>10001D</td><td>Immunoprecipitation</td></tr><tr><td>SPRI magnetic beads</td><td>Thermo Scientific</td><td>15002-01</td><td>DNA purification</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Life technologies</td><td>25530-015</td><td>Protein digestion&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DNA BR standard&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>Q32850</td><td>Calibration range&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Syber green</td><td>Molecular Probes</td><td>S-11484</td><td>DNA quantification</td></tr><tr><td>TE buffer&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>DNA quantification</td></tr><tr><td>PBX 1x</td><td>Life technologies</td><td>14190-094</td><td>Washing</td></tr><tr><td>DNase RNase free water</td><td>Life technologies</td><td>10977-035</td><td>Dilution</td></tr><tr><td>Axygen tube</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td>ChIP purifiction</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibody&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Reference&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;ChIP concentration&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>H3K27ac</td><td>Abcam</td><td>ab4729</td><td>3 &amp;micro;g for ESC and EBs, 1 &amp;micro;g for tissues</td></tr><tr><td>H3K4me1</td><td>Diagenode</td><td>C15410194 (pAb-194-050)</td><td>3 &amp;micro;g for ESC and EBs, 1 &amp;micro;g for tissues</td></tr><tr><td>H3K36me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410058 (pAb-058-050)</td><td>3 &amp;micro;g for ESC and EBs, 1 &amp;micro;g for tissues</td></tr><tr><td>H3K9me2</td><td>Diagenode</td><td>C15410060 (pAb-060-050)</td><td>3 &amp;micro;g for ESC and EBs, 1 &amp;micro;g for tissues</td></tr><tr><td>H3K4me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410030 (pAb-030-050)</td><td>3 &amp;micro;g for ESC and EBs, 1 &amp;micro;g for tissues</td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410069 (pAb-069-050)</td><td>3 &amp;micro;g for ESC and EBs, 1 &amp;micro;g for tissues</td></tr></tbody></table>

epigenetic regulation of cardiac differentiation of embryonic stem cells and tissues

특정 유전자 전사는 배아 개발하는 동안 세포 운명 결정의 기초가 중요한 생물학적 과정이다. 생물학적 공정은 증강 및 심근 구성 적 유전자의 프로모터를 포함 유전자 조절 영역을 결합 전사 인자에 의해 매개된다. DNA는 화학적 변형을 실시한다 히스톤 주위에 싸여있다. 히스톤의 수정은 추가하여 유전자 전사의 미세 조정 규제의 또 다른 레벨을 가져, 활성화, 억압 또는 태세 유전자 전사로 이어집니다. 배아 줄기 세포 (ES 세포)가 심장 개발의 초기 단계에 배양체 (즉, 세포 집합체) 내에 또는 2D 배양 요점을 되풀이. 그들은 염색질 면역 침전 (칩)를위한 원칙 충분한 재료 제공, 기술은 크게 유전자 조절 영역을 식별하는 데 사용. 또한, 인간 ES 세포 cardiogenesis의 인간 세포 모델을 나타낸다. 개발의 나중 단계에서 마우스 배아 조직을 허용셀 정체성 결정에 필요한 특정 후생 유전 학적 풍경을 조사. 여기서, 우리는 PCR 또는 ES 세포, 배아 체 심장 특정 배아 영역을 사용하여 칩 시퀀싱 뒤에 칩, 연속 칩의 프로토콜을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 심장 유전자 전사의 후생 유전 학적 조절 조사를 할 수 있습니다.

도 1a는 제 DNA 결합 비즈 다른 크기 (1킬로바이트 사다리)의 DNA를 이용하여 품질 관리의 제조를 예시한다. 0ne, 구슬이 2.5 부피 (1 내지 3)는 고 및 저 분자량 크기의 DNA 단편을 정제 할 수있는 샘플의 하나의 볼륨에 첨가 하였다. 도 1 B, C, D는 각각 마우스 ES 세포 또는 배아 체 (25 E9.5 심실 풀링) 배아 심장 ...

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Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

유전자 전사의 미세 조정 규정은 배아 세포 운명 결정의 기초가. 여기서, 우리는 줄기 세포와 마우스 배아 심장 개발 모두 심장 분화의 후생 유전 학적 조절을 조사하기 위해 사용 염색질 면역 침전 분석법을 설명한다.

배아 줄기 세포와 조직의 심장 차별화의 성적인 규정

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.0K 조회수.  Université Aix-Marseille.  유전자 전사의 미세 조정 규정은 배아 세포 운명 결정의 기초가. 여기서, 우리는 줄기 세포와 마우스 배아 심장 개발 모두 심장 분화의 후생 유전 학적 조절을 조사하기 위해 사용 염색질 면역 침전 분석법을 설명한다. 

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Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

배아 줄기 세포에서 심장 전구 세포의 유도

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

연구

발생학

Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed phenotypes. Researchers interested in pursuing studies involving specific myocyte subtypes require a more directed differentiation approach. By treating mouse embryonic stem (ES) cells with Grem2, a secreted BMP antagonist that is necessary for atrial chamber formation in vivo, a large number of cardiac cells with an atrial phenotype can be generated. Use of the engineered Myh6-DSRed-Nuc pluripotent stem cell line allows for identification, selection, and purification of cardiomyocytes. In this protocol embryoid bodies are generated from Myh6-DSRed-Nuc cells using the hanging drop method and kept in suspension until differentiation day 4 (d4). At d4 cells are treated with Grem2 and plated onto gelatin coated plates. Between d8-d10 large contracting areas are observed in the cultures and continue to expand and mature through d14. Molecular, histological and electrophysiogical analyses indicate cells in Grem2-treated cells acquire atrial-like characteristics providing an in vitro model to study the biology of atrial cardiomyocytes and their response to various pharmacological agents.

Generating cardiomyocytes from pluripotent stem cells in vitro allows access to large amounts of cardiac tissue in vitro for basic science and clinical applications. This protocol uses the atrializing factor Grem2 to both increase the numbers of cardiomyocytes obtained and to generate cardiomyocytes with an atrial phenotype.

BMP 길항제 Grem2를 사용하여 다 능성 줄기 세포에서 심방 심근의 차별화

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed ...

Aggregate Size Optimization in Microwells for Suspension-based Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates. Conventional aggregate formation of hPSCs involves dissociating cell colonies into smaller clumps, with size control of the clumps crudely controlled by pipetting the cell suspension until the desired clump size is achieved. One of the main challenges of conventional aggregate-based cardiac differentiation of hPSCs is that culture heterogeneity and spatial disorganization lead to variable and inefficient cardiomyocyte yield. We and others have previously reported that human embryonic stem cell (hESC) aggregate size can be modulated to optimize cardiac induction efficiency. We have addressed this challenge by employing a scalable, microwell-based approach to control physical parameters of aggregate formation, specifically aggregate size and shape. The method we describe here consists of forced aggregation of defined hPSC numbers in microwells, and the subsequent culture of these aggregates in conditions that direct cardiac induction. This protocol can be readily scaled depending on the size and number of wells used. Using this method, we can consistently achieve culture outputs with cardiomyocyte frequencies greater than 70%.

Conventional methods to initiate suspension aggregate based cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) are plagued with culture heterogeneity with respect to aggregate size and shape. Here, we describe a robust method for cardiac differentiation employing microwells to generate size-controlled hPSC aggregates cultured under cardiac-promoting conditions.

인간 다 능성 줄기 세포의 서스펜션 기반의 심장 차별화를위한 마이크로 웰의 집계 크기 최적화

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates.  Conventional aggregate formation ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage specification. In particular, the conversion of fibroblasts into induced cardiomyocyte-like myocytes (iCLMs) by Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 (GHMT) represents an important avenue for generating de novo cardiac myocytes in vitro and in vivo. Recent evidence suggests that GHMT generates a greater diversity of cardiac subtypes than previously appreciated, thus underscoring the need for a systematic approach to conducting additional studies. Before direct reprogramming can be used as a therapeutic strategy, however, the mechanistic underpinnings of lineage conversion must be understood in detail to generate specific cardiac subtypes. Here we present a detailed protocol for generating iCLMs by GHMT-mediated reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEFs). 
We outline methods for MEF isolation, retroviral production, and MEF infection to accomplish efficient reprogramming. To determine the subtype identity of reprogrammed cells, we detail a step-by-step approach for performing immunocytochemistry on iCLMs using a defined set of compatible antibodies. Methods for confocal microscopy, identification, and quantification of iCLMs and individual atrial (iAM), ventricular (iVM), and pacemaker (iPM) subtypes are also presented. Finally, we discuss representative results of prototypical direct reprogramming experiments and highlight important technical aspects of our protocol to ensure efficient lineage conversion. Taken together, our optimized protocol should provide a stepwise approach for investigators to conduct meaningful cardiac reprogramming experiments that require identification of individual CM subtypes.

This manuscript describes a step-by-step protocol for the generation and quantification of diverse reprogrammed cardiac subtypes using a retrovirus-mediated delivery of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5.

마우스 배아 섬유 아 세포의 전사 인자 매개 재 프로그래밍에 따라 심근 서브 타입을 평가

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs)

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) are increasingly recognized as having great value for modeling cardiovascular diseases in humans, especially arrhythmia syndromes. They have also demonstrated relevance as in vitro systems for predicting drug responses, which makes them potentially useful for drug-screening and discovery, safety pharmacology and perhaps eventually for personalized medicine. This would be facilitated by deriving hPSC-CMs from patients or susceptible individuals as hiPSCs. For all applications, however, precise measurement and analysis of hPSC-CM electrical properties are essential for identifying changes due to cardiac ion channel mutations and/or drugs that target ion channels and can cause sudden cardiac death. Compared with manual patch-clamp, multi-electrode array (MEA) devices offer the advantage of allowing medium- to high-throughput recordings. This protocol describes how to dissociate 2D cell cultures of hPSC-CMs to small aggregates and single cells and plate them on MEAs to record their spontaneous electrical activity as field potential. Methods for analyzing the recorded data to extract specific parameters, such as the QT and the RR intervals, are also described here. Changes in these parameters would be expected in hPSC-CMs carrying mutations responsible for cardiac arrhythmias and following addition of specific drugs, allowing detection of those that carry a cardiotoxic risk.

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes hPSC-CMs Using Multi-electrode Arrays MEAs

Electrophysiological characterization of cardiomyocytes derived from human Pluripotent Stem Cells (hPSC-CMs) is crucial for cardiac disease modeling and for determining drug responses. This protocol provides the necessary information to dissociate and plate hPSC-CMs on multi-electrode arrays, measure their field potential, and a method for analyzing QT and RR intervals.

다중 전극 배열 (MEAs)을 이용한 인간 다 능성 줄기 세포 유래 심근 세포 (hPSC-CMs)의 전기 생리 학적 분석

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading cause of mortality worldwide. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising option for cell-based therapies to replace current, invasive techniques. MSCs can differentiate into mesenchymal lineages, including cardiac cell types, but complete differentiation into functional cells has not yet been achieved. Previous methods of differentiation were based on pharmacological agents or growth factors. However, more physiologically relevant strategies can also enable MSCs to undergo cardiomyogenic transformation. Here, we present a differentiation method using MSC aggregates on cardiomyocyte feeder layers to produce cardiomyocyte-like contracting cells.
Human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs) have been shown to have a greater differentiation potential than commonly investigated MSC types, such as bone marrow MSCs (BMSCs). As an ontogenetically younger source, we investigated the cardiomyogenic potential of first-trimester (FTM) HUCPVCs compared to older sources. FTM HUCPVCs are a novel, rich source of MSCs that retain their in utero immunoprivileged properties when cultured in vitro. Using this differentiation protocol, FTM and term HUCPVCs achieved significantly increased cardiomyogenic differentiation compared to BMSCs, as indicated by the increased expression of cardiomyocyte markers (i.e., myocyte enhancer factor 2C, cardiac troponin T, heavy chain cardiac myosin, signal regulatory protein &#945;, and connexin 43). They also maintained significantly lower immunogenicity, as demonstrated by their lower HLA-A expression and higher HLA-G expression. Applying aggregate-based differentiation, FTM HUCPVCs showed increased aggregate formation potential and generated contracting cells clusters within 1 week of co-culture on cardiac feeder layers, becoming the first MSC type to do so. 
Our results demonstrate that this differentiation strategy can effectively harness the cardiomyogenic potential of young MSCs, such as FTM HUCPVCs, and suggests that in vitro pre-differentiation could be a potential strategy to increase their regenerative efficacy in vivo.

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Here, we present a method to efficiently harness the cardiac differentiation potential of young sources of human mesenchymal stem cells in order to generate functional, contracting, cardiomyocyte-like cells in vitro.

생체 외에서 기능 Cardiomyocyte-같은 세포로 인간 중간 엽 줄기 세포의 분화

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways. One of the hurdles to its understanding has been the varied methods in correlating changes of key signaling events to differentiation efficiency. We describe here the use of a mouse embryonic stem (ES) cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. By scoring for contracting embryonic bodies (EBs) in a 96-well plate format, we can quickly quantify cardiogenic efficiency and identify crucial time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation in a time course following specific modulator treatments. The principal outlined here is not limited to cardiac induction alone, and can be applied towards the study of many other cell lineages. In addition, the 96-well format has the potential to be further developed as a high throughput, automated assay to allow for the testing of more sophisticated experimental hypotheses.

We describe the use of a mouse ES cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&#946;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. The method provides a standardized platform that reliably quantifies cardiogenic efficiency, and it is applicable to the study of other cell lineages.

Cardiogenic 유도 효율을 Quantifying에 대한 수정 마우스 배아의 줄기 세포 기반 어세이

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

생물학

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the heart, and improving strategies to accurately model heart disease. The potential of exploiting human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology to generate cardiac muscle &#8220;in a dish&#8221; for these applications continues to generate high enthusiasm. In recent years, the ability to efficiently generate cardiomyogenic cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) has greatly improved, offering us new opportunities to model very early stages of human cardiac development not otherwise accessible. In contrast to many previous methods, the cardiomyocyte differentiation protocol described here does not require cell aggregation or the addition of Activin A or BMP4 and robustly generates cultures of cells that are highly positive for cardiac troponin I and T (TNNI3, TNNT2), iroquois-class homeodomain protein IRX-4 (IRX4), myosin regulatory light chain 2, ventricular/cardiac muscle isoform (MLC2v) and myosin regulatory light chain 2, atrial isoform (MLC2a) by day 10 across all human embryonic stem cell (hESC) and hiPSC lines tested to date. Cells can be passaged and maintained for more than 90 days in culture. The strategy is technically simple to implement and cost-effective. Characterization of cardiomyocytes derived from pluripotent cells often includes the analysis of reference markers, both at the mRNA and protein level. For protein analysis, flow cytometry is a powerful analytical tool for assessing quality of cells in culture and determining subpopulation homogeneity. However, technical variation in sample preparation can significantly affect quality of flow cytometry data. Thus, standardization of staining protocols should facilitate comparisons among various differentiation strategies. Accordingly, optimized staining protocols for the analysis of IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, and TNNT2 by flow cytometry are described.

The article describes the detailed methodology to efficiently differentiate human pluripotent stem cells into cardiomyocytes by selectively modulating the Wnt pathway, followed by flow cytometry analysis of reference markers to assess homogeneity and identity of the population.

유동 세포 계측법에 의한 고효율 심근에 인간 다 능성 줄기 세포의 분화 및 특성

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...