당사의 프로토콜은 수성 산소가 오염물질인 모든 솔루션에서 사용할 수 있는 검출 가능한 뉴클레아제로부터 자유로운 고활성 PCD를 산출합니다. 우리가 사용하는 기술은 복제하기 쉽고 제품에 핵 오염 물질이 존재하지 않도록합니다. 시작하려면, pVP91A-pcaHG PCD 발현 플라스미드의 마이크로리터 1개와 시판되는 E.coli BL21의 마이크로리터 20개를 튜브에 결합한다.
튜브를 플릭하여 섞어 5분 동안 얼음 위에 놓습니다. 변형 반응을 계속하려면 튜브를 섭씨 42도에서 30초 동안 수조에 넣고 2분간 얼음 위에 놓습니다. SOC 미디어의 80 마이크로리터를 추가하고 1시간 동안 225rpm및 섭씨 37도에서 흔들어 줍니다.
다음으로, 변형 반응 혼합물을 LB-암피실린 한천에 붓고 플레이트 스프레더를 사용하여 혼합물을 퍼뜨리게 한다. 뚜껑으로 접시를 덮고 접시를 섭씨 37도에서 16~18시간 동안 배양합니다. 그 후, 접시에서 하나의 식민지를 선택하고, 250 밀리리터 에를렌 마이어 플라스크에서 LB-암피실린의 50 마이크로 리터에 접종.
플라스크를 225rpm에 셰이커에 놓고 섭씨 37도에서 16~18시간 동안 배양합니다. 그런 다음, 배양 된 배양 문화의 20 밀리리터를 LB-암피실린 1 리터로 채워진 4 리터 플라스크로 옮김합니다. 섭씨 37도에서 225rpm에서 흔들어주세요.
매 시간마다, 광미터에 600 나노미터에서 광학 밀도를 측정하기 위해 큐벳에 배양의 1 밀리리터를 그립니다. 배양 광학 밀도가 0.5에 가까워지면 OD600이 0.5에 도달할 때까지 측정 빈도를 15분간격으로 늘립니다. 그런 다음 4리터 플라스크를 얼음 쓰레기통으로 옮습니다.
배양 온도를 줄이기 위해 얼음 욕조에서 플라스크를 소용돌이. 4리터 플라스크를 섭씨 17도, 180rpm의 인큐베이터로 옮는다. 20분마다 OD600을 계속 모니터링합니다.
0.7 OD600에서 IPTG와 암모늄 철 황산 육각형 재고 용액을 추가하여 리터당 0.5 밀리머와 10 밀리그램의 최종 농도에 도달합니다. 18시간 동안 180rpm, 섭씨 17도에서 문화를 흔들어 보시면 됩니다. 인큐베이션 후, 2 분 동안 얼음에 문화 플라스크를 배치합니다.
SDS-PAGE 분석을 위한 1.5 밀리리터 폴리프로필렌 미세원심분리기 튜브에서 유도된 세포의 1밀리리터를 수확한다. 다음으로, 원심분리를 위해 각 병에 세균 문화를 붓습니다. 펠릿은 섭씨 4도, 20분 동안 000배의 문화를 자랑합니다.
초월자를 데칭. 파이펫은 각각 12.5 밀리리터의 차가운 PBS로 펠릿을 재일시 중단하고, 50밀리리터 원추형 튜브에 두 개의 재서스펜션을 결합합니다. 이전과 같이 세포를 다시 펠렛.
그런 다음, 슈퍼네티를 버리고 파이펫을 사용하여 각 튜브에 10 밀리리터의 용해 버퍼를 추가하여 세포를 다시 일시 중지합니다. 유도 된 세포로 튜브를 초음파 처리 한 후, 미리 차가운 폴리 카보네이트 병에 세균용 용액을 부어. 원심분리기는 120, 000배, 섭씨 4도에서 60분 동안, 차가운 50밀리리터 원추형 튜브에 상류체를 붓습니다.
니켈 충전 수지 컬럼으로 FPLC 계측기를 준비한 후 샘플을 분당 0.15 밀리리터로 컬럼에 로드합니다. 20 밀리머 이미다졸에서 니켈 버퍼 20 밀리리터로 컬럼을 세척합니다. 분석을 위해 50 밀리리터 튜브에 세척을 유지합니다.
다음으로 125밀리알이미다졸에서 니켈 완충제 15밀리리터로 컬럼을 세척합니다. 각각 0.8 밀리리터의 19분수에서 용출을 수집합니다. 100% 니켈 완충B의 15 밀리리터로 컬럼을 다시 세척하고 각각 0.2 밀리리터의 75분수를 추가로 수집합니다.
PCD의 존재를 확인하기 위해 12% SDS-PAGE 젤에 수집된 분획의 분석을 계속합니다. 먼저, 1.5밀리리터 폴리프로필렌 미세원심분리기 튜브에 35마이크로리터의 반응 버퍼를 추가합니다. 튜브에서 피크 크로마토그래피 분획의 5개의 마이크로리터와 3킬로베이스 쌍의 500 나노그램을 슈퍼코이드 플라스미드 pXba를 결합합니다.
튜브를 수조에 37°C의 수조에 1시간 동안 놓습니다. 원고에 따라 아가로즈 젤을 준비한 후 각 반응의 마이크로리터30마이크로리터를 젤의 우물에 넣습니다. 약 1시간 동안 주변 온도에서 10볼트퍼센트의 전기전도.
이제 오렌지 G 염료가 젤 끝에 도달했습니다. 즉시 형광 스캐너를 사용하여 젤의 에티듐 브로마이드 신호를 이미지화합니다. 강도 및 이미지 픽셀 크기의 기능을 통해 초응, 선형 및 닉 원과 같은 다양한 DNA 종의 픽셀 볼륨을 결정합니다.
각 DNA 종의 백분율을 결정하기 위해 단일 DNA 종의 픽셀 볼륨을 모든 개별 종에 대한 총 픽셀 부피로 나눕니다. SDS-PAGE 분석은 두 번째 용출 피크가 거의 순수한 PCD 이종수와 검출할 수 없는 핵활성을 나타내는 최소한의 단백질 오염을 포함하고 있는 것을 보여줍니다. 따라서, 추가 분석을 위해 두 번째 PCD 용출으로부터 이러한 10분수를 5밀리리터 원내 튜브에 결합한다.
PCD의 크기 배제 크로마토그래피 정제 후, 4도 섭씨 차가운 방에서 염화나트륨, 트리스 염화나트륨, 염화 마그네슘, 디티오스레이톨, PCA 및 슈퍼코일래플라스미드 pXba의 적당한 부피인 미세센트심분리기 튜브에 결합하여 5배 의 스톡을 만듭니다. 96웰의 평평한 바닥 플레이트를 얼음 위에 놓고 결합된 5X 용액의 10마이크로리터를 우물로 옮습니다. 분석 직전에 개별 PCD SEC 분획의 각 웰 10 마이크로리터에 추가합니다.
플레이트 판독기를 섭씨 37도의 내부 온도로 설정하고 96웰 플레이트를 플레이트 홀더로 옮길 수 있습니다. 플레이트 홀더를 기기로 철회하고 1시간 동안 20초 간격으로 290나노미터에서 흡광도를 측정합니다. 각 읽기 전에 5초 전에 접시를 흔들도록 악기를 설정합니다.
1시간 후 각 웰에 10마이크로리터의 스톱 솔루션을 추가하여 반응을 종료합니다. PCD SEC 분획에 대한 젤 전기 전도를 수행합니다. 가장 많은 PCA 산화 활성을 가진 분획을 선택하며, 흡수도 감소및 관찰된 핵물질 오염으로 표시되지 않음을 나타냅니다.
흡광도 280 나노미터에서 흡광도를 측정하고, 흡수도 및 소멸 계수를 기준으로 총 PCD 농도를 계산한다. 장기 저장을 위해 선택한 분획을 영하 80도에 저장합니다. 본 실험에서, 헥사히스티딘의 이종성 PCD, pcaH 및 pcaG 태그의 재조합 PCD가 대장균으로 발현된 것으로 밝혀졌다.
이종수는 니켈 친화성 크로마토그래피에 의해 처음으로 정제되었다. 흡광도는 파란색으로 표시되고 니켈 버퍼 B의 백분율 농도가 빨간색으로 표시됩니다. 플로우스루는 니켈 수지에 결합하지 않은 용해성 세균 단백질을 나타낸다.
일부 PCD는 125 밀리머 이미다졸의 존재에서 출례, 하지만 단백질의 대부분은 250 밀리머 imidazole에 출동. 대표적인 SDS-PAGE 분석은 용출 단계의 분획이 오염물질이 없는 것을 나타냅니다. 핵분석의 아가로즈 젤은 단백질을 첨가하지 않고 부정적인 대조군과 비교하여 오염을 드러내며 DNA 핵으로 오염된 양성 대조군을 나타낸다.
아가로즈 겔 뉴클레아제 분석에서 관찰된 다양한 DNA 종의 양은 29내지 38까지의 분획이 거의 없는 핵활성을 보였으며, 이는 SEC에 의해 결합, 농축 및 추가 정제하도록 선택되었다. 이 절차에 따라 정제 된 PCD를 원하는 산소 청소 시스템에서 사용하고 최적화 할 수 있습니다.
이렇게 하면 시스템에 필요한 정확한 PCD 양이 결정됩니다. 이 기술은 데이터 수집의 더 긴 기간 동안 허용한 단 하나 분자 현미경 실험에 있는 불소 로포어 수명을 연장하기 위하여 이용되었습니다. 사용되는 초원심분리기는 위험합니다.
원심분리기는 회전하기 전에 제대로 균형을 이루지 않도록 하십시오. 에티듐 브로마이드는 위험한 시약입니다. 개인 보호 장비를 착용하여 접촉을 피하고 적절하게 폐기하십시오.
