We thank Dr. Chao-Sheng Cheng at National Tsing Hua University, Taiwan, for performing the circular dichroism measurement. We also thank Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA, for providing the anti-HP-NAP monoclonal antibody. We appreciate Drs. Han-Wen Chang and Chung-Chu Chen at Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for providing advice for IRB application, Mr. Te-Lung Tsai at the Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for supervising the analysis of isolated neutrophils, and Ms. Ju-Chen Weng at National Tsing Hua University, Taiwan, for her technical assistance. This work was supported by grants from the Ministry of Science and Technology of Taiwan (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 and NSC98-2311-B-007-006-MY3), the Joint Research Program of National Tsing Hua University and Mackay Memorial Hospital (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1), and the research program of National Tsing Hua University (104N2052E1).

인간의 혈액은 국립 칭화 대학의 임상 시험 심사위원회, 신주, 대만의 사전 서면 동의 및 승인을 건강한 지원자에서 수집 하였다. E.에서 재조합 HP-NAP의 1 식 대장균 <ol><li> H.에서 HP-NAP의 DNA 서열을 함유하는 플라스미드 pET42a-NAP 준비 파이로리 26695 균주는 이전 16 설명했다. 설명 된 바와 같이 원하는 포인트 돌연변이 HP-NAP의 DNA 서열을 함유하는 플라스미드를 준비 (프로토콜, 단계 8 참조). </li><li> E.에 상기 DNA 플라스미드 10 ng의 변형 대장균 BL21 (DE3) 42 ° C 45 초 동안 열 충격에 의해 유능한 세포, 행진 50 μg의 / ㎖ 카나마이신, 그리고 16 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어 포함 판 한천 원성 국물에 세포 (LB). </li><li> 50 μg의 / ㎖ 카나마이신과 LB 배지 5 ㎖를 포함하는 각각의 튜브에 단일 콜로니를 접종하고 3에서 precultures로 성장170 rpm으로 진탕 16 시간 동안 11 ° C를. </li><li> 1 L 플라스크를 50㎍ / ㎖ 카나마이신을 함유하는 LB 배지 200 ㎖에 상기 예비 배양 세포를 2 ㎖를 접종한다. 대략적은 UV / VIS 분광 광도계에 의해 검출 0.4-0.5 도달 내지 600 nm에서의 흡광도까지 170 rpm으로 진탕하면서 2 시간 동안 37 ℃에서 접종 된 배양 플라스크를 인큐베이션. </li><li> HP-NAP의 발현을 유도하기 위하여 0.4 mM의 최종 농도로 상기 배양에 1 M 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)의 80 μL를 추가한다. 약 1.6-1.7에 도달 내지 600 nm에서의 흡광도 때까지 3 시간 동안 문화를 품어. </li><li> 원심 분리기에서 15 분 동안 4 ℃에서 6,000 XG에 세포 상층 액을 제거한다. 정화 될 때까지 -70 ℃에서 세포 펠렛을 저장합니다. </li></ol> HP-NAP를 포함하는 가용성 단백질 분획 2. 제조 참고 : 다음 단계는 모두 4 ℃에서 수행된다. <ol><li> 셀 (p)의 재현 탁 50 ㎖에서 프로토콜 단계 1.6에서 제조 ellet 20 20 mM 트리스 - 염산, pH가 9.0, 50 mM의 NaCl을 함유하는 0.13 mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF), 0.03 mM의 N 알파 토실-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK) 및 0.03 ml의 4 ° C에서 mM의 N-토실-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK)는 이전과 같이 16을 설명했다. </li><li> 39 ° C에서 7 시간 15,000 20,000 PSI의 범위에서 작동되는 고압 균질화 통해 세균 현탁액을 전달하여 균체를 방해. </li><li> 원심 1 시간 동안 4 ℃에서 30,000 × g에서 파쇄를 초 원심 분리기를 사용하여 가용성 및 불용성 단백질 분획을 분리한다. 비커에 수용성 단백질 분획으로 뜨는을 전송합니다. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 표준으로 소 혈청 알부민 (BSA)과 상업용 키트를 사용하여 브래드 포드 (Bradford) 방법에 의해 가용성 단백질 분획의 단백질 농도를 측정한다. </li><li> 제 20 ㎖에 1 N 염산의 177.6 μl를 추가pH를 8.0으로 pH를 9.0의 pH 값을 조정 프로토콜 단계 2.3로부터 얻어지는 전자 수용성 단백질 분획. </li><li> 최종 단백질 농도가 0.5 ㎎ / ㎖가 될 수 있도록 상기 단백질 용액을 20 mM의 트리스 -HCl, pH가 8.0, 50 mM의 NaCl을 추가. </li></ol> E.에서 재조합 HP-NAP 3. 정제 DEAE 이온 교환 수지에 부정적인 모드 배치 크로마토 그래피에 의한 대장균 <ol><li> DEAE 수지 15 ml의를 준비합니다. <ol><li> DEAE 수지 중 0.6 g 건조 분말의 무게를 적어도 1 일 동안 실온에서 20 mM 트리스 - 염산, pH가 8.0, 50 mM의 NaCl을 30 mL의에 중단. </li><li> 10,000 X에서 수지를 원심 분리기 1 분 4 ° C에서 g. </li><li> 제거하고 상층 액을 버린다. </li><li> 20 mM 트리스 - 염산, pH를 8.0, 50 mM의 염화나트륨의 15 ML을 추가합니다. </li><li> 프로토콜 3.1.2 사 3.1.4에 번 단계를 반복합니다. </li><li> 15 ml의 후속 사용을 위해 4 ℃에서 수지 (30 ㎖ 트리스 완충액 중의 50 % 슬러리)을 정착 저장한다. 주 : 다음 단계의 모두의 4 ° C에서 수행된다. </li></ol></li><li> 수지의 15 ml의 프로토콜 단계 2.6에서 제조 된 수용성 단백질의 45 ML을 추가하고 1 시간 동안 4 ° C에서 자석 교반기와 단백질 / 수지 슬러리를 교반한다. </li><li> 스톱 콕이 장착 된 플라스틱 또는 유리 컬럼에 단백질 / 수지 슬러리를 따르십시오. 수지가 중력 정착하도록 허용합니다. </li><li> 칼럼 내의 액체 레벨이 단지 수지 위에까지 단백질 용액이 중력 흐름에 의해 열을 실행할 수 있도록하는 콕을 열고. 플로우를 통해 정제 된 HP-NAP를 포함하는 언 바운드 분수 등을 수집합니다. </li><li> 컬럼에 얼음처럼 차가운 20 mM 트리스 - 염산, pH를 8.0, 50 mM의 NaCl을 15 ML을 추가합니다. </li><li> 칼럼 내의 액체 레벨이 아니라 수지를 초과 할 때까지 세척 완충액이 중력 흐름에 의해 열을 통해 실행할 수 있도록 스톱 콕을 열고. 플로우 스루 세척 분획으로서 수집. </li><li> 의정서는 추가 세척 분수를 수집하기 위해 3.5 네 3​​.6 번 단계를 반복합니다. </li><li> 컬럼에 얼음처럼 차가운 20 mM 트리스 - 염산, pH를 8.0, 1 M NaCl을 15 ML을 추가합니다. </li><li> 칼럼 내의 액체 레벨이 단지 수지 위에까지 용출 완충제는 중력 유동에 의해 열을 통해 실행할 수 있도록 스톱 콕을 열고. 플로우 스루 용출 분획으로서 수집. </li><li> 프로토콜이 추가​​ 용출 분수를 수집하기 위해 3.8 네 3.9 번 단계를 반복합니다. </li></ol> 4. 버퍼 Exchange 및 DEAE 수지와 네거티브 모드 배치 크로마토 그래피로 정제하여 HP-NAP의 독소 제거 참고 : 정제 된 HP-NAP는 E. 표현 대장균 교환 및 호중구를 자극하기 전 독소 제거 버퍼링 실시 할 필요가있다. <ol><li> 이전 24 바와 같이 14 kDa의 분자량 컷오프 투석 튜빙을 사용하여 4 ℃에서, 둘 베코 인산 완충 생리 식염수 (D-PBS), pH를 7.2로 정제 HP-NAP의 버퍼를 변경 투석을 수행한다. </li><li> syring를 통해 투석 HP-NAP 필터독소를 제거하기 위해 4 ℃에서 2.5 내지 4 ㎖ / 분 범위의 유속으로 20 ㎖의 일회용 주사기에 부착 된 양으로 하전 된 친수성 ​​막과 E 필터. </li></ol> 나트륨 도데 실 설페이트 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE), 웨스턴 블로 팅, 기본-PAGE, 젤 여과 크로마토 그래피하고, 원 편광 이색 분광학에 의해 정제 된 재조합 HP-NAP의 분자 특성 5. 특성 <ol><li> 마우스 단일 클론 항체 단클론 항체 16F4 (25)를 포함하는 하이 브리 도마 배양 상층 액과 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로 팅에 의해 정제 된 재조합 HP-NAP 분석으로 이전 24 설명했다. </li><li> 이전 26 바와 같이 올리고머의 상태를 검사하는 네이티브-PAGE 겔 여과 크로마토 그래피에 의해 정제하여 HP-NAP 분석. </li><li> 이전 26 설명 된 바와 같이 그 차 구조를 조사하기 위해 원 편광 이색 분광기에 의해 정제 된 재조합 HP-NAP를 분석합니다. </li></ol> SDS-PAGE 젤의 실버 염색하여 HP-NAP의 순도 6. 평가 <ol><li> 실버 염색 키트 제조업체의 지시에 따라, 용액은 용액, 현상액 민감 정착 용액을 조제 액을 정지하고, 세정 용액. </li><li> 실버 염색 키트 제조업체의 지침에 따라 SDS-PAGE 젤은 염색을 수행합니다. </li><li> 촬상 시스템 겔의 화상을 취득. </li></ol> HP-NAP에 의해 유도 된 호중구에서 ROS 생산 7. 측정 <ol><li> 이전 24 바와 같은 밀도 구배 원심 분리하여 인간 덱스 트란 침강 헤파린 혈액으로부터 인간 호중구를 분리. </li><li> 호중구에서 ROS 생성의 측정은 루미놀 의존 화학 발광 분석을 사용하여 HP-NAP 자극. <ol><li> 접시 리더의 전원을 켜고 37 ° C의 온도를 설정합니다. 배치그것은 37 ° C로 예열 할 수 있도록 플레이트 리더 챔버 내부의 빈 평평한 바닥 96 웰 흰색 접시. </li><li> 유무와 0.9 mM의 CaCl2를 0.5 밀리미터의 MgCl 2, 13.3 μM 5- 아미노 -2,3- 디 히드로 -1,4- phthalazinedione (루미놀)를 포함하는 상기 D-PBS, pH를 7.2에서 부양 혼합물을 준비 프로토콜 단계 4.2에서 준비 0.67 μm의 독소를 제거 HP-NAP의. </li><li> 5 mM의 포도당을 함유하는 D-PBS, pH를 7.2에서 7.1 × 106 내지 2 세포 / ㎖, 프로토콜 단계에서 제조 된 인간 호중구의 농도를 조정한다. </li><li> 96 웰 동안 플레이트의 각 웰에 호중구 현탁액의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 웰 당 5 초 간격으로 웰에 호중구 함유 프로토콜 단계 7.2.2에서 제조 한 자극의 혼합물 150 μl를 추가한다. </li><li> 플레이트 판독기를 사용하여 한 3 시간에 걸쳐 웰 당 5 초 동안 화학 발광의 발광을 측정한다. </li></ol></li></ol> 8.중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 DNA 플라스미드 숨겨 HP-NAP 돌연변이의 건설 사이트에 직접 돌연변이 유발을 기반 참고 : &quot;침묵&quot;제한 부위가 부위 특이 적 변이 (SDM) -assist 소프트웨어 (28)에 의해 돌연변이 유발 프라이머에 도입 된 것을 제외하고 이전 27 설명 된대로 PCR 기반의 사이트에 직접 돌연변이는 기본적으로 생성되었습니다. <ol><li> PCR 반응을 수행합니다. <ol><li> 최종주는 플라스미드 pET42a-NAP 10ng의 표 1에 열거 된 돌연변이 유발 성 프라이머 쌍을 1 μM, 뉴 클레오 시드 트리 포스페이트 (dNTPs를), 및 탈 이온수를 함유하는 PCR 튜브에 고성능 PCR 효소 믹스 3 유닛 200 μM 추가 25 μL의 볼륨. </li><li> 95에서 PCR 사이클을 시작 10 분 동안 ° C가 주형 DNA를 변성하고, 1 분 동안 95 ° C에서 12 증폭 사이클에 따라, T는 1 분 C ° -5 더 m이없고, 6 분 72 입출력 C. </li><li> 하여 PCR 사이클을 완료1 분의 T m PP -5 ℃로 어닐링 단계와 30 분 동안 72 ℃에서 연장 단계. </li></ol></li><li> 2 시간 동안 37 ° C에서 DPN I 제한 효소 0.4 μL와 PCR 생성물의 15 μl를 처리 한 후 아가 로스 겔 전기 영동으로 처리 DPN I-PCR 생성물의 2 μL를 분석한다. </li><li> 화면 돌연변이. <ol><li> E.으로 PCR 생성물의 2 μL 변환 42 ° C에서 45 초 동안 열 충격에 의해 대장균 DH5α 유능한 세포. </li><li> 를 50㎍ / ㎖의 카나마이신을 함유하는 LB 플레이트 상에 형질 전환 된 세포를 확산하고 16 시간 동안 37 ℃에서 플레이트 배양한다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 알칼리 용해 키트를 이용한 박테리아 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 분리. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 원하는 침묵 돌연변이의 존재를 확인하기를 XhoI 제한 효소로 프로토콜 단계 8.3.3에서 격리 플라스미드 DNA를 처리한다. </li><li> 시퀀스플라스미드 DNA는 제조자의 프로토콜에 따라 HP-NAP 돌연변이 체의 코딩 서열의 보정을 확인하기 위해 T7 프로모터 프라이머 프로토콜 단계 8.3.4로 확인 하였다. </li></ol></li></ol>

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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+chromatographic+purification+of+Helicobacter+pylori+protein+expressed+in+Bacillus+subtilis.">One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis.</a> PLoS One. 8 (4), e60786 (2013).</li><li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+one-step+site-directed+deletion,+insertion,+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol.">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC biotechnol. 8 (91), (2008).</li><li>Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SDM-assist+software+to+design+site-directed+mutagenesis+primers+introducing+'silent'+restriction+sites.">SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites.</a> BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).</li></ol>

HWF and YCY are inventors of patents TW I 432579 and US 8,673,312 for the method of one-step purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. All materials described in the manuscript will be available for research purposes. The authors confirm that this does not alter their adherence to all of the JoVE's policies on sharing data and materials.

여기서 제시 DEAE 음이온 교환 수지와 네가티브 모드 배치 크로마토 그래피 E 대장균 과발현 재조합 HP-NAP의 정제에 적합하다. 세포 용해 및 정제의 단계에서 사용 된 완충액의 pH 값은 E.에서 HP-NAP의 용해도를 보장하기 위해 매우 중요 대장균 해물 각각 숙주 세포 불순물 재조합 HP-NAP를 효율적으로 분리. 균체을 pH 9.0에 용해되어야하고, 음의 정제는 높은 수율 및 고순도 HP-NAP를 ?...

헬리코박터 파이로리 (H. pylori의)는 위염 및 소화성 궤양의 주요 원인이다. 이 박테리아는 또한 암, 세계 보건기구 (WHO)의 일부 연구에 대한 국제기구에 의해 인간 발암 물질로 분류되어, 1994 년에 그것은 추정되었음을 H.의 보급 pylori 감염은 개발 도상국의 70 %와 선진국 (1) 30 ~ 40 %이다. 비록 H.의 감염률 파이로리는 산업화 된 국가에서 H.의 감염률을 감소 개발 도상국에서 파이로리는 여전히이 높다. 표준 치료는 H.을 근절하기 pylori 감염은 프로톤 펌프 억제제, PPI, 2 개의 항생제, 클라리스로 마이신 플러스 아목시실린 또는 메트로니다졸 (3)의 관리로 구성되어 있습니다. H. 항생제 내성 그러나, 상승 파이로리는 궤양 치료 O 방지하는 새로운 전략의 개발을 촉구 - 관련R 감염을 치료. H.에 대한 예방 및 / 또는 치료 백신 개발 H. 파이로리를 제어하는 대안적인 방법을 제공 할 수있다 pylori 감염. 헬리코박터 파일로리 호중구 - 활성화 단백질 (HP-NAP), H 파일로리의 주요 독성 요인은 첫째 H.의 물 추출물에서 확인되었다 내피 세포 및 활성 산소 종 (ROS) (4)를 생성하기 위해 접착 호중구 활성화하는 능력 파이로리. H.에서 발견 된 위 점막의 호중구 침윤 pylori- 활성 위염에 감염 환자는 위장의 염증과 조직 손상 될 수 있습니다. 따라서, HP-NAP는 상기 궤양 H. 발생 위장 염증을 유도 호중구 활성화에 의해 병리학적인 역할을 할 수있다 파이로리는 위 질병을 -associated. 그럼에도 불구하고, HP-NAP 임상 응용 5,6에 대한 잠재적 인 후보입니다. 때문에 면역 원성 및 면역 프로에HP-NAP의 perties이 단백질은 백신, 치료제 및 진단 도구 개발하는데 사용될 수있다. 임상 실험은 H. 대 단백질 백신의 성분의 하나로서, 재조합 HP-NAP를 사용해 수행 한 파이로리. 이 백신은 수산화 알루미늄 제형 재조합 HP-NAP, 세포 독소 - 관련 유전자 A (cagA 유전자) 및 vacuolating 세포 독소의 A (바카) 단백질로 구성되며 상기 안전하고 인체 7 원성 것으로 입증되었다. 또한, HP-NAP는 암 치료 (8)에 대한 면역 반응을 -polarized 아래로 알레르기 반응 및 기생충 감염 9,10에 의해 유발 TH2 매개 면역 반응을 조절하는 (받은 Th1) T 도우미 타입 1을 트리거 강력한 면역 조절제 역할을합니다. 진단 같이, 재조합 HP-NAP 기반 ELISA는 H.에서 HP-NAP 대해 혈청 항체를 검출하기 위해 적용되어왔다 pylori 감염 환자 11 -infected. 한 연구는 보여 주었다 H.에서 혈청에서 HP-NAP 특정 항체의 수준 평로리는 위암 환자가 만성 위염 (12)을 가진 환자에서보다 유의하게 높았다 -infected. 또 다른 연구는 또한 HP-NAP에 대한 혈청 항체가 비 문부 위암 (13)의 존재와 연관된 것으로 나타났다. 따라서, 재조합 HP-NAP 기반 ELISA는 H.에서 위암의 예후에 대한 HP-NAP에 대한 혈청 항체를 검출하기 위해 적용 할 수있다 균은 환자 -infected. 함께 찍은, 정제 된 HP-NAP는 더욱 예방, 치료에 활용하고, H.의 예후 수 파일로리 질병뿐만 아니라 암 치료 -associated. 재조합 HP-NAP의 정화에 사용하는 여러 방법 중에서 네이티브 형태의 대장균 (대장균)에서 발현 두번째 정제 단계를 포함하는 겔 여과 크로마토 그래피는 고순도 HP-NAP 14-16 얻기 위해 필요한, 지금까지보고 . 여기서, 마이너스 모드 배치 크로마토 그래피를 사용하는 방법디 에틸 아미노 에틸 (DEAE) 이온 교환 수지는 E. 과발현 HP-NAP 정화용 설명 고 수율 및 고순도 대장균. 이러한 정제 기술은 숙주 세포 단백질 및 / 또는 수지 HP-NAP 이외의 불순물의 결합에 기초한다. pH가 8.0에서 HP-NAP를 제외하고 거의 다른 단백질이 결합되지 않은 부분에서 발견된다. 네거티브 모드에서 DEAE 이온 교환 크로마토 그래피를 사용하여이 정제 방법은 간단하고 시간 미 결합 분획의 수집을 한 단계 크로마토 재조합 HP-NAP의 정화를 허용함으로써 절약된다. (17) 면역 글로불린 G (IgG의) 18, 헤모글로빈 19 단백질 포스파타제 (20) 및 독성 인자 편모 21 바이러스와 같은, 또한 음극에 이온 교환 크로마토 그래피에 의해 정제하는 것으로보고 된 예 HP-NAP 여러 다른 생체 분자 이외에 방법. 불순물이 미량 인 경우 음의 모드는 이온 교환 크로마토 그래피 바람직대상 시료에 존재하는 구성 요소 (22)를 정제 할 수있다. 천연 또는 재조합 생체 분자의 정제에 부정적인 크로마토 그래피의 응용 프로그램은 최근에 23을 검토하고있다. 본 보고서는 E.에서 재조합 HP-NAP의 발현을위한 단계 프로토콜에 의해 단계를 제공합니다 콜라이, DEAE 이온 교환 수지와 네거티브 모드 배치 크로마토 그래피를 이용하여 HP-NAP의 세포 용해 및 정제. 정제 목적 단백질이 네거티브 모드에서 이온 교환 크로마토 그래피에 적합한 경우, 설명 된 프로토콜은 또한 정제 공정의 개발을위한 출발점으로 구성 될 수있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET42a-NAP&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>prepared as described in Supplementary data of Refernce 15&#160; 
			http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli BL21 (DE3)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>C6000-03</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>25389-94-0</td>
			<td>http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>MD Biomedical Inc</td>
			<td>101-367-93-1</td>
			<td>http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&#38;supplier=search&#38;name =IPTG%20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10837091001</td>
			<td>protease inhibitor 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-alpha-tosyl-L-lysinyl-chloromethylketone (TLCK)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7254</td>
			<td>protease inhibitor 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-tosyl-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (TPCK)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4376</td>
			<td>protease inhibitor 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad protein assay dye reagent concentrate</td>
			<td>Bio&#8208;Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>for protein quantitation 
			http://www.bio-rad.com/en-us/sku/5000006-bio-rad-protein-assay-dye-reagent-concentrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein standard (bovine serum albumin)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5619&#160;</td>
			<td>a standard protein for Bio-Rad Protein Assay 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEAE&#8211;Sephadex &#160;A-25 chloride form</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A25120</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrum/Por dialysis tubing</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132720</td>
			<td>with molecular weight cutoff of 14 kDa 
			http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc&#174; units with Mustang&#174; E membrane</td>
			<td>Pall</td>
			<td>MSTG25E3</td>
			<td>for endotoxin removal; operated at flow rates ranging from 1 to 4 ml/min 
			http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal antibody MAb 16F4</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>raised against the purified HP-NAP of H. pylori strain NCTC 11637 as described in Refernce 23;&#160; A gift from Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA 
			http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>28989335</td>
			<td>for gel filtration chromatography 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlusOne silver staining kit, protein</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-1150-01</td>
			<td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>for density gradient centrifugation to purify human neutrophils 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure _16963/17144002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat bottom 96-well white plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>236108</td>
			<td>http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8511</td>
			<td>protected from light 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expand &#160;long template PCR system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11681834001</td>
			<td>source of High Fidelity PCR enzyme mix 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&#38;region=TW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dpn I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0176S</td>
			<td>https://www.neb.com/products/r0176-dpni</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xho I</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td>https://www.neb.com/products/r0146-xhoi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli DH5&#945;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>18265-017</td>
			<td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Product Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td> 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-2800 double beam UV/VIS spectrophotometer</td>
			<td>Hitachi&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>out of market and upgraded to a new model 
			http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EmulsiFlex-C3 high pressure homogenizer</td>
			<td>Avestin Inc</td>
			<td>C315320</td>
			<td>http://www.avestin.com/English/c3page.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi Koki himac CP80WX general ultracentrifuge</td>
			<td>Hitachi Koki Co</td>
			<td>90106401</td>
			<td>for separation of the soluble and insoluble protein fractions from E. coli lysates 
			http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#196;KTA FPLC</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>18-1900-26</td>
			<td>for gel filtration chromatography 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aviv model 62ADS CD spectrophotometer</td>
			<td>Aviv Biomedical</td>
			<td>N/A</td>
			<td>out of market and upgraded to a new model 
			http://www.avivbiomedical.com/circular.php</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-3000 imaging system</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>N/A</td>
			<td>discontinued and replaced 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wallac 1420 (Victor2) multilabel counter</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td>1420-018</td>
			<td>for chemiluminescence detection 
			http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

one-step negative chromatographic purification of helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in escherichia coli in batch mode

헬리코박터 파이로리 호중구 - 활성화 단백질 (HP-NAP)은 헬리코박터 파이로리 (H. 파이로리)의 주요 독성 요소이다. 또한 H.에 중요한 역할을 파이로리는 호중구, 단핵구 및 비만 세포를 포함한 여러 선천성 백혈구 활성화에 의해 유도 된 위장 염증. HP-NAP의 면역 원성 및 면역 속성은 H.에 대한 잠재적 인 진단 및 백신 후보 확인 유문 및 암 치료 용 신약 후보. 임상 적 용도에 사용 그래피 HP-NAP 상당량을 얻기 위해서 효율적인 방법은 높은 수율과 순도의 단백질이 확립되어야 정제한다. 이러한 프로토콜에서는, 디 에틸 아미노 에틸 (DEAE) 이온 교환 수지를 이용하여 대장균 (E. 콜라이)에서 과발현 재조합 HP-NAP의 일 단계 제외 크로마토 그래피 정제 방법을 기술 하였다 (예., 세파 덱스)를 난n 개의 배치 모드. 재조합 HP-NAP는 E. 총 단백질의 약 70 %를 구성한다 대장균과 거의 완전히 pH를 9.0에서 세포 용해시의 가용성 분획에서 회수된다. pH가 8.0에서 최적의 조건에서, HP-NAP의 대부분은 언 바운드 분획에서 회수되는 반면, E.에서 내인성 단백질 대장균 효율적으로 수지에 의해 제거된다. DEAE 이온 교환 수지와 네거티브 모드 배치 크로마토 그래피를 사용하여이 정제 방법은 E.에서 기능적 HP-NAP를 얻을 높은 수율 및 순도의 기본 형태로 대장균. 정제 된 HP-NAP는 더욱 예방, 치료에 활용하고, H.의 예후 수 파일로리 질병뿐만 아니라 암 치료 -associated.

재조합 HP-NAP의 부정적인 정제의 실험 절차의 개략도는 E. 표현 배치 모드에서 DEAE 이온 교환 수지를 사용하여 대장균은도 1에 도시된다. 이러한 정제 기술은 숙주 세포 단백질 및 / 또는 수지 HP-NAP 이외의 불순물의 결합에 기초한다. pH가 8.0에서 네이티브 형태의 HP-NAP를 제외하고 거의 다른 단백질이 결합되지 않은 부분 (그림 2A와 <stro...

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One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

재조합 헬리코박터의 원스텝 제외 정제 고 수율 방법에 대하여 설명한다 배치 모드에서 디 에틸 아미노 에틸 수지를 이용하여 대장균에서 과발현 호중구 - 활성화 단백질 (HP-NAP) 파이로리. 이 방법에 의해 정제 HP-NAP는 H. 백신, 약물, 또는 진단의 발전을 위해 도움이됩니다 파이로리는 질병을 -associated.

한 단계의 부정적인 크로마토 그래피 정제<em&gt; 헬리코박터 파이로리</em&gt; 호중구 - 활성화 단백질 과발현<em&gt; 대장균</em&gt; 배치 모드에서

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

one-step-negative-chromatographic-purification-helicobacter-pylori

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

9.6K 조회수.  National Tsing Hua University.  재조합 헬리코박터의 원스텝 제외 정제 고 수율 방법에 대하여 설명한다 배치 모드에서 디 에틸 아미노 에틸 수지를 이용하여 대장균에서 과발현 호중구 - 활성화 단백질 (HP-NAP) 파이로리. 이 방법에 의해 정제 HP-NAP는 H. 백신, 약물, 또는 진단의 발전을 위해 도움이됩니다 파이로리는 질병을 -associated. 

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Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

MALDI-TOF 질량 분석기를 사용하여 혈액 배양액에서 그람 음성 박테리아의 빠른 확인

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

연구

면역학 및 감염병학

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

Neuropathogenic의 비 침습 모델<em&gt; 대장균</em&gt; 신생아 쥐에 감염

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide3. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the &#8220;pilus&#8221;5. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

고해상도 전자 현미경<em&gt; 헬리코박터 파이로리</em철 가용성의 다양한 조건에서 생산&gt; CAG 유형 IV 분비 시스템 필리

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

생물 발광 시스템 비-침략 적 비보에 의해 Murine 호스트에서 Enterohemorrhagic 대장균 식민지의 검출

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

밀도 Transposon 삽입 라이브러리를 사용 하 여 세균성 활용 Enterobacterial 종자와 같은 대장균 또는 Shigella flexneri 의 창조

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

인간의 과발현과 정제<em&gt; 시스</em&gt; - 프레 닐 트랜스퍼 라제<em&gt; 대장균</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. Among them, reversible lysine acetylation is one of the most widely distributed in all domains of life. Although numerous mass spectrometry-based acetylome studies have been performed, further characterization of these putative acetylation targets has been limited. One possible reason is that it is difficult to generate purely acetylated proteins at desired positions by most classic biochemical approaches. To overcome this challenge, the genetic code expansion technique has been applied to use the pair of an engineered pyrrolysyl-tRNA synthetase variant, and its cognate tRNA from Methanosarcinaceae species, to direct the cotranslational incorporation of acetyllysine at the specific site in the protein of interest. After first application in the study of histone acetylation, this approach has facilitated acetylation studies on a variety of proteins. In this work, we demonstrated a facile protocol to produce site-specifically acetylated proteins by using the model bacterium Escherichia coli as the host. Malate dehydrogenase was used as a demonstration example in this work.

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Genetic code expansion serves as a powerful tool to study a wide range of biological processes, including protein acetylation. Here we demonstrate a facile protocol to exploit this technique for generating homogeneously acetylated proteins at specific sites in Escherichia coli cells.

Site-Specifically 생성 하는 손쉬운 프로토콜 Acetylated 대장균 에서 단백질

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research is deciphering how these dynamic protein complexes act to integrate signals from multiple sources in order to direct a specific biological response, and how this becomes deregulated in many disease settings. Despite the importance of this key biochemical mechanism, there is a lack of experimental techniques that can facilitate the specific and sensitive deconvolution of these multi-molecular signaling complexes.
Here this shortcoming is addressed through the combination of a protein complementation assay with a conformation-specific nanobody, which we have termed Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel technique facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any pair of interacting proteins, to the exclusion of un-complexed individual proteins and complexes formed with competing binding partners. 
The BiCAP technique is adaptable to a wide array of downstream experimental assays, and the high degree of specificity afforded by this technique allows more nuanced investigations into the mechanics of protein complex assembly than is currently possible using standard affinity purification techniques.

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

This manuscript describes the protocol for Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel method facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any two interacting proteins, while excluding un-complexed individual proteins as well as complexes formed with competing binding partners.

해 다중 단백질 신호 복합물 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 의해

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a pET-SUMO-EGFP vector (SUMO = small ubiquitin-like modifier) and expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressing E. coli is coincubated with macrophages for 1 h at 37 &#176;C; the negative control group is incubated on ice for the same amount of time. Then, the macrophages are ready for assessment. The advantages of this technique include its simple and straightforward steps, and phagocytosis can be measured by both flow cytometer and fluorescence microscope. The EGFP-expressing E. coli are stable and display a strong fluorescence signal even after the macrophages are fixed with paraformaldehyde. This method is not only suitable for the assessment of macrophage cell lines or primary macrophages in vitro but also suitable for the evaluation of granulocyte and monocyte phagocytosis in peripheral blood mononuclear cells. The results show that the phagocytic capability of peritoneal macrophages from young (eight-week-old) mice is higher than that of macrophages from aged (16-month-old) mice. In summary, this method measures macrophage phagocytosis and is suitable for studying the innate immune system function.

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Here, we present a protocol to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis using enhanced green fluorescence protein-expressing Escherichia coli.

녹색 형광 단백질 표현 하는 향상 된 사용 하 여 대장균 마우스 복 막 대 식 세포 식 균 작용을 평가 하기 위해

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has been disrupted. Loss of function following gene disruption is subsequently restored by exogenous addition of the product of the disrupted gene. This helps to determine the function of the gene. A method previously described involves generating a gtfC gene-disrupted Streptococcus mutans strain. Here, an undemanding method is described for purifying the gtfC gene product from the newly generated S. mutans strain following the gene disruption. It involves the addition of a polyhistidine-coding sequence at the 3&#8242; end of the gene of interest, which allows simple purification of the gene product using immobilized metal affinity chromatography. No enzymatic reactions other than PCR are required for the genetic modification in this method. The restoration of the gene product by exogenous addition after gene disruption is an efficient method for determining gene function, which may also be adapted to different species.

Purification of a High Molecular Mass Protein in Streptococcus mutans

Described here is a simple method for the purification of a gene product in Streptococcus mutans. This technique may be advantageous in the purification of proteins, especially membrane proteins and high molecular mass proteins, and can be used with various other bacterial species.

연쇄상 구균 뮤탄에서 높은 분자 질량 단백질의 정화

Elucidation of a gene&#39;s function typically involves comparison of phenotypic traits of wild-type strains and strains in which the gene of interest has ...

한 단계의 부정적인 크로마토 그래피 정제

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