We thank Dr. Peter Zandstra, in whose laboratory this protocol was developed, and Drs. Mark Gagliardi and Gordon Keller who provided assistance in establishing the initial methods on which this process was based. Protocol development was supported by an Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology to C.B. and a grant from the Heart and Stroke Foundation of Ontario to Peter Zandstra.

중간 구성 요소 1. 준비 <ol><li> 워시 매체를 준비합니다. DMEM / F12 100 ㎖ 당 1 100X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (PEN / 패 혈성)의 ㎖, 100X L- 글루타민 1 ㎖ 혈청 대체 5 mL를 추가한다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 화학적으로 기저 심장 유도 매체를 준비합니다. </li><li> 이 프로토콜에서 사용되는 미디어 다음 재고 시약을 준비합니다. <ol><li> L- 아스코르브 산가 : 원뿔 튜브에 4 ° C, 멸균 울트라 순수한 증류수 ㎖의 당 5 밀리그램의 재고 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 얼음에이 솔루션을두고 용질이 완전히 용해 될 때까지 주기적으로 튜브를 소용돌이. 필터 멸균 0.22 ㎛의 주사기 필터를 사용하여 아스코르브 산 용액. </li><li> 아스코르브 산 용액 1 ml의 분취 량을 준비하고 -20 ℃에서 분취 액이 저장한다. 때마다 매체를 준비 갓 해동 나누어지는을 사용합니다. </li></ol></li><li> 매체 제조 당일기저 심장 유도 보통 1 ㎖에 monothioglycerol (MTG) 13 μL 희석. 사용하지 않는, 희석 MTG 폐기하십시오. </li><li> -20 ℃에서 저장 트랜스페린 (30 ㎎ / ㎖) 1 ml의 분취 량을 준비한다. 스토어는 최대 3 개월 동안 4 ° C에서 분취 량을 해동. </li><li> 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 4 mM의 염산 (HCL)을 준비한다. 흄 후드에서, 초순수, 증류수 50 ml의 6.0 N HCl 용액 30 μL를 추가한다. 필터 멸균 0.22 ㎛의 주사기 필터를 사용하여 용액. 50 ml의 HCl 용액에 25 % BSA 용액 2 ㎖를 추가합니다. </li><li> 0.1 % BSA를 함유하는 인산염 완충 식염수 (PBS)를 준비한다. ml의 PBS 당 25 % BSA 용액 20 μl를 추가합니다. </li><li> 인간의 뼈 형태 형성 단백질 4 (BMP-4) 원액 (10 NG / μL)를 준비합니다. 0.1 % BSA를 함유하는 4 mM의 염산 완충액 1 ㎖에서 BMP-4 10 μg의 동결을 녹인다. -20 ° C에서 저장하는 50 μl의 분취 량을 준비합니다. </li><li> 인간 섬유 아세포 성장 인자 2 (bFGF를) 원액을 준비(10 NG / μL). 0.1 % BSA를 함유하는 인산염 완충 식염수 1 ㎖ (PBS) 10 μg의 동결 건조의 bFGF를 녹인다. -20 ° C에서 저장하는 50 μl의 분취 량을 준비합니다. </li><li> 인간의 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 원액 (5 NG / μL)를 준비합니다. 0.1 % BSA를 함유하는 PBS 1 ㎖에 5 μg의 동결 건조 된 VEGF를 녹인다. -20 ° C에서 저장하는 50 μl의 분취 량을 준비합니다. </li><li> 티빈에게 원액 (10 NG / μL)를 준비합니다. 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 PBS 1 ㎖에 티빈 동결 10 μg의 용해. -20 ° C에서 저장하는 50 μl의 분취 량을 준비합니다. </li><li> 이 Wnt 생산-2 (IWP-2) 원액 (10 밀리미터)의 억제제를 준비합니다. 429 ㎕의 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 2 mg을 IWP-2를 녹여. -80 ° C에서 저장하는 10 μl의 분취 량을 준비합니다. </li></ol></li><li> 전체 심장 유도 매체를 준비합니다. 기저 심장 유도 보통 100 ㎖, 1 ~ 100X 펜 / ml의 스트렙토, 100X L- 글루타민 1 ㎖, 트랜스페린의 500 μL, 추가 1신선하게 해동 아스코르브 산 용액 및 MTG 300 μL. 사용되지 않는 매체를 폐기하십시오. </li></ol> 마이크로 웰 플레이트 2. 준비 참고 : 모든 단계가 생물 안전 캐비닛에서 수행해야합니다. <ol><li> 접시에 사용되는 각 웰에 0.5 ml의 세척 용액 (키트의 구성 요소)를 추가합니다. 용액 연락처 각 마이크로 웰의 내부 표면 전체를 2 분 동안 840 XG에 플레이트를 원심 분리되도록한다. </li><li> 실온에서 30 ~ 60 분 동안 접시를 품어. </li><li> 우물에서 세척 용액을 대기음. 다음과 같이 각 웰에 두 번 씻으 : 각 웰에 PBS 1 ml의 추가, 원심 분리기 판을 2 분 동안 840 XG에 다음 PBS를 대기음. </li></ol> hPSC 3. 형성은 마이크로 웰 플레이트에서 집계합니다 참고 : 모든 단계가 생물 안전 캐비닛에서 수행해야합니다. <ol><li> 37 ° C의 물을 욕조에 세척 매체를 놓습니다. 참고 : 볼륨은 HP의 우물 = 1 ML의 X 번호를 요구해리 될 것이다 SC. </li><li> 하나의 세포에 hPSCs을 떼어 놓다 참고 :이 단계는 6 웰 플레이트에서 배양 세포의 분리를 설명 - 시약의 볼륨은 서로 다른 문화 형식에 대해 비례 적으로 확장 할 수 있습니다. <ol><li> 각 hPSC 문화에서 잘 해리의 문화 매체를 기음. 분해 효소 1 ㎖로 각 웰을 헹군 후 즉시 각 웰의 분해 효소 대기음. 주 : 잔류 분해 효소는 세포를 해리하기에 충분해야한다. </li><li> 3 분 37 ° C에서 접시를 품어. </li><li> 각 웰에 세척 보통 1 ㎖를 첨가하고 기계적 조직 배양 표면 위에 P1000의 micropipettor로 세척 중간 피펫 팅하여 조직 배양 표면에서 세포를 해리. 해리가 완료되지 않은 세포 덩어리가 남아있는 것으로 나타나는 경우,이 시점에서 스트레이너를 통해 정지를 전달합니다. </li><li> 15 ML 원뿔 관 및 저장에 세포 현탁액을 전송인큐베이터에서 튜브는 셀 수는 다음 단계에서 수행된다. </li><li> 셀 카운트를 수행합니다 <ol><li> 이전 단계에서 수집 된 세포 현탁액 10 μL 샘플을보십시오. 트리 판 블루의 30 μl를 추가하고 피펫으로 잘 현탁액을 섞는다. </li><li> 혈구의 각 실에 트리 판 블루 염색 된 세포의 10 μl를 전송하고 10 배 목적으로 반전 현미경으로 시각화. 세포를 계산합니다. </li></ol></li><li> 셀 카운트 결과로부터, 마이크로 웰 플레이트의 웰 당 1.2 × 106 세포로 시딩 수 잇는 웰 구한다. 계산 집계 매체는 물론 당 1 ml의에서 세포를 배정해야합니다. </li><li> 집계 매체를 준비합니다. 전체 심장 유도 보통 10 ㎖, 당 BMP4 원액 0.5 μL (최종 농도 = 0.5 NG / ㎖) 및 Y-27632 ROCK 억제제 (최종 농도 = 10 μM)를 추가합니다. </li><li> 인큐베이터와 centrifu에서 hPSCs를 포함하는 원뿔 튜브를 제거GE의 5 분 200 XG에 튜브. 세척 매질 대기음 용액 당 1.2 × 106 세포의 밀도로 응집 매질에서 세포를 재현 탁. </li><li> 마이크로 웰 플레이트의 각 웰에서 PBS 세척 용액을 대기음. 균등하게 분배하고 잘 마이크로 웰 플레이트에 각 세포 현탁액의 씨앗 1 ml를하는 P1000의 micropipettor를 사용하여. 웰 다수 시드 주기적 침강 방지 세포 현탁액을 소용돌이. </li><li> 5 분 동안 200 XG에서 접시를 원심 분리기. 세포는 각각의 마이크로 웰의 바닥에 방사 한 확인하기 위해 현미경으로 접시를 관찰한다. </li><li> 5 % CO 2, 5 % O 2 (저산소증) 인큐베이터에서 37 ℃에서 24 시간 동안 플레이트를 인큐베이션. </li></ol></li></ol> 4. 심장 유도 1 단계 <ol><li> 집계 다음의 어느 날 (1 일), (우물, 볼륨 = 1 ML의 X 번호 24 웰 플레이트 용) 1 단계 유도 매체의 필요한 볼륨을 준비합니다. 전체 1 ㎖를 들어심장 유도 매체, BMP4 스톡 용액 (최종 농도 = 10 NG / ㎖) 1 μL, bFGF의 스톡 용액 (최종 농도 = 5 NG / ㎖) 0.5 μL와 티빈 (A)의 0.6 μl를 추가 (최종 농도 = 6 NG / ㎖). 적어도 15 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 매체를 넣습니다. </li><li> 인큐베이터에서 마이크로 웰 플레이트를 제거합니다. 현미경 집계를 검사합니다. 즉시 후 원심 분리기 집계에 비해, 그들은 부드러운 가장자리 (더 라운드 전날보다 작은 광장)에 그대로 나타납니다. </li><li> 마이크로 웰 내부의 집계를 방해하지 않고 뜨는을 제거 : <ol><li> 수평 레벨을 마이크로 웰 플레이트를 잡고 (예.,을 기울이지 않는다). 각 웰 마이크로 웰 플레이트에 대해, 배지의 표면에 상기 웰의 가장자리에 대해 P1000의 micropipettor의 선단을 배치. </li><li> 천천히 마이크로 웰의 하단에있는 집계를 방해하지 않도록주의, 배지를 제거합니다. t을 감소 후텍스쳐 마이크로 웰의 표면으로부터 약 1 내지 2 mm로 그 중간 레벨 서서히 볼륨이 충분히 낮아지면 유체 운동이 크게 감소 웰 (일측에 매체를 수집 플레이트를 기울여 드러내 점점 응집을 방지하기 쉽다는 ) 개별 마이크로 웰의 아웃. 천천히 잘 남아있는 매체를 피펫. </li></ol></li><li> 집계는 개별 마이크로 웰에 남아 확보하면서 신선한 1 단계 유도 매체를 추가하려면 다음과 P1000의 micropipettor와 함께 1 단계 유도 배지 1 ㎖을 그립니다. 우물의 안쪽 가장자리에 피펫 팁을 잡고 아주 천천히 잘의 내부 벽에 매체를 분배. 나머지 우물에 대해 반복합니다. </li><li> 3 일 저산소 조건에서 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다. </li></ol> 5. 심장 유도 2 단계 <ol><li> 하루에 4 일, 장소는 15 분의 최소 37 ° C의 물을 욕조에 (우물의 부피 = 수 × 2 ㎖) 매체를 씻는다. </li><li> (최종 농도 = 10 NG / ㎖) VEGF 원액의 2 μl를 추가, 전체 심장 유도 중간 ml의 당 0.5 ㎕를 IWP-2 : 2 단계 유도 중간 (우물 × 1 ml의 부피 = 수)의 필요한 양을 준비 주식 솔루션 (최종 농도 = 5 μM). 15 분의 최소 37 ° C를 물을 욕조에 준비된 2 단계 유도 매체를 넣습니다. </li><li> 5 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여 마이크로 웰 플레이트의 각 웰에서 집계를 수확하고 원뿔 튜브 (15 ML 튜브 당 10 우물까지 수집) 15 용액에 집계 정지를 수집합니다. </li><li> 집계가 저산소 배양기에서 15 분 동안 정착하도록 허용합니다. 참고 :이 단계는 그대로 집계에서 단일 세포와 세포 파편을 분리하는 것이 중요합니다. </li><li> 잔류 유도 사이토 카인을 제거하기 위해 미리 예열 워시 보통 10 ㎖의 집계를 조심스럽게 뜨는을 기음과 재현 탁 (예를 들면, 티빈 A는 심지어 매우 낮은 공에 강력한 신호 분자이다ncentrations). </li><li> 2 분 50 XG에서 집계를 원심 분리기. 뜨는을 대기음. 예비 가온이 유도 매체에 펠렛을 재현 탁 집합체. </li><li> 물론 당 1 ml의에서 24도 초저 첨부 파일 (ULA) 판에 집계 정지를 전송합니다. 유니폼, 꽉 세포 클러스터와 현미경으로 집계을 준수하십시오. 6 일까지 저산소 조건에서 품어. </li></ol> 6. 심장 유도 3 단계 <ol><li> 하루 6 일, 3 단계 유도 중간 (우물 × 1 ml의 부피 = 수) 필요한 볼륨을 준비합니다. 전체 심장 유도 중간 1ml를 들어, 2 μL VEGF 스톡 용액 (최종 농도 = 10 NG / ㎖), 및 bFGF의 스톡 용액 (최종 농도 = 5 NG / ㎖) 0.5 μl를 추가한다. 15 분의 최소 37 ° C를 물을 욕조에 준비 3 단계 유도 매체를 넣습니다. </li><li> 총 10 ㎖까지 풀링, 15 ml의 원뿔 튜브 응집체를 전송하는 데 5 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여튜브 당들. </li><li> 집계가 정착하는 10 분을 허용합니다. 뜨는을 기음과 미리 예열 3 단계 유도 중간에 집계를 재현 탁. 5 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여, 잘 당 1 ml의에서 24 웰 ULA 판으로 집계 재배포. </li><li> 10 일에, 3 단계 유도 중간 단계 6.1에 따라 (우물 × 1 ml의 부피 = 수) 필요한 볼륨을 준비합니다. </li><li> 튜브 당 집계 10 ㎖까지 풀링, 15 ML 원뿔 튜브 응집체를 전송하는 데 5 ml의에게 혈청 학적 피펫을 사용합니다. </li><li> 집계가 정착하는 10 분을 허용합니다. 뜨는을 기음과 3 단계 유도 중간에 집계를 재현 탁. 5 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용하여, 잘 당 1 ml의에서 24 웰 ULA 판으로 집계 재배포. </li><li> 이틀 동안 저산소증 조건 하에서 인큐베이션. 일 12 일 배양 기간의 나머지 (37 ° C, 20 % O 2, 5 % CO 2)에 대한 정상 산소의 산소 농도에서 세포를 배양하기. 노트:이 시점 후에, 세포가 더 이상 저산소증 조건 하에서 배양 없다. </li><li> 이 완전 배지 교환을 반복 세포 수확까지 14 일부터 4 일마다 (6.2 및 6.3 단계) (일반적으로, 피크 심근 농도는 차별화의 14 일 후 관찰된다). </li></ol> 심장 트로포 닌 T (cTnT를) 마이크로 웰 문화 출력의 발현 빈도 7. 유동 세포 계측법 분석 <ol><li> 다음과 같이 집계를 떼어 놓다 : <ol><li> 15 ML 원뿔 튜브에 집계 1도를 전송하는 데 5 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용합니다. 2 분 50 XG에서 집계을 원심 분리기 조심스럽게 뜨는을 대기음. </li><li> 집계에 갓 용해 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 유형 II 솔루션 1 ML을 추가합니다. 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 집계 정지를 전송합니다. 실온에서 하룻밤 동안 콜라게나 제 II 형의 응집체 부화. </li><li> 다음 날, 부드럽게 집계를 떼어 놓다하기 위해 P1000의 micropipettor를 사용균질 한 단일 세포 현탁액. 집계가 쉽게 해리하지 않는 경우, 집계를 정착 뜨는을 대기음하고, 실온에서 1 ~ 2 분 동안 해리 효소의 700 μL의 집계를 품어. 조심스럽게 해리 할 수있는 P1000의 micropipettor으로 집계 1 ~ 2 번 피펫. </li><li> 해리 효소를 희석 : 1 ㎎ / ㎖ DNase의 원액 14 μl를 포함하는 세척 매체의 700 μl를 추가합니다. 2 분 동안 300 XG에 벤치 탑의 microcentrifuge를 사용하여 나머지 정지를 셀 수를 수행하고, 원심 분리하기 위해 10 μL 샘플을 가져 가라. </li></ol></li><li> 세포 계수를 수행하여 트리 판 블루 동량 10 μL 계산 샘플 얼룩과 혈구를 사용하여 계산. </li><li> 의 microcentrifuge에서 남아있는 세포를 포함하는 1.5 ml의 microcentrifuge 관을 제거합니다. 뜨는을 기음과 포함 행크스 균형 소금 용액에 100 μL 당 200,000 500,000 세포의 농도로, 세포를 재현 탁2 % 태아 소 혈청 (HF). </li><li> 각 조건을 위해, 세포 현탁액 100 ㎕ 당 웰을 96- 웰 플레이트 (하나의 웰은 cTnT의 항체로 염색되며, 다른 하나는 이차 항체 제어 것) 2 웰 옮긴다. </li><li> 2 분 동안 300 XG에 접시를 원심 분리기. 멀티 채널 micropipettor와 뜨는을 제거합니다. </li><li> 세포를 수정 : 잘 당 고정 솔루션 (키트의 구성 요소)의 200 μl를 추가하고 실온에서 15 분 동안 접시를 품어. </li><li> 2 분 동안 300 XG에 접시를 원심 분리기. 조심스럽게 우물에서 뜨는을 철회 멀티 채널 micropipettor를 사용합니다. 파라 포름 알데히드 폐기물 용기에 뜨는을 폐기하십시오. </li><li> 두 번 고정 된 세포를 씻으 : 각 웰에 HF 200 μl를 추가합니다. 2 분 동안 300 XG에 접시를 원심 분리기. 뜨는을 대기음, 한 번 더 세척 단계를 반복합니다. 고정 된 세포는 4 ° C에서 HF 최대 일주일 동안 저장 될 수있다. </li><li> 세포 Permeabilize 하시려면 : <ol><li> (300)에서 접시를 원심 분리기2 분 XG. </li><li> 각 웰에 Permeabilization 용액 (키트 성분) 100 ㎕를 추가하고 실온에서 5 분 동안 평판을 배양한다. </li><li> 2 분 300 XG에 접시를 원심 분리기와 뜨는을 대기음. </li></ol></li><li> 주어진 로트 번호에 대한 최적의 농도로 HF에 방지 cTnT의의 마스터 믹스를 준비합니다 (최적의 희석은 적정에 의해 결정되며 일반적으로 1 범위해야합니다 : 500 1 : 2,000). </li><li> 각 조건 (조건 당 2 웰)의 경우, 하나의 잘 (스테인드 샘플)과 다른 잘 (이차 항체 제어)에 일반 HF 100 ㎕에 마스터 믹스 100 μl를 추가합니다. 30 분 동안 4 ° C에서 세포를 품어. </li><li> 2 분 동안 300 XG에 세포를 원심 분리기. 뜨는을 대기음 잘 당 HF 200 μl를 추가합니다. 이 세척 단계를 한 번 더 반복합니다. </li><li> 이차 항체의 마스터 믹스를 준비합니다. 마다 잘 100 μL에 해당하는 HF의 볼륨 (이차 항체 제어를 전송하고cTnT를 염색)의 치료를 받고. (: 200 희석 1) HF 200 μL 당 염소 항 - 마우스 - APC 차 항체의 1 μl를 추가합니다. </li><li> 샘플을 얼룩. 각 웰 (이차 항체 제어 및 안티 cTnT를 묻은 우물 둘 다) 염색 용액 100 μl를 추가합니다. 30 분 동안 4 ° C (photobleaching에 방지하기 위해 형광 차 항체를 추가 한 후 커버 플레이트 또는 어둠 속에서 유지)에 어둠 속에서 세포를 품어. </li><li> 2 분 동안 300 XG에 세포를 원심 분리기. 뜨는을 대기음 잘 당 HF 200 μl를 추가합니다. 이 세척 단계를 한 번 더 반복합니다. </li><li> 분석 튜브 사이토 5 ㎖ 둥근 바닥 흐름 샘플을 전송 한 기기 (19)의 표준 프로토콜을 사용하여 APC 채널에서 신호에 대한 유세포 분석기를 수행한다. </li></ol>

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J., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+drug+toxicity+using+3D+spheroids+constructed+from+an+immortal+human+hepatocyte+cell.">Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell.</a> Toxicol. Sci. Off. J. Soc. Toxicol. 127, 403-411 (2012).</li><li>Wallace, L., Reichelt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+3D+culture+to+investigate+the+role+of+mechanical+signaling+in+keratinocyte+stem+cells.">Using 3D culture to investigate the role of mechanical signaling in keratinocyte stem cells.</a> Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 989, 153-164 (2013).</li><li>Ungrin, M., O'Connor, M., Eaves, C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+human+embryonic+stem+cells.">Phenotypic analysis of human embryonic stem cells.</a> Curr. Protoc. Stem Cell Biol. , (2007).</li><li>Bhattacharya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes+and+characterization+by+flow+cytometry.">High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. JoVE. , e52010 (2014).</li><li>Nostro, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+signaling+through+TGF&#946;+family+members+and+WNT+regulates+patterning+and+pancreatic+specification+of+human+pluripotent+stem+cells.">Stage-specific signaling through TGF&#946; family members and WNT regulates patterning and pancreatic specification of human pluripotent stem cells.</a> Dev. Camb. Engl. 138, 861-871 (2011).</li><li>Niebruegge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+mesoderm+and+cardiac+cells+using+size-specified+aggregates+in+an+oxygen-controlled+bioreactor.">Generation of human embryonic stem cell-derived mesoderm and cardiac cells using size-specified aggregates in an oxygen-controlled bioreactor.</a> Biotechnol. Bioeng. 102, 493-507 (2009).</li></ol>

M.U. has a financial interest in the underlying microwell technology.

이 다 능성 줄기 세포를 효율적으로 심장 분화가 매우 다양 과정임을 관찰되었다. 그것은 다른 세포주가 특정 세포 유형으로 분화 용량 변화 성향을 나타내는 것은 당연하지만, 이는 심장 분화 효율 동일한 세포주 (6)를 사용하여 실행 복제 사이 급격히 변동하는 것이 관찰되었다. 여기에 설명 된 프로토콜은 직접 집계 당 입력 세포 수를 제어함으로써 이러한 변화의 한 주요 원인을 해결합니다. 상기 런 사이 변동을 저감하기 위해서는, 단일 세포 계대하도록 hPSC 라인 능성 마커의 발현 빈도 (예를 들면, 인 Oct4, Nanog를에 대하여 더 일관 능성 인구 hPSC 확장 및 유지 보수의 결과,이 형태로 사용되는 것을 권장 TRA-1-60, 등.). 여기서 작성된 프로토콜은 O 1,000 세포 응집체 크기를 지정HES -2- 배아 줄기 세포주로부터 유도 ptimal 심장. 상이한 세포주에이 프로토콜을 적용하기 위해서는 초기 집합 크기 화면 세포주 별 최적의 응집체 크기를 결정하기 위해 수행되는 것이 중요하다. 직접적 여기 따라야 할 절차에 영향을주지 않지만, 우리는 산소 전달에 영향을 미치는 것으로 예상되는 골재의 크기와 전체 셀 밀도의 변화 리더 나게. 이 다운 스트림 애플리케이션에서 관련 고려 될 수 있습니다. 또한, 사멸 세포의 죽음은 하나의 세포에 hPSCs의 해리 동안 관심사입니다. 따라서, 그 ROCK 저해제는 마이크로 웰의 강제 세포 응집 동안 존재 확인하는 것이 중요하다. 마지막으로 분화 4 일에 집계가 아니라 이전에 유도 2 중간에서 재 부유로 유도 한 매체에 존재하는 추적 티빈을 제거하는 세척하는 것이 중요합니다. 분화 4 일 후에 티빈 A는 메소 희생 내배엽 분화를 촉진덤 유도 20. 이 기술의 주요 응용 프로그램은 효율적인 심장 분화를 촉진 집계 크기를 선별하는 것입니다. 그러나, 현재 기술의 한계 중 하나는 마이크로 웰 플레이트를 이용하여 임상 적으로 관련된 수준 심장 생산 스케일 도전된다는 것이다. 심장 차별화의 스케일 업 일반적으로 교반 서스펜션 생물 반응기 (21)의 대량 배양 조건에서 수행된다. 마이크로 웰 시스템이 효율적 심장 유도 골재 크기의 허용 가능한 범위를 결정하는 데 사용 된 후 따라서 확장하는 다음 단계는 원하는 세포 응집체 크기를 생성 할 수있는 바이오 리액터 임펠러 속도를 결정하는 것이다. 골재 기반 심장 분화하는 다른 방법에 대해 이러한 기술의 큰 차이의 하나는 집합체 내인성 신호의 변조에 영향뿐만 아니라 직접 조사를 가능하게한다는 것이다골재 (13) 내의 hPSCs와 유도 / 억제 조직 유형의 공동 배양. 조사 이러한 유형의 대규모 심장 생산 공정 개발을 알릴 수있다.

시험 관내 세포 배양에서 양식의 개수에 따라 수행 될 수 있지만, 일반적으로 이차원 부착 상태 이상을 완전히 생체 시스템에서 요점을 되풀이 입체 정지 조건 중 수행된다. 따라서 입체적인 조직 구조를 생성하기위한 강력한 방법을 개발하는 연구가 다양한 분야에서 증가 경향이있다. 세포 유형 및 프로세스가지지 세포 외 기질 (ECM)의 표면과의 밀착성 신호를 요구 시나리오에서는 삼차원 배양 세포 또는 매트릭스 1지지 외래에서 배양 스캐 폴딩 구조를 통해 활성화 될 수있다. 지지가 매트릭스의 접착을 필요로하지 않는 세포와 공정은 주로 또는 독점적 2,3- (다음 자신의 내인성 행렬을 생성하기 위해 진행할 수있다) 세포로 구성 unscaffolded 시스템으로 현탁액을 행할 수있다. 여기, 우리는 심장 차별화 O를위한 프로토콜을 제시F 인간 다 능성 줄기 세포 - 크기 조절, 유니폼, unscaffolded 집계에서 (hPSCs는 배아 또는 기타 소스에서 몸의 모든 세포 유형이 될 수있는 세포 여부를 줄기). 서스펜션 집계로 hPSCs의 차별화가 실행 내부와 실행 사이에 모두 집합 크기가 큰 변화에 의해 괴롭혀된다. 이 변화는 세포 콜로니의 기계적 분리를 포함 일반적으로 이러한 응집체를 생성하기 위해 사용 된 방법의 결과이다. 이 변동을 저감하기 위해 접근 방법이 당 총 셀의 개수뿐만 아니라 골재 직경의 균일 성을 제어하기 위해 사용되어왔다. 실시 예는 마이크로 원심 튜브 4 응집체의 형성을 포함하거나 걸려 5 삭제 같이 미세화하거나 세포의 원심 U- 또는 V 바닥 멀티 웰 플레이트 (7,8)으로 한 후 현탁액에 전송할 수 이차원 hPSC 콜로니 6 규정 9. 그러나, 이러한 모든 approaches 집계 세대의 낮은 처리량에 의해 제한됩니다. 음 기반 시스템은 V-저판 시스템과 유사한 방식의 마이크로 웰의 그러나 더 작은 크기를 채용 아니라 단일 배양 접시에서 균일 응집체 더 많은 수의 생성을 가능하게 (이 프로토콜에서 각각 400 ㎛의 폭을 갖는) 전체 V-바닥 판 (10)에서 생성되는 것보다 (포함 15.5 mm ~ 1,200 마이크로 웰 ~의 표준 직경). 음 계 응집체 형성이 11 내배엽 12 중배엽 13 배외 (extraembryonic) 14 운명 외배엽하는 hPSCs의 분화를 비롯한 여러 설정에 사용되었다; 중간 엽 줄기 세포 (15)에서 연골; 독성 학적 검사 (16)에 대한 균일 한 기판의 생성; 및 제어 공학 (17)의 조사. hPSC 유래 cardiom의 생산을위한 견고한 제조 프로토콜을 개발 한 주요 과제yocytes은 실행 사이의 심장 분화 효율 재현성의 부족이었다. 우리는 이전에이 변화는 내배엽 및 신경 분화 6,18과 관련된 유전자를 발현 모두 자기 갱신 hPSCs 및 분화 세포를 포함하는 시작 hPSC 인구의 이질성에 기인 할 수 있다는 것을 보여 주었다. 이러한 분화 세포에 의해 분비 신호는 심장 유도에 영향을 미친다. 신경 전구 세포가 심장 유도를 억제하면서 특히, 배외 (extraembryonic) 내배엽은 심장 유도를 촉진한다. hPSC 집계하면, 총 차별화 내의 세포와는 그래서 미분화 hPSCs은 골재 표면 (13)에 개발 배외 (extraembryonic) 내배엽 세포의 층으로 둘러싸여있다 정리할 수 있습니다. 응집체의 크기를 조절함으로써, 우리는 미분화 hPSCs (부피비 표면적)을 심장 유도 내배엽 세포의 비율을 조절하고, 최대 심장 유도 (13)이 비를 최적화 할 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="645">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biological safety cabinet</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pipette aid</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">&#160;Serological pipettes (5 to 25 mL)&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aspirator</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aspirator or Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;15 and 50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fume hood</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.22 &#181;m syringe filter</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:216px;">5% CO2, 5% O2, and humidity controlled cell culture incubator&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Hypoxic (low oxygen) incubator</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:216px;">5% CO2, 20% O2, and humidity controlled cell culture incubator&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Low speed centrifuge with a swinging bucket rotor fitted with a plate holder&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">P2, P20, P200, and P1000 micropipettors and associated tips&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Inverted microscope with 4X, 10X and 20X phase objectives&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultra-Low Attachment (ULA) 24 well plates&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Corning/Costar</td>
			<td style="width:119px;">3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bench-top microcentrifuge</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Ascorbic Acid</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sterile Ultrapure distilled water</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vortex</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ice</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">-20C freezer</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Monothioglycerol</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M6145</td>
			<td>Toxic; Aliquoting of MTG is strongly recommended to minimize oxidation due to repeated opening. Aliquots can be stored at 4 &#176;C for up to 3 months, -20 &#176;C is recommended for long-term storage.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">StemPro-34 Medium</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10639-011</td>
			<td>Basal Cardiac Induction Medium; The supplement is stored at -20 &#176;C and the basal medium at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Transferrin</td>
			<td style="width:143px;">Roche</td>
			<td>10652202001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">BMP-4</td>
			<td style="width:143px;">R&#38;D Technologies</td>
			<td style="width:119px;">314-BP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">bFGF</td>
			<td style="width:143px;">R&#38;D Technologies</td>
			<td style="width:119px;">233-FB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">VEGF</td>
			<td style="width:143px;">R&#38;D Technologies</td>
			<td style="width:119px;">293-VE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Activin A</td>
			<td style="width:143px;">R&#38;D Technologies</td>
			<td style="width:119px;">338-AC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IWP-2</td>
			<td style="width:143px;">Reagents Direct</td>
			<td style="width:119px;">57-G89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hydrochloric acid&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td>Corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM/F-12</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100X Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100X L-glutamine</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Knockout Serum Replacement</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10828010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TrypLE Select</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12563</td>
			<td>Dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Aggrewell 400 plates</td>
			<td style="width:143px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">27845</td>
			<td>Microwell Plates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Aggrewell Rinsing Solution</td>
			<td style="width:143px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">7010</td>
			<td>Microwell Rinsing Solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Y-27632 ROCK Inhibitor</td>
			<td style="width:143px;">Tocris</td>
			<td style="width:119px;">1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase Type II</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96 well plate (for FACS staining)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Intraprep Permeabilization Reagent</td>
			<td style="width:143px;">Beckman Coulter</td>
			<td>IM2389</td>
			<td>Kit with 2 parts: Fixation Solution and Permeabilization Solution; Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cTnT antibody</td>
			<td>Neomarkers&#160;</td>
			<td style="width:119px;">MS-295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">goat anti-mouse-IgG APC antibodyThermoFisher</td>
			<td style="width:143px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">A865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">5 mL round bottom flow cytometry tubes</td>
			<td style="width:143px;">FACS machine dependent</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aggregate size optimization in microwells for suspension-based cardiac differentiation of human pluripotent stem cells

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates. Conventional aggregate formation of hPSCs involves dissociating cell colonies into smaller clumps, with size control of the clumps crudely controlled by pipetting the cell suspension until the desired clump size is achieved. One of the main challenges of conventional aggregate-based cardiac differentiation of hPSCs is that culture heterogeneity and spatial disorganization lead to variable and inefficient cardiomyocyte yield. We and others have previously reported that human embryonic stem cell (hESC) aggregate size can be modulated to optimize cardiac induction efficiency. We have addressed this challenge by employing a scalable, microwell-based approach to control physical parameters of aggregate formation, specifically aggregate size and shape. The method we describe here consists of forced aggregation of defined hPSC numbers in microwells, and the subsequent culture of these aggregates in conditions that direct cardiac induction. This protocol can be readily scaled depending on the size and number of wells used. Using this method, we can consistently achieve culture outputs with cardiomyocyte frequencies greater than 70%.

hPSCs 크기 조절 응집체 효과적으로 단 전지의 농도 및 마이크로 웰 표면적에 의존 마이크로 웰 시스템을 사용하여 형성 될 수있다. 짧은 원심 분리 후, 세포의 적절한 숫자 (이 프로토콜 1000)는 각각 마이크로 웰 (그림 1A)에 함께하게된다. 중요한 것은,이 세포는 24 시간 이내에 세포 내 연결을 다시 설정하고 더 이상 잘 채우기 없지만, 부드러운 가장자리 (그림 1B)와 소형 집계로 나타납니다. 이 집계는 심장 운명을 향해 더 차별화를위한 출발 물질을 제공합니다. 세포가 꽉 클러스터를 형성하지 않으면,이 가능한 세포 분리 및 재 응집 다음 죽음과 검사해야 특정 세포주 단일 세포 및 계대 ROCK 억제제 농도의 적합성을 시사한다. 마이크로 웰의 다음과 같은 세 가지 일 집계 모토에 약간의 변화를 보여말의 뜻은 약간의 성장은 분명하다,하지만. 마이크로 웰에서 제거 할 때, 단위는 라운드, 단단히 포장 형태를 유지하고 서로 (그림 1C)와 비슷한 크기 여야한다. ULA 24- 웰 플레이트의 배양은 상기 세포의 성장 및 팽창을 허용한다. 8 일째으로 첫 번째 티빈 신호와의 Wnt 억제에 노출 된 후, 집계는 크고 밝은 집계 (그림 1D)로 표시하기 시작합니다. 이 기간 동안 상당한 세포 파편을 각 웰의 바닥에 명백 할 것이다 집계 매체를 제거하기 전에 정착시킴으로써 제거되어야한다. 때때로, 많은 집계가 함께 융합 할 것이다. 이 &quot;슈퍼 집계가&quot;작은 집계에 보이는 형태 학적 변화를 전시하지 않는 경향이 완전한 차별화를받을 가능성이 적은 있지만, 이것은 물론 다른 골재의 분화를 억제하지 않습니다. FO &quot;jove_content&quot;유지 - together.within 페이지 =을 증가 크기와 조직 섬유 영역의 모양과 집계에 주목할만한 형태 학적 변화의 &quot;1&quot;&gt; 계속 분화의 결과. 12 일까지, 계약 집계는 관찰 할 수있다. 이들은 항상 큰 투명 세포로 구성 될 종종 집계 (그림 2) 외부의 광범위한 세포 외 기질이 포함됩니다. 총 전체의 수축이 성공적으로 차별화를 나타내는 반면, 심장 마커의 발현도 계약을 표시하지 않는 집계에서 관찰 할 수있다. 단위 및 immunolabeling의 분리 후, 세포의 대부분은 유동 세포 계측법에 의한 심근 마커 cTnT를 (그림 3)에 대한 긍정적 인 것입니다. 이 마커의 발현이 세포에서 안정하고 늦게 분화 19 일로서 응집체에서 관찰 될 수있다. 1.JPG &quot;/&gt; 그림 1 : hPSC의 타임 라인은 심장 운명을 향해 차별화 된 즉시 집계 한 후, 세포가 거의 각각의 마이크로 웰 (A)를 입력합니다.. 어느 날 후, 집계가 응축 나타납니다 부드러운 (B). 이 형태의 집합체가 마이크로 웰로부터 제거하고, 웰 플레이트 (C)에 도금되는 경우에도 지속. 8 일째으로 집계 확장하기 시작 및 색상 (D)에서 가벼운 나타납니다. 스케일 바 :. 250 μm의 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54308/54308fig2.jpg" /> 그림 2 :. 심장 유도 3 단계 중간에 육일는 강력한 집계 차원의 수축이 관찰 한 후 집계는 (주 분화 (12)에 의해 상부 패널을 계약 시작 : 휴식ATION, 가운데 패널 : 수축). 하판은 검은 색 또는 흰색 (화살촉)로 나타나는 가장 중요한 차이점이 상부 및 중간 패널 감산으로부터 유도된다. 스케일 바 :. 250 μm의 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54308/54308fig3.jpg" /> 그림 3 :. 하루에 17에서 차별화 된 hPSCs에서 심장 트로포 닌 T에 대한 Immunolabeling, 세포의 대부분은 유동 세포 계측법 (채워진 막대 그래프)에 의해 심장 트로포 닌 T에 긍정적이다. 또한 혼자 차 항체 (채워지지 히스토그램)으로 염색 된 세포가되어 도시. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54308/54308fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Aggregate Size Optimization in Microwells for Suspension-based Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells

기존의 방법은 인간 만능의 서스펜션 집계를 기반으로 심장 분화 세포 (hPSCs) 골재의 크기와 모양에 대한 문화의 이질성으로 고생하는 줄기 시작합니다. 여기, 우리는 크기 조절 hPSC가 심장 촉진 조건에서 배양 집계 생성하는 마이크로 웰을 사용하는 심장 차별화를 위해 강력한 방법을 설명합니다.

인간 다 능성 줄기 세포의 서스펜션 기반의 심장 차별화를위한 마이크로 웰의 집계 크기 최적화

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates.  Conventional aggregate formation ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.7K 조회수.  University of Toronto.  기존의 방법은 인간 만능의 서스펜션 집계를 기반으로 심장 분화 세포 (hPSCs) 골재의 크기와 모양에 대한 문화의 이질성으로 고생하는 줄기 시작합니다. 여기, 우리는 크기 조절 hPSC가 심장 촉진 조건에서 배양 집계 생성하는 마이크로 웰을 사용하는 심장 차별화를 위해 강력한 방법을 설명합니다. 

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Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into all three germ layers. This makes them an attractive cell source for regenerative medicine and experimental modeling of normal and diseased organogenesis. However, the differentiation of hPSCs in vitro is heterogeneous and spatially disordered. Cell micropatterning technologies potentially offer the means to spatially control stem cell microenvironments and organize the resultant differentiation fates. Micropatterning hPSCs needs to take into account the stringent requirements for hPSC survival and maintenance. Here, we describe stencil micropatterning as a method that is highly compatible with hPSCs. hPSC micropatterns are specified by the geometries of the cell stencil through-holes, which physically confine the locations where hPSCs can access and attach to the underlying extracellular matrix-coated substrate. Due to this mode of operation, there is greater flexibility to use substrates that can adequately support hPSCs as compared to other cell micropatterning methods. We also highlight critical steps for the successful generation of hPSC micropatterns. As an example, we demonstrate that stencil micropatterning of hPSCs can be used to modulate spatial polarization of cell-cell and cell-matrix adhesions, which in turn determines mesoendoderm differentiation patterns. This simple and robust method to micropattern hPSCs widens the prospects of establishing experimental models to investigate tissue organization and patterning during early embryonic development.

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have the intrinsic ability to differentiate and self-organize into distinct tissue patterns; although this requires the presentation of spatial environmental gradients. We present stencil micropatterning as a simple and robust method to generate biochemical and mechanical gradients for controlling hPSC differentiation patterns.

차별화 운명의 공간 조직을 프로빙에 대한 인간 다 능성 줄기 세포의 스텐실 미세화

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

연구

발생학

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, many protocols for differentiating hiPSCs into neurons have been developed. However, these protocols are often slow with high variability, low reproducibility, and low efficiency. In addition, the neurons obtained with these protocols are often immature and lack adequate functional activity both at the single-cell and network levels unless the neurons are cultured for several months. Partially due to these limitations, the functional properties of hiPSC-derived neuronal networks are still not well characterized. Here, we adapt a recently published protocol that describes production of human neurons from hiPSCs by forced expression of the transcription factor neurogenin-212. This protocol is rapid (yielding mature neurons within 3 weeks) and efficient, with nearly 100% conversion efficiency of transduced cells (&#62;95% of DAPI-positive cells are MAP2 positive). Furthermore, the protocol yields a homogeneous population of excitatory neurons that would allow the investigation of cell-type specific contributions to neurological disorders. We modified the original protocol by generating stably transduced hiPSC cells, giving us explicit control over the total number of neurons. These cells are then used to generate hiPSC-derived neuronal networks on micro-electrode arrays. In this way, the spontaneous electrophysiological activity of hiPSC-derived neuronal networks can be measured and characterized, while retaining interexperimental consistency in terms of cell density. The presented protocol is broadly applicable, especially for mechanistic and pharmacological studies on human neuronal networks.

We modify and implement a previously published protocol describing the rapid, reproducible, and efficient differentiation of human&#160;induced&#160;Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) into excitatory cortical neurons12. Specifically, our modification allows for control of neuronal cell density and use on micro-electrode arrays to measure electrophysiological properties at the network level.

마이크로 전극 배열에 네트워크 활동을 측정하기위한 유도 다 능성 줄기 세포의 빠른 신경 세포의 분화

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for differentiating hiPSCs into cardiomyocytes (hiPSC-CMs), endothelial cells (hiPSC-ECs), and smooth muscle cells (SMCs) are often limited by low yield, purity, and/or poor phenotypic stability. Here, we present novel protocols for generating hiPSC-CMs, -ECs, and -SMCs that are substantially more efficient than conventional methods, as well as a method for combining cell injection with a cytokine-containing patch created over the site of administration. The patch improves both the retention of the injected cells, by sealing the needle track to prevent the cells from being squeezed out of the myocardium, and cell survival, by releasing insulin-like growth factor (IGF) over an extended period. In a swine model of myocardial ischemia-reperfusion injury, the rate of engraftment was more than two-fold greater when the cells were administered with the cytokine-containing patch comparing to the cells without patch, and treatment with both the cells and the patch, but not with the cells alone, was associated with significant improvements in cardiac function and infarct size.

We present three novel and more efficient protocols for differentiating human induced pluripotent stem cells into cardiomyocytes, endothelial cells, and smooth muscle cells and a delivery method that improves the engraftment of transplanted cells by combining cell injection with patch-mediated cytokine delivery.

다 능성 줄기 세포는 심근 수리를위한 심장 세포를 유도

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

인간 다 능성의 체외 분화에서 융모 세포로 줄기 세포

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis and visual clarity. Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived LESCs provide a promising cell source for corneal cell replacement therapy. Undefined, xenogeneic culture and differentiation conditions cause variation in research results and impede the clinical translation of hPSC-derived therapeutics. This protocol provides a reproducible and efficient method for hPSC-LESC differentiation under xeno- and feeder cell-free conditions. Firstly, monolayer culture of undifferentiated hPSC on recombinant laminin-521 (LN-521) and defined hPSC medium serves as a foundation for robust production of high-quality starting material for differentiations. Secondly, a rapid and simple hPSC-LESC differentiation method yields LESC populations in only 24 days. This method includes a four-day surface ectodermal induction in suspension with small molecules, followed by adherent culture phase on LN-521/collagen IV combination matrix in defined corneal epithelial differentiation medium. Cryostoring and extended differentiation further purifies the cell population and enables banking of the cells in large quantities for cell therapy products. The resulting high-quality hPSC-LESCs provide a potential novel treatment strategy for corneal surface reconstruction to treat limbal stem cell deficiency (LSCD).

This protocol introduces a simple two-step method for differentiating corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells under xeno- and feeder cell-free culture conditions. The cell culture methods presented here enable cost-efficient, large-scale production of clinical quality cells applicable to corneal cell therapy use.

임상 호환 막 Limbal 상피 줄기 세포 인간 만능 줄기 세포에서의 효율적이 고 확장 가능한 감독된 차별화

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...