The University of Alabama at Birmingham Center for Metabolic Bone Disease performed the histologic processing and sectioning of surrogates. Southern Research (Birmingham, AL) provided support for the manufacture of the bioreactor system. Funding was provided by the United States Department of Defense Breast Cancer Research Program (BC121367).

<ol>
	<li>Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+3D+environments+to+elucidate+the+effect+of+environmental+parameters+on+drug+response+in+cancer.">Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer.</a> Integr Biol (Camb). 3 (1), 31-38 (2011).</li><li>Horning, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+tumor+model+for+in+vitro+evaluation+of+anticancer+drugs.">3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs.</a> Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).</li><li>Dhiman, H. K., Ray, A. R., Panda, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+chitosan+scaffold-based+MCF-7+cell+culture+for+the+determination+of+the+cytotoxicity+of+tamoxifen.">Three-dimensional chitosan scaffold-based MCF-7 cell culture for the determination of the cytotoxicity of tamoxifen.</a> Biomaterials. 26 (9), 979-986 (2005).</li><li>Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microenvironment+in+breast+cancer+progression:+biology+and+implications+for+treatment.">The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment.</a> Breast Cancer Res. 13 (6), 227 (2011).</li><li>Mao, Y., Keller, E. T., Garfield, D. H., Shen, K., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cells+in+tumor+microenvironment+and+breast+cancer.">Stromal cells in tumor microenvironment and breast cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 32 (1-2), 303-315 (2013).</li><li>Paulsson, J., Micke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+relevance+of+cancer-associated+fibroblasts+in+human+cancer.">Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer.</a> Semin Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).</li><li>Roskelley, C. D., Desprez, P. Y., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix-dependent+tissue-specific+gene+expression+in+mammary+epithelial+cells+requires+both+physical+and+biochemical+signal+transduction.">Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 12378-12382 (1994).</li><li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+HER2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab.">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2008).</li><li>Ivascu, A., Kubbies, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+single-tumor+spheroids+for+high-throughput+cell+function+and+toxicity+analysis.">Rapid generation of single-tumor spheroids for high-throughput cell function and toxicity analysis.</a> J Biomol Screen. 11 (8), 922-932 (2006).</li><li>Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+cell+culture+techniques+for+cancer+drug+discovery.">Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery.</a> Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).</li><li>Bergamaschi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+signature+identifies+breast+cancer+subgroups+with+different+clinical+outcome.">Extracellular matrix signature identifies breast cancer subgroups with different clinical outcome.</a> J Pathol. 214 (3), 357-367 (2008).</li><li>Oskarsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+components+in+breast+cancer+progression+and+metastasis.">Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis.</a> The Breast. 22, S66-S72 (2013).</li><li>Kelley, L. C., Lohmer, L. L., Hagedorn, E. J., Sherwood, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traversing+the+basement+membrane+in+vivo:+A+diversity+of+strategies.">Traversing the basement membrane in vivo: A diversity of strategies.</a> JBC. 204 (3), 291-301 (2014).</li><li>Sadlonova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+fibroblasts+modulate+epithelial+cell+proliferation+in+three-dimensional+in+vitro+co-culture.">Breast fibroblasts modulate epithelial cell proliferation in three-dimensional in vitro co-culture.</a> Breast Cancer Res. 4, (2004).</li><li>Wendt, D., Marsano, A., Jakob, M., Heberer, M., Martin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillating+perfusion+of+cell+suspensions+through+three-dimensional+scaffolds+enhances+cell+seeding+efficiency+and+uniformity.">Oscillating perfusion of cell suspensions through three-dimensional scaffolds enhances cell seeding efficiency and uniformity.</a> Biotechnol Bioeng. 84 (2), 205-214 (2003).</li><li>Marshall, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-perfusion+bioreactor+system+for+engineered+breast+cancer+surrogates+to+be+used+in+preclinical+testing.">Flow-perfusion bioreactor system for engineered breast cancer surrogates to be used in preclinical testing.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2015).</li><li>Calcagnile, P., Fragouli, D., Mele, E., Ruffilli, R., Athanassiou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+foams+with+functional+nanocomposite+cells.">Polymeric foams with functional nanocomposite cells.</a> RSC Adv. 4, 19177-19182 (2014).</li><li>Naba, A., Clauser, K. R., Lamar, J. M., Carr, S. A., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+signatures+of+human+mammary+carcinoma+identify+novel+metastasis+promoters.">Extracellular matrix signatures of human mammary carcinoma identify novel metastasis promoters.</a> eLife. 3, (2014).</li><li>Lochter, A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+extracellular+matrix+constituents+in+breast+cancer.">Involvement of extracellular matrix constituents in breast cancer.</a> Semin Cancer Biol. 6 (3), 165-173 (1995).</li><li>Joiner, K. S., Spangler, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+HistoGel-embedded+specimens+for+use+in+veterinary+diagnostic+pathology.">Evaluation of HistoGel-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology.</a> J Vet Diagn Invest. 24 (4), 710-715 (2012).</li><li>Varsegi, G. M., Shidham, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Block+Preparation+from+Cytology+Specimen+with+Predominance+of+Individually+Scattered+Cells.">Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells.</a> J Vis Exp. (29), e1316 (2009).</li><li>Sadlonova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Breast+Fibroblasts+Inhibit+Growth+of+the+MCF10AT+Xenograft+Model+of+Proliferative+Breast+Disease.">Human Breast Fibroblasts Inhibit Growth of the MCF10AT Xenograft Model of Proliferative Breast Disease.</a> Am J Pathol. 170 (3), (2007).</li><li>Otali, D., He, Q., Stockard, C. R., Grizzle, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+immunorecognition+by+transferring+cells+from+10%+neutral+buffered+formalin+to+70%+ethanol.">Preservation of immunorecognition by transferring cells from 10% neutral buffered formalin to 70% ethanol.</a> Biotech Histochem. 88, 170-180 (2013).</li><li>Webster, S. S., Jenkins, L., Burg, K. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+Techniques+for+Porous,+Absorbable,+Polymeric+Scaffolds,+Used+in+Tissue+Engineering.">Histological Techniques for Porous, Absorbable, Polymeric Scaffolds, Used in Tissue Engineering.</a> J Histotechnol. 26 (1), 57-65 (2003).</li><li>Troy, T. -. C., Arabzadeh, A., Enikanolaiye, A., Lariviere, N., Turksen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+Paraffin+Sections+of+Mouse+Epidermis+Using+Fluorescent+Antibodies.">Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies.</a> J Vis Exp. (11), (2008).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Kwon, Y. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gli1+enhances+migration+and+invasion+via+up-regulation+of+MMP-11+and+promotes+metastasis+in+ERa+negative+breast+cancer+cell+lines.">Gli1 enhances migration and invasion via up-regulation of MMP-11 and promotes metastasis in ERa negative breast cancer cell lines.</a> Clin Exp Metastasis. (28), (2011).</li><li>Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+for+Immunohistochemistry+on+Cryosectioned+Rat+Brain+Tissue:+Example+Staining+for+Microglia+and+Neurons.">Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons.</a> J Vis Exp. (99), e52293 (2015).</li><li>Pal, A., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+dimensional+cultures:+a+tool+to+study+normal+acinar+architecture+vs.+malignant+transformation+of+breast+cells.">Three dimensional cultures: a tool to study normal acinar architecture vs. malignant transformation of breast cells.</a> J Vis Exp. (86), e51311 (2014).</li><li>Hasselbach, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+High+Grade+Glioma+Cell+Culture+from+Surgical+Specimens+for+Use+in+Clinically+Relevant+Animal+Models+and+3D+Immunochemistry.">Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry.</a> J Vis Exp. (83), e51088 (2014).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids.">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J Vis Exp. (51), e2720 (2011).</li><li>Materne, E. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Multi-organ+Chip+-+A+Microfluidic+Platform+for+Long-term+Multi-tissue+Coculture.">The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture.</a> J Vis Exp. (98), e52526 (2015).</li><li>Sadlonova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Molecular+Distinctions+Between+Normal+Breast-Associated+Fibroblasts+and+Breast+Cancer-Associated+Fibroblasts.">Identification of Molecular Distinctions Between Normal Breast-Associated Fibroblasts and Breast Cancer-Associated Fibroblasts.</a> Cancer Microenviron. 2, 9-21 (2009).</li><li>Wang, J. D., Douville, N. J., Takayama, S., ElSayed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+molecular+absorption+into+PDMS+microfluidic+channels.">Quantitative analysis of molecular absorption into PDMS microfluidic channels.</a> Ann Biomed Eng. 40 (9), 1862-1873 (2012).</li><li>Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices.">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosens Bioelectron. 63, 218-231 (2015).</li><li>Regehr, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+implications+of+polydimethylsiloxane-based+microfluidic+cell+culture.">Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture.</a> Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).</li><li>Burdett, E., Kasper, F. K., Mikos, A. G., Ludwig, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+tumors:+a+tissue+engineering+perspective+in+cancer+biology.">Engineering tumors: a tissue engineering perspective in cancer biology.</a> Tissue Eng Part B Rev. 16 (3), 351-359 (2010).</li><li>Caruso, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+coagulative+necrosis+in+malignant+epithelial+tumors+(Review).">Mechanisms of coagulative necrosis in malignant epithelial tumors (Review).</a> Oncol Lett. 8 (4), 1397-1402 (2014).</li><li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis:+A+Review+of+Programmed+Cell+Death.">Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death.</a> Toxicol Pathol. 35 (4), 495-516 (2007).</li><li>Majno, G., Joris, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis,+oncosis,+and+necrosis.+An+overview+of+cell+death.">Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.</a> Am J Pathol. 146 (1), 3-15 (1995).</li><li>Ogino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathological+epidemiology+of+epigenetics:+emerging+integrative+science+to+analyze+environment,+host,+and+disease.">Molecular pathological epidemiology of epigenetics: emerging integrative science to analyze environment, host, and disease.</a> Mod Pathol. 26 (4), 465-484 (2013).</li><li>Otali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+effects+of+formalin+fixation+and+tissue+processing+on+immunorecognition.">Combined effects of formalin fixation and tissue processing on immunorecognition.</a> Biotech Histochem. 84 (5), 223-247 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

여기서, 3 차원 배양 방법은 더 가깝게 모델 인간 유방암은 recapitulative 차원 형태의 개발을 허용하는 양으로, 세포 외 기질 (ECM) 및 인간 간질 섬유 아세포를 포함하는 조직의 미세 환경의 구성 요소를 포함하고 그 설명되었지만 . 기재된 3D 배양 방법은 ECM의 3 차원 볼륨에 포함되는 여러 종류의 세포의 전통적인 2 차원 세포 배양에 비해 인간의 질병을 더 나타낸다. 이 조직 구조는, 미세 환경, 및 차원의 신호 계정 1,8-으로 수행되기 때문에 이러한 파라미터 (예를 들어, 여러 세포 유형, ECM 및 3D 볼륨) 생물학적 과정을 연구하기 위해 더 충당 컨텍스트를 제공하는 것이 주목되고있다. 3D 배양하는 다른 방법은 이전에 3 차원 행렬 (29)의 상부에 세포 배양 물을 포함 설명되었지만, 스페 로이드 (30)의 발생이 매달려 드롭 (31)는이 cutluresND 미세 유동 장치 (32)의 용도. 이들 시스템들 각각은 고유 한 장점을 가지고 있지만, 이들은 전체적으로 매트릭스 성분, 간질 세포 집단 또는 대표 차원 중 하나를 포함하지 못한다. 3 차원 배양의 방법은 여기에 설명 된 이들 파라미터를 각각 포함하고, 고체를 3 차원 배양을 이용하여 달성하기 어려운 긴 성장 기간을 허용하는 바이오 리액터 시스템을 사용하여 확립 될 수있다. 또한, 대리의 관류 고체 대리에 비해 성장의 큰 학위를 제공합니다. 생체 외 배양을위한 이러한 접근법의 또 다른 특징은 서로 게이트 &quot;조직&quot;을 사용하여 수행 될 수있는 분석의 유형의 유연성이다. 엔드 포인트가 다양한 (수용성 제품에 대한 조정 배지 또는 관류를 평가함으로써 배양하는 동안 간접적으로 모니터링 할 수있다 예 indicat 같은 세포 사멸, 특정 단백질 또는 분비되는 대사 물질의 지표로서 LDH또는 적절한 표현형 기능) 또는 성장과 대리 아키텍처 초과 근무를 평가하기 위해 형광 또는 luminescently 표지 된 세포의 비 침습적 영상을 이용하여. 성장 후, ECM은 ECM 단백질 분해 효소를 사용하여 분해 될 수 있고 세포는 격리 및 유세포 정량화 33 추가 분석 또는 추가 실험에 사용될 수있다. 전자 재료로부터 제거 된 세포 용 해물은 또한 mRNA의 전사 수준 또는 단백질의 발현을 위해, genomically 평가 될 수있다. 선택적으로, 엔드 포인트는 실험이 종료 된 후, 고정 가공 대리 &quot;조직&quot;에서 직접 측정 할 수있다. 이는 면역 조직 화학 법을 사용하여 조직 학적 섹션에서 수행 H &amp; E 염색 된 조직 학적 단면 및 다른 분자 분석 (ON 학적 파라미터 (예를 들어, 핵 / 세포 형태 및 세포 응집의 정도)의 다양성을 포함한다 예를 들면, 세포의 지표로서 기-67의 발현 확산) 또는계내 혼성화 (예. 특정 유전자 산물의 발현 RNA). 이는 이들 포르말린 고정 파라핀 포매 대용 실시간 정량적 PCR 또는 차세대 시퀀싱 추가적인 분자 분석을 수행 할 수도있다; 그러나, 고정 가공에 의한 분자량 가교에 스냅 고정 대리는 이런 종류의 분석을 위해 바람직하다. 이러한 분자 형태 학적 평가는 세포 성장, 사망 또는 문화 다음과 같은 약리 성장을 통해 치료뿐만 아니라에 대한 응답에 관한 유용한 정보를 제공 할 수 있습니다. 대용의 조직 학적 섹션 본 유핵 세포의 밀도 반자동 정량화 대한 CellProfiler 프로그램을 사용하는 주요 장점은이 제공하는 시간을 절약한다. 대리 당 필요한 총 시간은 가변적이며 대용의 크기 및 획득 된 영상의 수에 크게 의존하지만,이 ESTI이고대리 이미지 세포 밀도에 도달하면의 4~5시간 요구하는 CellProfiler 프로그램을 사용할 때 수동 대리 당 반 시간 대 카운트 대리 시간당 손 온 정합. 손을 정시하여 CellProfiler 해석의 대부분은 ImageJ에있는 대리 면적의 측정에 기인한다. CellProfiler 프로그램이 자동으로 이미지를 처리​​하는 시간이 필요하지 않습니다,하지만 손의 이미지를 가져가 아닌 다른 연구자의 시간을 필요로하지 않습니다. 방법과 여기에 설명 된 3D 대리 문화의 제한이 있습니다. 도 12에 도시 된 바와 같이, 관류 생물 반응기 시스템의 사용은 고체 배양 성장보다 더 큰 정도를 제공하는 셀의 축적 및 증식 속도가 훨씬 느리다. 여기서 사용 관류 생물 반응기 시스템은 성장 이점을 제공하지만, 관류 시스템은 또한 자신의 한계를 가질 수있다. 예를 들어, PDMS는종종 인해 사용의 용이성, 불활성 특성 및 재현성 생물 반응기의 제조에 사용된다. 그러나이 물질은 세포 배양 미디어에서 소수성 분자를 흡수하는 것으로 알려져 및 친 유성 약 34 ~ 36을 걸릴 수 있습니다. 이러한 제한은 문제의 경우 다른 재료 대신 PDMS 사용할 수 있습니다 동안 사용할 수있는 다른 재료도 고려되어야 자신의 단점을 갖추고 있습니다. CellProfiler 분석은 핵 직경의 원형에 대한 파라미터 입력에 의존하기 때문에, 각 대리 / 셀 타입이 입력의 최적화가 필요하다. 또한 여기에 제시된 세포 밀도 측정은 세포 생존 능력의 직접 측정하지 않습니다 노트입니다. 이전에 세포 생존의 직접 측정이 3D 문화 시스템 (37)에 도전 주목되고있다. 그러나, 핵 분해는 세포 사멸 및 괴사 모두의 일부는 두 세포사의 형태 우세. 아폽토시스에서 핵 단편하는프로세스, karyorrhexis라는 염색질 응축에 따라, 또는 (38, 39)를 pyknosis. 이는 세포막의 원인 죽는 세포의 팽창 파열 및 세포질의 내용을 해제 괴사 다르다. 조직 학적으로, 괴사가 karyolysis 특징으로한다 (즉, 핵의 용해), pyknosis 다음에 40을 karyorrhexis. 이러한 변경 사항을받은 핵은 H &amp; E 염색 조직 학적 섹션에서 볼 수 있지만 CellProfiler 프로그램에 의해 그대로 핵으로 인식되지 않습니다. 이러한 핵 변화는 그러나 세포 사멸의 과정에서 비교적 늦게 발생합니다. 따라서 면적당 유핵 세포의 수를 정량하여 세포 사멸의 초기 단계에있는 세포를 포함 할 수 있지만, 그럼에도 불구하고 대리 고정술시의 세포 생존율에 관한 유용한 정보를 제공 할 것이다. 생존 또는 성장을 나타 내기 위해 사용될 수있는 다른 방법 (예하는, Alamar 블루 또는 LDH 분석) 관류의 분석 O를 포함(면역 조직 화학 염색에 의한 유사 분열을 통해 예) 대리 &quot;조직&quot;의 확산의 연구 평가. 대리 설정을위한 프로토콜의 중요한 단계는 ECM 중합, 온도, pH, 모든이 매체에 대리 목욕하는 완전한 중합 전에 확인하기 위해 모니터링해야 시간을 포함한다. 또한, 바이오 리액터로 8 웰 챔버 슬라이드 또는 사출 도금 전에 얼음 셀 + ECM 혼합물 유지 조기 중합을 방지하는 결정적이다. 또한 대리 설정, 최종 혼합물을 추가해야 7로 pH를 증가시키기 위해 사용 된 중탄산 나트륨 중에 중합을 방지 할 수있다. 마지막으로, 37 ℃에서 충분히 배양 시간은 전체 ECM 중합을 보장하기 위해 제공되어야한다; 45분 충분한 것으로 입증되었습니다. 대리 제조에서 또 다른 중요한 인자는 기포 형성의 회피이다. 두 고체 및 관류 시스템에서는 bubbl의 형성을 피하기 위해 최고같은 셀 + ECM 혼합물 ES는 문화 동안 영양소의 흐름에 블록을 생성 할 수 있습니다. 이는 거품 매체의 흐름을 차단하고, 공기 색전증로서 기능 할 수 관류 시스템의 도입 배지 중에 기포를 방지하는 것도 중요하다. 적절한 고정은 다운 스트림 분석을 위해 중요하다 따라서, 표준화 및 일관성 (고정의 유형 및 고착성의 시간 포함)에 정착 처리에 대한 관심은 복제 성 결과를 얻을 필요가있다. 기간과 고정 형식이 여기에서 설명한 H &amp; E 염색 문제가 덜하지만, 이러한 파라미터는 대용의 분자량 분석 다른 형태에 영향을 미칠 수있다. 포르말린 고정은 특히 다소 시간에 따른 분자 및 특정 방법 (41, 42)의 단백질, DNA 및 RNA를 포함하여 분자의 가교 결합을 유발하기 때문이다. 항체 인식이 힌 될 수 있습니다 때 면역 조직 화학 분석에서 특히 중요하다가교에 의해 고려 하였으.

보다 정확하게 생체 내에서 종양의 구조와 미세 모방 삼차원 (3D) 모델은 배양 세포 및 미세 사이의 복잡한 상호 작용을 해부 후보 치료제의 효능을 시험 할 목적으로 연구에 중요하다. 종양 차원에 영향을 산소 및 영양소 구배 약물 노출 삽입 압력 / 혈류 및 3D 구조 1-4의 균일. 적절한 기질 미세 환경의 존재는 종양 차원 및 영향 셀 ECM 시그널링 및 간질 세포 및 악성 상피 세포 사이의 주변 분비 신호에 기여한다. 종양 차원 및 세포 기능의 미세 환경의 영향은 잘 약물 반응 1,3,5-8을 변경하는 두 요소로 설정됩니다. 또한, 세포 성장 속도론, 신진 대사 속도와 세포 신호는 원숭이 이러한 요소와 함께, 3D로 두 차원 (2D) 문화와 문화 사이에 차이가세포 반응 1,3,8-10을 cting. 시험관 내에서 종양 미세 환경 대리 대표적 ECM 성분 및 간질 세포 집단을 포함하여 변조 될 수있다. 악성 상피 세포는 더 종양 전파 5,6,10-을 억제하기 위해 ECM 및 암 관련 기질 세포에 의해 하나 종양의 진행을 촉진 상승 / 보호 방식으로 또는 억제 방식으로 영향을 받는다. 어느 상황에서, 간질 약물 전달 1,6- 감소 분비 시그널링을 통해 그리고 / 또는 결과적으로 종양 내 삽입 압력을 증가시킴으로써, 치료 반응 및 약물 전달에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 전임상 모델에 ECM 및 간질 세포의 추가 차원 배양에서 잘 모델링 될 수 종양의 양태 요점을 되풀이 도울 것이다. 본원 방법은 ECM 성분 및 (S)를 포함하는 미세 recapitulative 통합 유방암 대용을 수립3 차원 볼륨 tromal 세포를 설명한다. 유방암에서 간질 세포 집단은 주로 암 관련 아세포 (CAF)과 간질 ECM 구성되어 주로 라미닌 콜라겐 타입 IV를 포함하는 기저막에서 발견되는 매트릭스 성분의 적은 비율로 콜라겐 타입 I로 구성되는 1,4,11-13. 그러므로, 유방 종양 미세 환경의 이러한 구성 요소 (즉, CAF는 콜라겐 I 및 기저막)는 대리로 통합되었다. 이 방법은 고체 비 - 관류 차원 대리 (도 1A)를 생성하거나 바이오 리액터 (도 1b)을 통해 서로 게이트를 통해 매체의 관류를 포함하도록 구성 될 수 사용될 수있다. 두 가지 접근법은 여기에 설명되어 있습니다. 이 방법은 또한 종양 연관된 대 식세포와 같은 다른 기질 요소를 포함하는, 또는 적절한 셀룰러 및 ECM 성분을 조정함으로써, 고형 종양을 모델링하기 위해 수정 될 수있다. <p유방 암종 대리 대한 클래스 = &quot;jove_content가&quot;&gt; 여기서 설명 우리는 MDA-MB-231 (231) 유방암 세포주, CAF는 이전 인간 유방암 (14)로부터 격리 이용했다 및 ECM은 (90 % 콜라겐 I 이루어지는 6 ㎎ / ㎖) 및 10 %의 성장 인자 감소 된 기저막 재료 (BM). 대리 역시 8 웰 챔버 슬라이드 (고체 대리)에서 성장하거나 바이오 리액터 시스템은 연속 관류 영양소 (관류 대리)를 제공하는데 이용된다. ECM 포함 된 셀의 체적을 수용 할 수있는 관류 생물 반응기 시스템 (15)을 사용할 수있다. 예를 들어, 우리는 바이오 리액터에서 조직 대용의 제조를 설명한다. 이 시스템은 자체 개발 및 상업적으로 사용할 수 없습니다되었다. 우리의 초점은 여기에 3 차원 조직 대용의 준비 및 분석에 있기 때문에, 우리는 우리의 생물 반응기 시스템의 제조 및 조립의 특성에 대한 광범위한 세부 사항으로 사라하지 않았습니다. 그러나, 상세한 설명이 시스템의 개발은 16 게시되었습니다. 본 생물 반응기 시스템에서, 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 유로는 PDMS 발포체 지원하는 대리를 수용하기 위해 사용된다 (Calcagnile 외. (17)에 의해 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여 형성됨). 이 볼륨 연속적 대리 산소와 영양분을 공급하는 펌프를 통해 microphysiologic 매체에 의해 관류되는 4 마이크로 채널 (직경 400 μm의 각각)에 의해 관통된다. 대용의 적절한 분석은 치료 또는 다른 조작에 응답하여 세포 기능에 대한 관련 정보를 얻기 위해 매우 중요합니다. 대체물은 고정 및 가공 후 분비 된 제품 또는 조직 학적 섹션을 분석을 위해, 공 초점 현미경 또는 비 침습성 영상화의 다른 수단의 조정 배지 또는 관류 액을 분석함으로써 간접적으로 세포 분석을 이용하여 그대로 대용 직접 영상을 포함하는 다양한 방법에 의해 분석 될 수있다 에파라핀. 조직학 부분에 평가 될 수있다 그러한 파라미터는 셀 밀도이다. 우리는 세포 밀도를 측정하는 한 가지 방법을 제시한다 (즉, 단면적 당 유핵 세포의 수) 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E) 염색을 대리 학적 섹션 현미경인가 반자동 화상 처리 기술을 사용. 세포 밀도는 시간에 따른 세포 수의 상대적인 변화의 지표로 사용할 수도 있고, 그 다양한 성장 조건으로 치료의 결과. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54004/54004fig1.jpg" /> 그림 1. 3D 볼륨 및 생물 반응기 시스템. 프로세스 A) 도식은 고체의 3D 대리를 생성합니다. 탑 : ECM (핑크), (노란색) 상피 암 세포 및 CAF (오렌지)를 포함하는 고체 3D 볼륨의 만화; 아래 :. 8 잘 챔버 슬라이드 포함 대리의 상위 뷰 B) 도식 프로세스는 3D 대리를 관류 생성합니다. 탑 : 캘리포니아채널 3D 볼륨의 rtoon 매체 관류 및 포함하는 ECM (핑크), 상피 암 세포 (노란색), 및 CAF (오렌지)을 허용하는 단계; 중간 : 발포 PDMS (흑색 화살표)를 포함 PDMS 유로의 이미지 셀 ECM + 주입 및 직경 400 μm의 측정 중합체 피복 스테인리스 와이어 (핑크 화살표)을 관통하는 단계; 바닥 :. 대리 함유 연속 매체 관류를 허용하는 바이오 리액터 시스템에 연결된 PDMS 유로의 화상 (연동 펌프 및 미디어 저장하지 않음) C) 배양 후의 고체 관류 대용 모두 처리 단계의 이미지. 왼쪽 : 젤 대리를 처리하는 표본을 포함하는 cryomold의 이미지; 중간 : 고정 가공 대리를 함유하는 파라핀 블록의 이미지; 오른쪽 :. 대리의 H &amp; E 염색 조직 학적 섹션 유리 슬라이드의 이미지 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54004/54004fig1large.jpg" target="_blank">을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 더 큰 버전.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="465">
	<tbody>
		<tr height="94">
			<td height="94" style="height:94px;width:131px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagel Medium 1x (DMEM)</td>
			<td style="width:107px;">Corning CellGro</td>
			<td style="width:107px;">10-014-CV</td>
			<td style="width:121px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:131px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:107px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:107px;">S11150</td>
			<td style="width:121px;"></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:131px;">0.25% Trypsin + 2.21 mM EDTA 1x</td>
			<td style="width:107px;">Corning</td>
			<td style="width:107px;">25-053-CI</td>
			<td style="width:121px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:131px;">Tissue Culture plates, 100mm</td>
			<td style="width:107px;">CellTreat Scientific Products</td>
			<td style="width:107px;">229620</td>
			<td style="width:121px;">Sterile</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:131px;">Tissue Culture plates, 35mm</td>
			<td style="width:107px;">CellTreat Scientific Products</td>
			<td style="width:107px;">229638</td>
			<td style="width:121px;">For PDMS foam formation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:131px;">9&#34; Glass pipette</td>
			<td style="width:107px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:107px;">13-678-20D</td>
			<td style="width:121px;">Sterile</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:131px;">10 ml pipette</td>
			<td style="width:107px;">CellTreat Scientific Products</td>
			<td style="width:107px;">229210B</td>
			<td style="width:121px;">Sterile</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:131px;">1000 &#181;l piptette tips</td>
			<td style="width:107px;">FisherBrand</td>
			<td style="width:107px;">02-717-166</td>
			<td style="width:121px;">Sterile Filtered</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:131px;">200 &#181;l pipette tips</td>
			<td style="width:107px;">FisherBrand</td>
			<td style="width:107px;">02-717-141</td>
			<td style="width:121px;">Sterile Filtered</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:131px;">10 &#181;l pipette tips</td>
			<td style="width:107px;">FisherBrand</td>
			<td style="width:107px;">02-717-158</td>
			<td style="width:121px;">Sterile Filtered</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:131px;">15 ml conical tubes</td>
			<td style="width:107px;">CellTreat Scientific Products</td>
			<td style="width:107px;">229410</td>
			<td style="width:121px;">Sterile</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:131px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:107px;">CellTreat Scientific Products</td>
			<td style="width:107px;">229422</td>
			<td style="width:121px;">Sterile</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:131px;">1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
			<td style="width:107px;">FisherBrand</td>
			<td style="width:107px;">05-408-129</td>
			<td style="width:121px;">Sterile</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:131px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:107px;">Corning Cellgro</td>
			<td style="width:107px;">25-900-CI</td>
			<td style="width:121px;">Sterile</td>
		</tr>
		<tr height="125">
			<td height="125" style="height:125px;width:131px;">Sylgard 184</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:107px;">24236-10</td>
			<td style="width:121px;">PDMS elastomer and curing agent. Used for our in-house bioreactor.</td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:131px;">PDMS Foam</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:121px;">Made in-house for use in our in-house bioreactor.</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:131px;">High Concentration Bovine Collagen Type I</td>
			<td style="width:107px;">Advanced Biomatrix</td>
			<td style="width:107px;">5133-A</td>
			<td style="width:121px;">FibriCol ~10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:131px;">Growth Factor Reduced Matrigel (Basement Membrane)</td>
			<td style="width:107px;">Corning</td>
			<td style="width:107px;">354230</td>
			<td style="width:121px;">Basement membrane material</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:131px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">S8761</td>
			<td style="width:121px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:131px;">Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:107px;">Fisher</td>
			<td style="width:107px;">BP2819-1</td>
			<td style="width:121px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:131px;">DMEM 10x&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">D2429</td>
			<td style="width:121px;"></td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:131px;">Nunc Lab-Tek Chamber Slide System&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:107px;">177402</td>
			<td style="width:121px;">8-well</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;width:131px;">Bioreactor</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:121px;">Made in-house.</td>
		</tr>
		<tr height="185">
			<td height="185" style="height:185px;width:131px;">Spring-Back 304 Stainless Steel&#8212;Coated with PTFE polymer</td>
			<td style="width:107px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:107px;">1749T19</td>
			<td style="width:121px;">Stainless steel wires to generate microchannels in our in-house&#160; bioreactor system. 0.016&#34; Diameter</td>
		</tr>
		<tr height="154">
			<td height="154" style="height:154px;width:131px;">BioPharm Plus platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14</td>
			<td style="width:107px;">Masterflex&#160;</td>
			<td style="width:107px;">EW-96440-14</td>
			<td style="width:121px;">For use in our in-house bioreactor system. Tubing ID: 1.6 mm, Hose barb size: 1/16 in.</td>
		</tr>
		<tr height="158">
			<td height="158" style="height:158px;width:131px;">2-Stop Tubing Sets, non-flared PVC, 1.52 mm ID</td>
			<td style="width:107px;">Cole-Parmer&#160;</td>
			<td style="width:107px;">EW-74906-36</td>
			<td style="width:121px;">For use in our in-house bioreactor system (with microperistalitic pump).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="158">
			<td height="158" style="height:158px;width:131px;">Six Channel precision micro peristaltic pump</td>
			<td style="width:107px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:107px;">EW-74906-04</td>
			<td style="width:121px;">For use with our in-house bioreactor system</td>
		</tr>
		<tr height="166">
			<td height="166" style="height:166px;width:131px;">Labtainer BPC Bag &#8211; 2 Ports, Luer Lock 
			50mL</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:107px;">&#8203;SH3065711</td>
			<td style="width:121px;">Example Media Reservoir&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="65">
			<td height="65" style="height:65px;width:131px;">Tuberculin Syringes</td>
			<td style="width:107px;">BD Medical</td>
			<td style="width:107px;">309625</td>
			<td style="width:121px;">26 gauge 3/8 in. needle; Sterile</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:131px;">Dissecting Tissue Forceps</td>
			<td style="width:107px;">FisherBrand</td>
			<td style="width:107px;">13-812-36</td>
			<td style="width:121px;">5.5 inch</td>
		</tr>
		<tr height="180">
			<td height="180" style="height:180px;width:131px;">Mini Tube Rotator</td>
			<td style="width:107px;">Boekel Scientific</td>
			<td style="width:107px;">260750</td>
			<td style="width:121px;">Equipment option for surrogate rotation. Used with carousel for 50 ml tubes (model number 260753)</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:131px;">50 ml tube carousel</td>
			<td style="width:107px;">Boekel Scientific</td>
			<td style="width:107px;">260753</td>
			<td style="width:121px;">Used with mini tube rotator</td>
		</tr>
		<tr height="88">
			<td height="88" style="height:88px;width:131px;">Bambino&#160; Hybridization Oven</td>
			<td style="width:107px;">Boekel Scientific</td>
			<td style="width:107px;">230301</td>
			<td style="width:121px;">Equipment option for surrogate rotation</td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;width:131px;">HistoGel Specimen Processing Gel</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:107px;">HG-4000-012</td>
			<td style="width:121px;">Specimen Processing Gel described in Step 5.2</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:131px;">Cryomold</td>
			<td style="width:107px;">Andwin Scientific</td>
			<td style="width:107px;">4566</td>
			<td style="width:121px;">15 mm x 15 mm x 5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="192">
			<td height="192" style="height:192px;width:131px;">Tissue Marking Dye</td>
			<td style="width:107px;">Cancer Diagnostics, inc.&#160;</td>
			<td style="width:107px;">03000P</td>
			<td style="width:121px;">Can be used to mark surrogates,&#160; allowing multiple samples to be included in one tissue cassette&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:131px;">Hinged tissue cassettes&#160;</td>
			<td style="width:107px;">FisherBrand</td>
			<td style="width:107px;">22-272-416</td>
			<td style="width:121px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:131px;">Formalin</td>
			<td style="width:107px;">Fisher</td>
			<td style="width:107px;">23-245-685</td>
			<td style="width:121px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:131px;">GoldSeal Plain Glass Slides</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:107px;">3048-002</td>
			<td style="width:121px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:131px;">Xylene</td>
			<td style="width:107px;">Fisher</td>
			<td style="width:107px;">X3P-1GAL</td>
			<td style="width:121px;"></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:131px;">Ethanol, 200 proof (100%), USP</td>
			<td style="width:107px;">Decon Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:107px;">2805M</td>
			<td style="width:121px;"></td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;width:131px;">Hematoxylin</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td>
			<td style="width:107px;">7211</td>
			<td style="width:121px;"></td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;width:131px;">Clarifier</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td>
			<td style="width:107px;">7401</td>
			<td style="width:121px;"></td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;width:131px;">Bluing Solution</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td>
			<td style="width:107px;">7301</td>
			<td style="width:121px;"></td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;width:131px;">Eosin Y</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td>
			<td style="width:107px;">7111</td>
			<td style="width:121px;"></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:131px;">Cytoseal XYL mounting media</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td>
			<td style="width:107px;">83124</td>
			<td style="width:121px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:131px;">Coverslips</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:107px;">12-548-5G</td>
			<td style="width:121px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and analysis of in vitro three dimensional breast carcinoma surrogates

삼차원 (3D) 배양 이차원 배양보다 시험 관내에서 세포 행동 모델에 더 중요한 생리 학적 방법이다. 유방 암종을 비롯한 암종, 섬유 아세포 및 세포 외 기질 (ECM)을 포함 경부암 상피 세포 및 간질 성분으로 이루어지는 복잡한 3 차원 조직이다. 그러나 유방암 대부분의 시험 관내 모델에 따라서, 기질을 생략 만 암 상피 세포로 구성하고, 생체 내에서 종양의 3 차원 구조. 암의 적절한 3D 모델링 종양 생물학, 행동 및 치료에 대한 반응의 정확한 이해를 위해 중요하다. 그러나, 문화, 3D 모델의 볼륨의 지속 시간은 문화 내에서 산소와 영양분의 가용성에 의해 제한된다. 여기서, 우리는 유방암 상피 세포 및 섬유 아세포가 간질 기질을 포함하고으로 배양 할 수있는 3D 유방암 대리를 생성 ECM에 포함시키는 방법을 보여고체 차원 구조 또는 산소와 영양분을 제공하기 위해 관류 생물 반응기 시스템을 사용함으로써. 설정 및 초기 성장 기간 후, 대리모는 임상 약물 테스트에 사용될 수있다. 대안 적으로, 대리모의 세포 매트릭스 성분은 생물학적 다양한 질문을 해결하기 위해 변형 될 수있다. 배양 후, 대체물은 고정 관심 파라미터의 평가를위한 임상 유방암 표본의 처리와 유사한 방식으로, 파라핀 처리된다. ImageJ에 CellProfiler 및 이미지 분석 소프트웨어 시스템을 대리의 조직​​ 학적 섹션 현미경에 적용되고, 설명 하나의 파라미터, 본 셀의 밀도 평가 면적당의 유핵 세포 수를 정량화한다. 이것은 시간이 지남에 따라 세포 수의 변화 또는 다양한 성장 조건으로 치료로 인한 세포 수의 변화의 지표로 사용될 수있다.

7 일간 상술 한 바와 같이 성장 두 고체 및 관류 3D 유방암 대체물을 제조 하였다. 이어서, 대체물은 고정 된 파라핀 처리, 절단, 전술 한 바와 같이, 헤 마톡 실린 및 에오신으로 염색 하였다. 핵 생성 영역 당 셀 (모두 231 세포 및 CAF) 각각의 대용의 수를 측정 하였다. 도 12에서 알 수있는 바와 같이, H &amp; E 염색 섹션 나타내는 현미경 세포의 농도가 초기에 통합하더라도, 고체 대용 (도 12b)에 비해 관류 대용 (도 12a)에 존재하는 세포의 높은 농도를 보여 대용은 모두 고체 및 관류 조건에서 동일하다. 세포 성장이 시각적 표현은 관류 대용 인 영역 (밀도) 당 세포의 높은 평균 개수에 의해지지된다 (N = 3) (N = 3), t에 의해 결정되는, 고체 대용 비해그는 분석 (그림 12C)를 CellProfiler. 도 12C에서 데이터를 획득하기 위해, 각 대리인의 전체 조직 학적 단면은 각 대리 여러 이미지를 필요로 묘화하고, 전술 한 바와 같이 이미지가 분석되었다. 그리고, 각 대리 대한 핵의 총수가 대리의 총 면적으로 나누어 각 대리하는 세포 밀도를 제공 (핵 / 1 × 106 픽셀 (2)의 개수로 표현). 유핵 세포 정량 CellProfiler의 사용을 확인하기 위해, CellProfiler 프로그램을 사용하여 결과를 수동으로 단순히 6 대용 (표 3)의 각각의 면적당 존재하는 세포의 수를 카운트하여 얻은 결과와 비교 하였다. 각 대용의 셀 밀도는 전술 한 바와 같이 계산 하였다. 유의 한 차이는 (관류 대리 (P = 0.855) 또는 고체 대리 중 하나에 대한 수동 계산 및 CellProfiler 분석에 의해 얻어진 세포 밀도에서 찾을 수 없습니다<html> P = 0.553). 고체 및 관류 대용 간 세포 밀도의 차이가 세포 증식의 차이에 상관 관계가 있음을 지원하기 위해, 각 대리인의 세포 증식은 유사 분열 (도 12D) (27)의 면역 조직 화학적 분석을 통해 평가 하였다. 동일한 경향은 관류 대용 세포 증식을 상당히 높은 비율로 발견되었다 (N = 3) 고체 대용 비교 (N = 3) 관류 대용에서 높은 성장 속도를 지시하고, 증가 된 세포 밀도와 상관 이 대리의. 셀 입력 할 때 (즉, 유방암 상피 또는 CAF)를 더 특정 세포 집단의 성장 또는 분포를 이해하기 위해 사용될 수 세포 유형 특이 마커에 대한 면역 염색, 이러한 측정에서 평가되지 않았다. 이 과정을 자세히 설명 프로토콜은 이전에 25, 28을 발표했다. <html> 레 / ftp_upload / 54004 / 54004fig12.jpg &quot;/&gt; 12. 대표 결과 그림. A) 7 일간 성장 된 관류 대리에서 H &amp; E 염색 부 (400X 원래 배율). B) 중 7 일 동안 성장 고체 대리에서 H &amp; E 염색 부분의 대표 이미지의 대표 이미지는 2 일마다 변경 (400X 원래 배율) 관류 (미디어의 변화 없음) 및 고체 대리 7 일 성장 (미디어가 2 일마다 변경). D) Ki-의 비교 다음과 같습니다. C) 지역, 또는 세포 밀도 당 유핵 세포의 평균 수의 비교, 67 표지 지수 (즉, 기-67을 표현 인구에서 세포의 비율), 관류 및 고체 대리 7 일 성장 다음 세포 증식의 측정. 데이터 SEM ± 평균을 나타내고, n은 상태에 따라 3, ** (학생의 t- 테스트) p≤0.01을 나타내며, ***는 p≤0.001를 나타냅니다.tp_upload / 54004 / 54004fig12highres.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 실험 </td><td> CellProfiler : 면적당 핵 세포 </td><td> 수동 : 면적당 핵 세포 </td><td> 평균 CellProfiler </td><td> 평균 매뉴얼 </td><td> P 값 (페어로의 t 시험) </td></tr><tr><td> 대리 1 관류 </td><td> 88.178 </td><td> 75.532 </td><td> 97.225 </td><td> 99.901 </td><td> 0.855 </td></tr><tr><td> 대리 2 관류 </td><td> 107.528 </td><td> 117.812 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 대리 3 관류 </td><td> 95.967 </td><td> 106.359 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 에스대리 한 올 리드 </td><td> 19.797 </td><td> 17.480 </td><td> 16.491 </td><td> 12.991 </td><td> 0.553 </td></tr><tr><td> 솔리드 대리 2 </td><td> 8.612 </td><td> 5.650 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 솔리드 대리 3 </td><td> 21.065 </td><td> 15.844 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 고체 (3, 3) 관류 대리에 대한 수동 또는 CellProfiler 분석에 의해 얻어진 표 3 셀 밀도.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates at JoVE.com

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

준비 및 분석<em&gt; 체외</em&gt; 3 차원 유방 암 서로 게이트

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

preparation-analysis-vitro-three-dimensional-breast-carcinoma

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

10.5K 조회수.  University of Alabama at Birmingham. We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

비디오: Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

입체 광학 해상도 Photoacoustic 현미경

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

연구

생체공학

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

난소와 Oviducts의 3 차원 조직 문화 알긴산의 Hydrogels

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

전도성 잉크의 평면 및 3 차원 인쇄

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

세 가지 차원 콜라겐 매트릭스 내에서 세포의 이동 분석

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

3 차원 전체 두께 피부의 세대 동등한 및 자동화 부상

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

복원 된 인간의 각막 모양의 상피 (RHCE) 조직 모델을 사용하여 눈에 자극성 화학 물질의 위험 식별을위한 눈 자극 시험 (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created. 
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

전기 방사를 적응하는 것은 트라이 계층에 대한 세 가지 독특한 환경을 제공하기 위해<em&gt; 체외</em&gt;기도 벽의 모델

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

세포 외 매트릭스 내에서 임베디드 공학 3 차원 상피 조직

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.